Abstract
Antecedentes
metaloproteinasas de la matriz (MMPs) degradar la matriz extracelular (ECM) y regular la remodelación y la regeneración de hueso. derivado de la matriz de proteína del esmalte (DME) se ha utilizado clínicamente para la regeneración periodontal, aunque sus mecanismos moleculares no están claras. Se evaluó la función de las metaloproteinasas de matriz (MMPs) en la regulación de la degradación de EMD-dependiente de la gelatina en la línea celular oeoblast-como MG63.
Métodos
células MG-63 (línea celular de osteoblastos) se incubaron con 100 mg /ml EMD proteína en presencia o ausencia de tejido inhibidor MMP-2 durante 20 h seguido de incubación en placas de DQ-recubiertos de gelatina durante 4 h. MG-63 células (1 × 10
6) se preincubaron con SB203580 durante 30 min a 37 ° C y luego se colocaron en 100 mg /ml de proteínas EMD para 24 h. Se recogieron los medios condicionados y se detectaron por análisis de transferencia Western.
Resultados
proteína EMD mejorada degradación mediada por células de la gelatina, que fue inhibida por el inhibidor de MMP TIMP-2. Además, MMP-2 fue producido por las células MG63 en respuesta a la proteína de EMD de una manera MAPK dependiente de P38. Además, el bloqueo de la activación de p38 MAPK por SB203580 inhibía significativamente la generación de la forma activa de MMP-2.
Conclusión
vía de p38 MAPK promueve la expresión de MMP-2 en EMD activa los osteoblastos, que a su vez estimula la regeneración periodontal degradando proteínas de la matriz. en el tejido conectivo periodontal
material complementario Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-85) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Antecedentes
dos objetivos principales de la terapia periodontal se están regenerando el ligamento periodontal (PDL) y la reconstrucción del hueso alveolar perdido como resultado de la enfermedad periodontal. modelos experimentales anteriores y los estudios clínicos han demostrado que la proteína (EMD) la matriz del esmalte derivado promueve la generación de PDL, cemento de la raíz y el hueso alveolar [1-3]. proteínas EMD también activa las células osteoblastos in vitro, lo que lleva a una respuesta de cicatrización de heridas [4] y la generación de la fosfatasa alcalina [5]. Además, la proteína EMD regula la producción de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y los inhibidores tisulares de MMPs (TIMPs) en el fluido crevicular gingival [6, 7].
Hueso se remodela de forma continua, y la cantidad de hueso nuevo depende del equilibrio entre la formación ósea y la resorción, que están mediadas por los osteoblastos, osteoclastos y osteocitos. matriz extracelular perturbado (ECM) el volumen de negocios lleva a la pérdida de masa ósea y sus enfermedades asociadas, como la periodontitis. Los osteoblastos son células de remodelación ósea que diferencian a partir de células madre mesenquimales y secretan proteínas ECM, que es posteriormente mineralizada por los osteoblastos. MMP son endopeptidasas zinc átomo dependiente que juegan un papel principal en la degradación de proteínas ECM [8]. Los osteoblastos y osteocitos también producen MMP tales como MMP-2 y MMP-13 [7, 9]. La función de MMP-2 es degradar proteínas ECM y promover la remodelación y la regeneración de tejido óseo [10].
Proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPKs) son importantes enzimas de transducción de señales implicados en la regulación celular. Estudios recientes utilizando un mitogen-activated proteína quinasa (p38 MAPK) p38 inhibidor demostraron que la estimulación de citoquinas de la síntesis de MMP-2 está implicada en la señalización MAPK p38 [11, 12].
El propósito de este estudio fue la de aclarar los efectos de proteínas EMD en la producción y activación de MMP-2 utilizando una línea celular similar a osteoblastos, es decir, MG-63. Hemos encontrado que la proteína de EMD promueve la degradación de la gelatina en las células MG-63 y aumentó la activación de MMP-2 en células MG-63. La proteína EMD vías de señalización depende de MAPK p38. Estos resultados sugieren que la regulación selectiva de MMP-2 y la posterior activación de MMP-2 por las proteínas EMD en las células MG-63 conduce a la remodelación y regeneración de tejido conectivo periodontal.
Métodos Línea celular
Los osteoblastos ( MG-63 línea celular; American Type Culture Collection, Rockville, MA) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con inactivado por calor 10% de FBS (Equitech-Bio Inc., TX, EE.UU.), glutamina 2 mM y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 en el aire.
DQ ensayo de degradación de la gelatina
cubreobjetos se recubre con 100 g /ml sustrato de fluorescencia se extinguió DQ-gelatina (Molecular Probes, Eugene, OR). MG-63 células fueron incubadas con /ml de proteínas EMD 100 g (Seikagaku Kogyo-Corp., Osaka, Japón) en presencia o ausencia de inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 (TIMP-2; Dainippon Pharm Co., Toyama, Japón) durante 20 h, seguido por incubación en placas de DQ-recubiertos de gelatina por un período de 4 h. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2% en PBS. Los portaobjetos se montaron con cubreobjetos utilizando glicerol /PBS, y se examina con al 488 nm (excitación) y 533 nm (emisión) usando un Olympus LSM-GB200 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con una lente de inmersión en aceite. Diferencial de contraste de interferencia (DIC) se utilizó para visualizar las células cultivadas en la matriz.
Análisis de transferencia de Western
MG-63 (1 x 10 6) se preincubaron las células con 100 ng /ml 5 SB203580 M (Productos Químicos Inc., Darmstadt, Alemania) durante 30 min a 37 ° C, y MG-63 células se colocaron entonces en DMEM libre de suero con la proteína de 100 mg /ml EMD para 48 h. Se recogieron los medios condicionados, se centrifuga para eliminar los residuos, y se concentraron en concentradores Amicon Centriprep (Invitrogen) hasta 10 veces. Las células se incubaron en medio de Eagle exento de suero y de proteína /ml EMD 100 g para 48 h. MG-63 células preparadas como se describe anteriormente se lisaron con tampón de muestra de SDS (80 mM Tris-HCl, 3% de SDS, 15% de glicerol y 0,01% de azul de bromofenol) y se sonicó brevemente con el fin de cizallar el ADN. Las muestras se separaron en 10% de geles de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a difluoruro de polivinilideno (PVDF, Immobilon-P) membranas (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO). Las membranas se incubaron durante 1 h con anti-fosfo-p38 anticuerpo (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) o anticuerpo anti-p38 (Cell Signaling Technology) en PBS que contenía 0,05% de Tween-20 y 10% Blockace (Dainippon Pharm Co., Toyama, Japón). Se utilizó conjugado con peroxidasa de anticuerpo secundario (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a una dilución 1: 1000 y las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando Super Señal West Pico sustrato quimioluminiscente (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Las señales de cada membrana se analizaron por VersaDoc 5000.
inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
ARN total fue aislado de células MG-63 células por RNeasy kit (QIAGEN, Valencia, CA). células MG-63 se colocaron entonces en DMEM libre de suero con la proteína /ml EMD 100 g para 12 h. Después de la desnaturalización del ARN total a 70 ° C durante 10 min, se sintetizó ADNc con el cebador oligo-dT por incubación con transcriptasa inversa (Qiagen) a 50 ° C durante 30 min. Los cebadores para la MMP-2 fueron 5'-TGGTTTTCCTCCATCCAGTGG-3 '(hacia delante) y 5'-CAGGTTGTCTGAAGTCACTGC-3' (hacia atrás). Los cebadores para GAPDH fueron 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 '(hacia delante) y 5'-TCC ACC ACC TTG CTG CTG TA-3' (hacia atrás). reacciones en cadena de la polimerasa se llevaron a cabo con Pfu polimerasa (Qiagen) iniciado por 1 ciclo a 95 ° C durante 15 min seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 45 seg, 55 ° C durante 45 seg, 72 ° C durante 1 min y 1 ciclo a 72 ° C durante 10 min para la extensión final. Los productos de PCR se cargaron a agarosa gel, y se tiñeron con bromuro de etidio. Las bandas fueron analizados utilizando el software AlphaImager ™ IS-3400. Brevemente, IDV se midió como la suma de todos los valores de píxel después de la corrección de fondo en cada banda. Los valores (AVG) de cada banda se calcularon como IND /ÁREA, donde AREA es el tamaño de la región que se midió. Los resultados se muestran los valores de AVG MMP1 /AVG GAPDH en cada momento.
Resultados
estimulados con proteínas EMD células MG-63 promueven la degradación de la gelatina
Con el fin de determinar si proteínas EMD es capaz de facilitar la degradación de la gelatina de osteoblastos mediada por osteoblastos humanos se incubaron en presencia o ausencia de 100 mg /ml de proteínas EMD y se sembraron en placas de 100 mg /ml DQ-recubiertos de gelatina como se describe en los Métodos
( Figura 1). La degradación de DQ-gelatina se visualizó en la sección óptica como una señal fluorescente verde. Aunque las células no estimuladas MG-63 no produjo señales visibles (paneles A y C en la figura 1), proteína EMD mejora de forma significativa la degradación de gelatina (paneles D y F en la figura 1). Debido a que la gelatina es un sustrato para la MMP, es posible que TIMP-2 podría inhibir la degradación mediada por células de gelatina. Para probar esta hipótesis, recombinante TIMP-2 se incubó con EMD y células MG-63 y después se cultivaron en DQ-gelatina. TIMP-2 casi por completo la degradación eliminados por EMD estimularon-MG-63 células (paneles G y I en la Figura 1), lo que indica que la degradación de la gelatina está mediada por la actividad catalítica de MMP, que es un paso clave en la promoción de la periodontal conectivo la remodelación de tejidos. Figura 1 proteína EMD mejora MG-63 células degradación de gelatina. células MG-63 se incubaron en presencia (D, E, F) o ausencia (A, B, C) de 100 mg /ml EMD durante 20 h, y luego se incubaron sobre el vidrio revestido con sustrato fluorescente 100 mg /ml se inactivó DQ-gelatina para 4 h adicionales. TIMP-2 (20 mM) se incubó con proteínas EMD y células MG-63 como se describió anteriormente (G, H, I). La degradación de gelatina (fluorescencia verde) se detectó mediante un microscopio confocal (Excitación: 488 nm; Emisión: 530 nm). Las imágenes se obtuvieron en × 40 magnificación (A a I). Contraste diferencial de interferencia (DIC) se muestran las imágenes. La cuantificación de GFP en los paneles A-I se realizó densitométrica usando el software de imagen NIH J. La densidad se representa como media de GFP por célula.
Proteínas EMD mayor actividad de MMP-2 en las células MG-63
Anteriormente puso de manifiesto que la MG-63 células que se producen de forma espontánea MMP-2, pero no MMP-9 [10]. Como se muestra en este estudio, la proteína EMD mejora la degradación de la gelatina en células MG-63 (Figura 1). Por lo tanto, también a prueba si la proteína EMD afectó a la producción de MMP-2 en placas revestidas de gelatina /ml 100 g de células MG-63. proteínas EMD (100 g /ml) aumentó la producción de 66-kDa, 68 kDa y 46 kDa MMP-2, que corresponden a las formas pro, intermedios y activos de esta enzima, respectivamente. Es importante destacar que, cuando las células de proteínas activadas EMD se cultivaron en placas revestidas de gelatina, la generación de la forma activa de MMP-2 también se observó (Figura 2A). Estos resultados fueron confirmados por los estudios de RT-PCR para demostrar que el nivel de transcripción de MMP-2 mRNA fue aumentada en presencia de EMD en comparación con las células no MG-63 (Figura 2B). Figura 2 La expresión de MMP-2 a partir de células MG-63 de proteínas estimulada por Merck. (A) MG-63 células fueron incubadas en suero libre de Eagle que contiene proteína de 100 mg /ml EMD durante 24 h y los medios condicionados y los lisados de células totales se prepararon como se describe en Métodos
. medios concentrados fueron separados por 8% de SDS-PAGE, inmunotransferencia con anti-MMP-2 de anticuerpos y se visualizaron con Super Señal West Pico sustrato quimioluminiscente. Los marcadores moleculares (kDa) se muestran en la columna izquierda. La cuantificación de MMP-2 en el panel superior se realizó densitométricamente usando imagen NIH software J. alturas de los picos de cada densidad se representan como porcentaje de la máxima valorl. (B) ARN total fue aislado de MG-63 células cultivadas en presencia de EMD durante 24 h y se sometió a experimentos de RT-PCR utilizando cebadores específicos para MMP-2 (parte superior) o GAPDH (abajo). MAPK
P38 vía está involucrada en proteínas estimulada por la actividad de MMP-2 EMD en células MG-63
estudios anteriores han demostrado que la MAPK p38 regulada producción de MMP-2 inducida por diversas citoquinas [13]. Por lo tanto, es posible que la proteína de EMD también estimula MAP quinasas en las células de osteoblastos para inducir la producción de MMP-2. Para probar esta hipótesis, primero a prueba si la proteína EMD es capaz de activar MAPK p38 mediante análisis de transferencia de Western. Cuando las células MG63 fueron cultivadas en la presencia de la proteína 100 mg /ml de EMD en placas revestidas de gelatina, no se observó la activación de p38 MAPK en una manera dependiente del tiempo, con la fosforilación máxima a 5 min (panel superior en la Figura 3A). cantidad total de proteína p38 MAPK no se vio afectada (panel inferior de la figura 3A). Un inhibidor específico sintético para MAPK p38, SB203580, eliminó la activación de esta quinasa en las células de proteínas EMD estimulada MG-63 (Figura 3B), indicando además la activación de MAPK p38 en células MG-63 en presencia de EMD protein.In para caracterizar adicionalmente el papel de la activación de la vía de p38 MAPK inducida por proteínas EMD, las células MG-63 se pretrataron con SB203580, seguido por la estimulación de proteínas EMD. SB203580 inhibía significativamente la producción y la activación de MMP-2 por la proteína EMD en células MG-63 (Figura 4). la activación de MAPK p38 Figura 3 EMD-inducida en células MG-63. (A) MG-63 células fueron estimuladas con la proteína de 100 mg /ml EMD durante los tiempos indicados en 37 ° C. Las células fueron cosechadas, y los lisados se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-fosfo-p38 MAPK (Top of), y luego fueron despojados y inmunotransferencia con anticuerpo p38 MAPK anti (parte inferior
). Los marcadores moleculares (kDa) se muestran en la columna izquierda. (B) células MG-63 fueron tratados durante 30 min con SB203580 (5 mM) antes de la estimulación con la proteína de 100 mg /ml EMD para 5 min. Las células fueron cosechadas, y los lisados se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfo-p38 MAPK (arriba
), y luego fue despojado y inmunotransferencia con el anticuerpo anti-p38 MAPK (abajo
). Los marcadores moleculares (kDa) se muestran en la columna izquierda. La cuantificación de la fosforilación de p38 MAPK se realizó densitométrica y corregido en contra de la cantidad de proteína total p38 MAPK. alturas de los picos de cada densidad se representan como porcentaje del valor máximo.
Figura 4 Efectos de MEK en la degradación de la gelatina en proteínas EMD estimularon las células MG-63. medios condicionados concentrados preparados a partir de células MG-63 no estimuladas (carril 1
), MG-63 células de proteínas estimulada por Merck (5 M) (carril 2
), EMD de proteínas estimulada por células MG-63 en presencia de DEMSO (carril 3
), EMD proteínas estimulada por la MG-63 células cultivadas en presencia de SB203580 (5 M) (carril 4
) se separaron en 8% SDS-PAGE. Las membranas se borró con anti-MMP-2 de anticuerpos y se visualizaron con Super Señal West Pico sustrato quimioluminiscente. marcadores de peso molecular (kDa) se muestran en la columna izquierda. Los mismos medios condicionados concentrados se separaron y transfirieron a membranas. alturas de los picos para cada densidad se representan como porcentaje del valor máximo. vía
P38 MAPK está implicada en la degradación de la gelatina EMD proteínas estimulada por células MG-63
Finalmente, se confirmaron estos resultados en estudios de degradación de gelatina mediadas por células. MG-63 células se incubaron con la proteína de EMD en presencia o ausencia de SB203580, y se cultivaron a continuación en matriz DQ-gelatina. De acuerdo con resultados de la Figura 1, la proteína de EMD aumentó la degradación de gelatina (paneles D, E, F, en la figura 5), en comparación con no estimuladas células MG-63 (paneles A, B, C en la Figura 5). Cuando SB203580 se co-incubaron con proteínas EMD, se detuvo la degradación de la gelatina, como se demuestra por una disminución significativa en señales fluorescentes específicas (paneles G, H, I en la Figura 5). Estos hallazgos sugieren que la MMP-2 es una enzima que degrada la gelatina importante producido por Merck osteoblastos de proteínas estimulada. Figura 5 p38 MAPK vías son importantes para EMD proteína estimulada MG-63 la degradación mediada por células de gelatina. Glass se recubrió con 100 g /ml de sustrato fluorescente apagado DQ-gelatina. células MG-63 se trataron durante 30 min con U0126 (5 M). Las células se incubaron en presencia o ausencia de la proteína 100 mg /ml EMD para 20 h. se detectó degradación de gelatina (fluorescencia verde) usando un microscopio confocal (Excitación: 488 nm; Emisión: 530 nm). Las imágenes se obtuvieron en × 40 magnificación (A a I). Contraste diferencial de interferencia (DIC) se muestran las imágenes. La densidad se representa como media GFP por célula.
Estos resultados también sugieren que la proteína estimula EMD degradación de la matriz implicada en la actividad catalítica de MMP-2. Por otra parte, nuestro estudio pone de relieve el papel fundamental de las vías de p38 MAP quinasa en la inducción de la producción de MMP-2 de Merck osteoblastos proteínas estimulada.
Discusión
En este estudio, se demostró que la proteína EMD estimula los osteoblastos para degradar la gelatina in vitro y que la producción de MMP-2 es hasta reguladas en respuesta a la estimulación de proteínas EMD. Nuestros resultados también sugieren que la adhesión a la gelatina aumenta la producción de y activa pro-MMP-2, que se produce espontáneamente por los osteoblastos. EMD proteína estimula las vías de señalización de p38 MAPK, que a su vez, inducen la producción de MMP-2 por los osteoblastos. Aunque estudios previos han demostrado que la proteína EMD se aplica a los defectos periodontales se absorbe en la superficie de la dentina de la raíz desnuda e induce la regeneración del tejido periodontal [14-16], los mecanismos de esta acción siguen siendo en gran medida desconocido. En este sentido, nuestros resultados muestran el papel central de MMP-2 producida a partir de osteoblastos en respuesta a la proteína de EMD en la facilitación de la regeneración conectivo periodontal.
MMP-2 juega un papel crucial en la remodelación ósea y la mineralización [17], y varios estudios han evaluado el papel funcional de las MMP específicas [18-20]. Nuestros resultados apoyan además la importancia de las MMP producidas por Merck osteoblastos de proteínas estimulada en la remodelación ósea. Las observaciones de la degradación residual de ECM en presencia de TIMP-2 se pueden explicar por la participación de otras proteasas tales como serina proteasa. De hecho, estudios recientes han demostrado que los osteoblastos expresan serina proteasa superficie [21]. Sin embargo, la inhibición significativa de la degradación de la gelatina por TIMP-2 sugiere que la proteína de EMD aumenta la producción de MMPs en las superficies celulares, lo que facilita gelatinolysis osteoblastos mediada. En el presente estudio, hemos demostrado que la MMP-2 se produce de forma espontánea a partir de osteoblastos no estimuladas, y que la gelatinasa se activa en presencia de la proteína de EMD. Por el contrario, estudios anteriores han demostrado que la gelatinasa MMP-9 no fue producido por Merck osteoblastos de proteína activada por [10].
Proteína EMD contiene factores de crecimiento TGF-ß-y BMP-como, que contribuyen a la inducción de biomineralización durante la regeneración periodontal [22]. BMP-2 se ha demostrado que la promoción de la regeneración ósea in vivo [23], mejorar la actividad de la fosfatasa alcalina [24, 25], y aumentar las MMPs de producción [26, 27], lo que sugiere que las citoquinas presentes en EMD son necesarias para promover el hueso regeneración. proteínas EMD también activa la actividad de la fosfatasa alcalina [28]. Es posible que el TGF-β y BMP en proteínas EMD activan los osteoblastos. Nuestros datos muestran que la proteína de EMD mejora la producción de MMP-2 por las células de osteoblastos y sugieren que la regeneración ósea depende de EMD activado-MMP-2. Estos papeles apoyan nuestros datos [29, 30]. proteínas EMD han disminuido los niveles de MMP-1 y MMP-8 en el fluido crevicular después de la cirugía de colgajo in vivo [6].
EMD-indujo la producción de VEGF es regulada por p38 MAPK en fibroblastos gingivales humanos [31].
también presentó pruebas de identificación de p38 MAPK como la vía predominante para inducir la producción de MMP-2 en osteoblastos estimuladas con EMD. Estudios anteriores han demostrado que esta vía es importante promover el crecimiento de las células PDL estimuladas por la proteína EMD [32]. Por lo tanto, la familia MAPK, incluyendo la MAPK p38, ERK y JNK vías activado por la proteína EMD, desempeña un papel clave en la regulación de funciones celulares requeridas para la regeneración periodontal [33]. la producción de VEGF inducida por EMD está regulada por p38 MAPK en fibroblastos gingivales humanos [31]. MAPK p38 podría regular no sólo la producción de MMP, sino también la producción de citocinas en EMD estimularon ligamento periodontal. Nuestro estudio también indica que la inhibición de EMD producción de proteína inducida por MMP-2 conduce a una reducción significativa en la generación de activa MMP-2, más el apoyo a la idea de que MMP-2 actúa como una degradación de la gelatina para MMP-2 en proteínas EMD osteoblastos estimuladas.
en resumen, nuestros resultados sugieren un modelo en el que MMP-2 juega un papel en la remodelación del tejido conectivo periodontal mediante la degradación de proteínas de la matriz y /o mediante la activación de un potente gelatinasa MMP-2 en osteoblastos.
Conclusión
proteínas EMD induce la producción de MMP-2 a través de la p-38-MAPK activación de vías de señalización en los osteoblastos, estimulando así la degradación del colágeno circundante, lo que resulta en cambios en la estructura de la MEC y la promoción de la regeneración periodontal.
Declaraciones
Reconocimiento
este trabajo fue apoyado por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) 24592853, 23592755 y 23592786. los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses potencial con respecto a la autoría y /o publicación de este artículo.
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contribuciones de los autores
SG participaron en la planificación y el diseño el estudio, en el análisis de datos y redacción del manuscrito. HI realizado la mayor parte del trabajo de laboratorio y participó en el análisis de datos. OS, YU, ED y TI participaron en el análisis de datos. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
