citocromo actividades reductasa citocromo c oxidasa NADH y se analizaron bioquímicamente en hiops gingiv.il & gt; muestras obtenidas de 22 pacientes varones (23-72 años de edad) que reciben tratamiento periodontal. Histológicamente. 13 muestras mostraron inflamación leve, mientras que 9 mostraron respuestas inflamatorias más graves. actividad de la oxidasa del citocromo fue significativamente mayor en el ligeramente inflamado que en las muestras de tejido marcadamente inflamadas. NADH citocromo c reductasa actividad por otra parte no se alteró significativamente por el aumento del grado de la inflamación. La posible implicación de los efectos de la inflamación en las enzimas oxidativas se discute en relación con degenerativas y cambios proliferativos que ocurren en ambos tipos de tejido.
Introducción
El citocromo oxidasa (E.C1.9.3.1 .) y NADH reductasa citocromo C (ECI, 6. 2. I.) se determinaron en encía humana esencialmente normal (Eichel & amp; Sharhrik 1964), sin embargo, estos parámetros no se han analizado anteriormente en relación con los efectos impuestas por la inflamación gingival. estudios de respiración endógena revelaron que el qoj se estimula en la inflamación gingival leve, y deprimido en encía muy inflamados (Glickman et al 1949, Manhold & amp;. Volpe 196,1). En los estudios recientes polarographie otra mano (Zajieck & amp; Kindlova 1972) revelaron que QO_ inicial. los valores permanecieron constantes en encía humana y no se alteró significativamente por el grado de inflamación. A la luz de estos puntos de vista divergentes, deseamos informar sobre el efecto de la inflamación en las actividades de la reductasa citocromo oxidasa y NADH citocromo c en homogeneizados totales de encía humana.
Métodos y materiales
Preparación del tejido
se obtuvieron muestras de biopsias gingivales humanos irom 22 pacientes varones (edad 23-72), en tratamiento periodontal. anestesia de bloqueo regional fue utilizada para evitar la infiltración del tejido. El tejido se extirpa quirúrgicamente y se corta en dos porciones cada uno de los cuales se preparan para su estudio histológico. El otro se lavó en tampón frío de fosfato 0,075 M pH 7,0. para eliminar la sangre se adhiera rápidamente y se congelaron a - 70 y grado; C en hielo seco. El vaivén /es se analizaron muestras gingivales por su actividad enzimática dentro de un día después de su retirada. homogeneizados gingivales se prepararon por una modificación de los métodos (Hoober & amp; Bernstein 1966) utilizados tor la homogeneización de la piel de rata. El tejido gingival congelado (25 -5U mg de peso húmedo.) Se sumergió en N líquido, (-270'C) durante 3 minutos, y se pulverizó para pequeños fragmentos granulares. Los fragmentos gingivales se homogeneizaron en tampón frío en homogeneizadores de vidrio esmerilado Ten Broeck, que fueron molidos para encajar con una tolerancia liquidación o ((1,1 a 0,15 mm. Las actividades enzimáticas se determinaron inmediatamente después de la homogeneización del tejido.
Análisis de la enzima
el citocromo oxidasa (CE 1. 9. 3. 1.) (Wainio et al., 1951) se determinó por espectrofotometría hy después de la oxidación de ditionito de reducción del citocromo c * en I al 25, y el grado; C en un espectrofotómetro Gilford 2400 Modelo. en experimentos nil la velocidad de auto-oxidación de lerrocytoehrome C antes de la adición de la enzima fue insignificante. el E.VHI "", los valores de absorbancia para la solución de homogeneizado fueron en su mayor parte insignificante (0,0% en 16 muestras), y en caso de detectarse que oscilaron entre 0, (12 a 13,0. '; del valor enzimática el valor medio de sedimentación era 2,5 y plusmn; 0.9. ci para las 22 muestras que fueron analizadas de sedimentación valores se determinaron por re-reducción de la reacción medios de comunicación con un exceso de ditionito, resuspendiendo el homogeneizado en el medio de reacción, y siguiendo el cambio en la absorbancia óptica a tiempo Ejaonni VS-gráficamente. Los valores de sedimentación se resta del valor de absorbancia total observada obtenida en los ensayos de enzimas afectadas, y las actividades específicas se determinaron a partir de los valores corregidos. La mezcla de reacción contenía: 75 mM KH..PO | -Na, .HPO4 tampón de pH 6,75. 5,6 uM citocromo c y (25-150) proteína plantilla (homogenale) en un volumen final de 300 u. la concentración de citocromo c se determinó a partir del coeficiente de extinción milimolar del citocromo c H - ,, -,;, t] odos = 18,5 mm cm '' para la reducción cvtoehrome menos oxidado c
NADH citocromo c reductasa.. NADH citocromo c reductasa (E. C. 1. 6. 2. 1.) (Jeng et al. 1968) se determinó siguiendo la reducción de citocromo c en Er ,, Tnm a 25'C. El coeficiente de extinción milimolar utilizado para citocromo c en el ensayo de citocromo oxidasa se utilizó para este ensayo. El sistema de ensayo contenía: 33 mM KHiPOi-NaoHPO, pH 7.75 buffer, S.2 FTM citocromo c, 3.0mm KCN, 85 /LIM NADH ** y (25-150) ^ g de proteínas (homogeneizado) en el volumen final de.. 300 II.
actividades específicas
Las actividades específicas se expresan como nanomoies de citocromo c oxidado (citocromo oxidasa) o reducido (NADH citocromo c reductasa) por mg de proteína por minuto.
proteína Determinación
los homogenizados de tejido (10-20 /a) se digirieron en NaOH 0,05 N (concentración final) durante una hora a 25 y el grado; C, y se analizaron para la proteína por el método de Lowry et al .. ( 1951). albúmina cristalina *** fue utilizado como un estándar.
Estadísticas
La media, la desviación estándar y el error estándar se determinaron para cada grupo. Valores superiores a los límites y plusmn; 1,96 SD fueron descartados. La diferencia entre cada grupo se analizó mediante la prueba "t de Student" y todos los valores de p. pulverización de la (emisión, descongelación y posterior homogeneización parece interrumpir adecuadamente las células. La evidencia de esta interpretación reside en la observación de que la distribución de NADH citocromo c reductasa tanto en encía ligeramente inflamado y marcadamente inflamado no varió significativamente. Si la disminución de citocromo oxidasa fue influenciado por nuestras técnicas de preparación de tejidos, resultados similares se deben observar en las NADH citocromo distribuciones c reductasa. se encontró que la cantidad de sedimentación en nuestro sistema de ensayo que sea insignificante en su mayor parte y no podía dar cuenta de la marcada disminución de las la actividad del citocromo oxidasa observados en la encía inflamada notablemente.
La elevada actividad oxidasa cylochiomc observada en nuestro estudio coincide con las observaciones hechas por Manhold y Volpj (1963) en sus estudios QCK respiración endógena de encía humana ligeramente inflamada y proliferando. El aumento de la calidad de vida & gt; y citocromo oxidasa en encía pueden reflejar aumento de la síntesis mitocondrial de bonos de alta energía (ATP), que se requiere para sostener los procesos altamente synthelic asociados con la síntesis de ADN, mitosis, así como la proliferación celular. Otra prueba de las mayores necesidades bioencrgelic en la pre-proliferante y etapas de desarrollo de las células proliferativas es la observación de que el aumento de la calidad de vida. (Respiración endógena) (Glickman et al. 1949), y citocromo oxidasa (Fine 197 (1) alcanza picos de actividad en un momento en que los principales aumentos en el índice mitolic y proliferación (epitheiialization) se producen en la regeneración de la encía y de la piel heridas. Por por otra parte IHE fuerte disminución de la citocromo oxidasa y endógena QOO observa en marcadamente inflama (Manhold & amp;. Volpe 1963, Giickman et al 1949) gtngiva parece ser reflejo de los cambios que ocurren dentro de las mitocondrias, así como otros componentes subcelulares durante la destrucción del tejido gingival significativa . no se pudo delect un aumento de la citocromo oxidasa en encía notablemente inflamado y la proliferación. aunque los aumentos en el QO endógeno. se detectó por Giickman et al. (1949) en este tipo de patología gingival. Sin embargo, es Lhal concebible como inflamación subsidios, una fase preproliferativa (fase S de la mitosis) se produce dentro de las células que migran en el borde de la herida que requiere una mayor síntesis de ATP. Posteriormente un aumento en la calidad de vida endógeno. también se observa. Nuestros datos citocromo oxidasa, y los datos reportados para la respiración endógena qoj no coinciden con la QO polarográfico. observaciones formuladas por Zajieek y Kindlova (1972), quienes reportaron el tailandés inicial QO_ & gt; los valores se mantuvieron constantes en la encía humana, y no se alteró significativamente por el grado de inflamación.
NADH citocromo c reductasa actividad no se alteró significativamente por el grado de inflamación en la encía humana. Nuestros datos para encía humana paralelas la observación hecha por Eichel y Shahrik (1964), para la encía no inflamado humano. NADH cylochrome c reductasa actividad se encontró que era significativamente mayor que cytohrome oxidasa en nuestros estudios que se correlaciona con la observación hecha por Eiehcl y Shahrik