gen
Abstract
Antecedentes
factor de Krüppel-como 4 (KLF4) es un factor de transcripción que regula la proliferación de diferenciación equilibrio de epitelio, y hacia abajo regulada en los carcinomas orales menos diferenciadas y avanzados. Aunque la expresión se inactiva por la hipermetilación del promotor en las células tumorales malignas, sigue siendo desconocido en células de carcinoma oral.
Métodos
ADN genómico aislado de nueve líneas celulares de carcinoma oral de diferentes y una línea normal de los queratinocitos se trató con bisulfito de sodio, y metilación en KLF4
promotor del gen se determinó mediante PCR análisis de secuencia directa. . KLF4 expresión en células cultivadas con o sin reactivo de desmetilación se controló por cuantitativa en tiempo real PCR e inmunoblot
Resultados
una región que abarca 237 pb del promotor - 718 y - 482 de KLF4
gen se hypermethylated en forma oral células de carcinoma que expresan KLF4
en un nivel bajo, pero la metilación era infrecuente en las células que expresan KLF4
alta cantidad. La región aguas abajo de - 481 a 192 no fue metilado en cualquier líneas celulares. La desmetilación tratamiento de las células regulada up-la expresión en los niveles de ARNm y de proteínas.
Conclusión
Este estudio demostró que la hipermetilación en un rango estrecho de la región promotora regula a la baja la expresión KLF4, y sugiere que la pérdida de expresión por la hipermetilación contribuye a la progresión del carcinoma oral de
Palabras clave
gen promotor hipermetilación Krüppel-como factor de cáncer de material complementario oral Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:.. 10 1186 /s12903-016-0172- 5) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes
carcinomas orales son un tumor maligno más frecuente de la cabeza y el cuello, pero el pronóstico de los pacientes no se ha mejorado lo suficiente. células de carcinoma en el frente invasivo muestran frecuentemente expresión génica aberrante, y desdiferencian en estados similares a células mesenquimales en un proceso de progresión de la enfermedad [1-3]. Además, la proliferación sostenida es otra característica importante en un subconjunto de carcinomas agresivo. Proliferación y el equilibrio diferenciación de las células controlan el desarrollo y la homeostasis del epitelio y juegan un papel definitivo en estado patológico de los carcinomas de [4]. Se regulan en gran parte por el gen supresor de tumor, y la expresión de los genes es frecuentemente inactivan por mecanismos epigenéticos [5]. Es importante dar a conocer una causa inactivación de genes supresores de tumor expresión de entender los mecanismos de progresión de carcinoma oral. Hoteles en epitelio escamoso estratificado incluyendo epitelio oral, factor de Krüppel similar (KLF) 4 y 5 se expresan en las células queratinizante suprabasal post-mitótico y proliferativa las células basales menos diferenciados, respectivamente. Controlan críticamente un equilibrio proliferación de diferenciación del epitelio [6, 7]. KLFs regular transcripcionalmente la expresión del gen diana a través de la unión en el promotor, y los estudios anteriores documentado que la pérdida de expresión KLF4 asociados con la desdiferenciación de las células de carcinoma oral y se observa con frecuencia en un subconjunto de los carcinomas agresivos [7, 8]. Se sugiere una implicación de la pérdida de expresión en la progresión del carcinoma.
Ya que la deleción cromosómica de KLF4
locus del gen en 9q31.2 es un evento raro en carcinomas [9, 10], la inactivación epigenética del gen es un primer candidato responsable de la pérdida de expresión. Entre las aberraciones epigenéticas que se encuentran en las células de carcinoma, la hipermetilación del promotor es una causal más común para inactivar la expresión de genes [11, 12]. De hecho, la hipermetilación en KLF4
promotor del gen y potenciador se documenta en los carcinomas de colon, estómago, cuello del útero y riñón [13-16]. Sin embargo, las regiones hypermethylated se localizan de forma variable en los carcinomas de origen diferente y desconocida en los carcinomas orales. En este estudio, hemos analizado la hipermetilación y la correlación con la expresión en células de carcinoma KLF4 orales.
Métodos Líneas celulares
líneas celulares de carcinoma oral (Ca9.22, HO-1-u-1, HOC313, HSC2 , HSC3, KOSC3, OSC19, SCCKN, TSU) y una línea celular normal de los queratinocitos inmortalizados pero no transformado, HaCaT [17], se cultivaron en 10% de medio de suero fetal bovino que contiene.
análisis de la secuencia modificada con bisulfito de KLF4
promotor de la región
estados de metilación del promotor en KLF4
gen se analizaron de acuerdo con un estudio previo [18]. El ADN genómico aislado de células fueron tratados con bisulfito de sodio y se aplica para la amplificación PCR de la región promotora que abarca - 718 y 192 (el sitio de inicio de transcripción se estableció como 1) para el análisis de secuencia directa. Las secuencias de los cebadores utilizados para el análisis son los siguientes: 5 '-
-736GTATGTTAGTAGGGGTG-3' (hacia adelante), 5 '- -442GAGTTTGTTGATTTAGTTGT-3' (hacia adelante), 5 '- -331AAGGAAGTTATAAGTAAGGAA- 3 '(hacia adelante), 5' - -72AATAAAACTAACTACC-3 '(hacia atrás), y 5' - + 213AAACCCAAAACCCCAAATTAA-3 '(hacia atrás). Nos hemos referido a datos de la secuencia de ADN del gen KLF4
depositado en GenBank (DQ658241.1).
Cuantitativa en tiempo real PCR
células de forma aisladas de ARN total con o sin 5 M 5-aza-2-deoxycitidine ( 5-aza) tratamiento se transcribe de forma inversa en ADNc por transcriptasa inversa MultiScribe (Applied Biosystems) y se sometió a cuantitativa en tiempo real PCR usando el sistema de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 20 s seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 1 s y 60 ° C durante 20 s. (Hs00358836_m1, Applied Biosystems) se utilizó las sondas TaqMan específicas para KLF4
. Los niveles de expresión se normalizaron contra ACTB gratis (TaqMan endógeno de control ACTB humano, Applied Biosystems) se calcularon por el método de la curva estándar (2 -ΔΔCt). Para analizar relativa veces de cambios en la expresión, la expresión después del tratamiento 5-aza se dividió por que sin tratamiento.
Inmunotransferencia
lisados totales de células en tampón de muestra de SDS que contiene 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y cóctel inhibidor de la proteasa ( Roche Diagnostic GmbH) se aplicó a geles de SDS-poliacrilamida bajo la condición de la reducción, y electrotransfirió a membranas de PVDF. Las membranas se sondearon con anticuerpos contra KLF4 (Santa Cruz Biotechnology) o β-actina (Sigma-Aldrich), seguido de anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa. Las señales se detectaron utilizando Chemi-Lumi un alza (Nakarai Tesque) y capturado en Ez-Captura MG (ATTO).
Resultados
Expresión de KLF4 en las células de carcinoma oral
La expresión de mRNA fue KLF4
cuantificados por la PCR en tiempo real (Fig. 1). Entre las líneas celulares de carcinoma, se expresa fuertemente en los queratinocitos HaCaT normales. Fue detectado en un nivel relativamente alto en KOSC2 células y células, HOC313 bajos en las células HSC2, Ho-1-U-1 en las células y las células Ca9.22, y no detectables en las células OSC19. Higo. 1 La expresión de ARNm KLF4
en líneas celulares de carcinoma oral y queratinocitos normales (HaCaT). KLF4
expresión fue examinado cuantitativamente mediante la PCR en tiempo real. Expresión relativa se normalizó mediante la expresión de ACTB
en cada muestra (n
= 4) y en comparación con la expresión en las células HaCaT
hipermetilación del promotor en células de carcinoma
metilación en KLF4
promotor del gen de - 718 a 192 fue examinado por el bisulfite modificados PCR análisis de secuencia directa. El promotor incluye 109 citosinas metilación susceptibles (archivo adicional 1: Figura S1), y que describe el estado de metilación de cada citosina como U (metilado), M (metilado) o T /M (mezcla de no metilación y la metilación) en este estudio. En contraste con la ausencia de metilación en las células HaCaT, todas las líneas celulares de carcinoma contenían citosinas M y /o M /U y la frecuencia de M citosina fue en gran medida diferente (Figura 2 y archivo adicional 1:. Tabla S1). La metilación fue confinado en una región que abarca 237 pb - 718 y - 482 que contiene citosinas 39 de metilación sensibles designadas como # 1 a # 39, y las citosinas en la región de 673 pb aguas abajo del # 39 citosina (# 40- # 109 ) no fue metilado. Análisis computacional indica que la región de 237 pb que contiene citosinas metilación susceptible a los cuatro sitios de unión a Sp1-(# 5, 6, 23, 34 y 38) y las citosinas sitio uno PU.1 de unión (# 19) citosina. El # 5, 6, 19 y 23 fueron citosinas metiladas con frecuencia en las células que expresaban KLF4
a bajo nivel (figura 3 y la archivo adicional 1:. Tabla S1). Higo. 2 La metilación del promotor del gen KLF4
. una posición de citosinas metilación sensibles en el promotor está indicado como azul (línea
superior) y las citosinas están numeradas numéricamente de # 1 a # 109. líneas inferiores muestran las citosinas metiladas que fueron completamente negro (
) o no metilado (blanco |) y mezcla de metilación y no metilación (gris
). M% y T /M% indican el porcentaje de citosinas metiladas y la mezcla en 39 citosinas, respectivamente. b datos de secuencias en la # 10 y # 11 citosinas. Cuatro líneas de células de carcinoma que contienen metilado (M) y citosinas no metiladas (U) y la mezcla (M /U) se presentan como un ejemplo
Fig. 3 sitios de unión del factor de transcripción en la región de 237 pb. sitios de metilación sensibles están marcados por el rojo, y sitios de unión Sp1 (flechas azules
) y el sitio de unión al PU.1 (línea verde) se indican
KLF4
expresión después de la desmetilación
Para examinar una implicación de la metilación en la expresión KLF4, las células fueron tratadas con un reactivo de desmetilación 5-aza y la expresión se analizó en ARNm y los niveles de proteína. El tratamiento aumentó fuertemente la expresión de ARNm en las células TSU y especialmente HSC2 células (Fig. 4a) en la que el promotor se hypermethylated ampliamente. Otras líneas celulares aumentaron la expresión de diversas maneras, con exclusión de las células que expresaban ARNm OSC19 por debajo de un nivel detectable. expresión de la proteína KLF4 era casi idéntica a la expresión mRNA. Fue indetectable en las células, las células HSC2 HSC3, células HO-1-U-1, las células TSU y OSC19 células. Después del tratamiento de desmetilación, hypermethylated HSC2 células y las células TSU fuertemente regulado hasta la expresión de la proteína (Fig. 4b), y Ho-1 1-u-células, HOC313 células y células Ca9.22 que no contenía citosina M no aumentó el expresión. OSC19 células no expresan la proteína como de ARNm. Entre tres líneas celulares que contienen tanto M como citosinas T /M en diversas tarifas, las células y las células HSC3 KOSC2 aparentemente aumentó la expresión, pero otros (células SCCKN) no lo hicieron. Higo. 4 Expresión de KLF4 después de la desmetilación. un pliegue relativa de KLF4
la expresión de ARNm en las células tratadas con 5-aza reactivo de desmetilación dividida por la expresión sin tratamiento con 5-aza (n
= 4). expresión de la proteína b KLF4 en las células con (+) y sin (-) de tratamiento 5-aza se examinaron por inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control interno
Discusión
células de carcinoma adquieren comportamientos agresivos en un proceso de la progresión de la activación y la inactivación de la expresión del gen asociado a un tumor. expresión KLF4 se reduce en muchos tipos de carcinomas en etapa avanzada y la pérdida de expresión inicia transición epitelial-mesenquimal de células de carcinoma que estimula fuertemente la progresión [19]. De hecho KLF4 es el regulado en los carcinomas orales menos diferenciadas y avanzados y suprime la desdiferenciación de las células [7]. Aunque la hipermetilación del promotor se considera como una causa de la pérdida de expresión [13-16], no se sabe en carcinomas orales. Este estudio muestra que la expresión se correlaciona estrechamente con los estados de hipermetilación en una región de 239 pb-en el promotor.
Hipermetilación responsable de la inactivación de genes que se observa con frecuencia en las islas CpG de genes supresores de tumor [11, 12], y se muestra en la KLF4
gen en este estudio, lo que sugiere que la región es importante para regular la expresión en células de carcinoma KLF4 orales. Esto es apoyado por que el tratamiento desmetilación hasta reguladas KLF4 ARNm y proteínas en las células hypermethylated pero no las células sin hipermetilación. Ca9.22 células, células Ho-1-u-1 y OSC19 células que no fueron hypermethylated casi no aumentó la expresión. Se sugiere una presencia de factores adicionales para activar la expresión. Sin embargo, es claro que la hipermetilación es responsable de KLF4 baja regulación, y que el BP-región 237 puede desempeñar un papel importante en la expresión.
Hipermetilación de KLF4
gen se pasó en potenciador del gen en células de tumores malignos humanos; -2128 -1770 ~ Región en las células de meduloblastoma [20] y - ~ 1,852 -1,658 región en células de carcinoma de cuello del útero [15]. Aunque no nos dirigimos a la metilación en el potenciador en este estudio, la metilación en la región promotora es más directamente como una plataforma para regular la expresión de genes en general [11, 12]. La hipermetilación en KLF4
promotor del gen se ha observado en células de carcinoma gástrico (-130 ~ -13 región; ref. 14) y en células de carcinoma colorrectal (79 ~ 355 región; ref. 13), pero el - 481 ~ región 192 no fue metilado en este estudio. Indica que la hipermetilación restringido a una región de 237 pb a partir de - 718 a - 482 es importante para la regulación negativa en células de carcinoma oral. Evidencias recientes establecieron que la hipermetilación se produce en diferentes regiones del gen promotor /potenciador en diferentes tipos de células de carcinoma y la hipermetilación promotor es más designado para la célula de linaje y de tipo celular especificación [11, 12]. Es plausible que los sitios de hipermetilación sensible en células de carcinoma oral localizar aparte de otros tipos de células de carcinoma. México La región de 237 pb que codifica sitios de unión Sp1 y PU.1 que se requieren para la expresión [21, 22] . Sp1 juega un papel crítico en el desarrollo del epitelio [23, 24], y Klf4
- /-
ratones desarrollan carcinomas orales [8, 25]. Por lo tanto, la hipermetilación en la región de 237 pb parece tener un papel importante en KLF4 baja regulación. Dado que la pérdida de expresión KLF4 estrechamente asocia con la progresión de carcinoma oral, la restauración de la expresión puede ser una estrategia interesante para el tratamiento de los pacientes.
Conclusiones
Este estudio demostró que KLF4
promotor del gen se hypermethylated en células de carcinoma oral a una diferente región de otros tipos de células de carcinoma, y que estaba asociado con la expresión KLF4. Desde KLF4 es supresora de tumor, su inactivación por el hypermthylation promotor puede ser un mecanismo de progresión de carcinoma oral, como en líneas celulares de carcinoma analizados en este estudio
abreviaciones
5-aza:.
5-aza -2-deoxycitidine
KLF:
factor de Krüppel-como
M citosina:
citosina metilado
T citosina:
citosina no metilada
T /M citosina:
mezcla de citosinas no metiladas y metilados
declaraciones
Reconocimiento
Este estudio fue apoyado por la JSPS KAKENHI la subvención Número 26462859, y esté sometido a un programa de estudios de Investigación de Ciencias de la vida Dental de la Facultad de Odontología de la vida de Tokio, La Universidad Dental Nippon. logo articles abierto AccessThis se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento 4.0 Licencia Internacional (http:. //creativecommons org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que se dará información al autor (s) original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http: //creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /.) Se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
adicional. presentar
archivo adicional 1: Figura S1. sitios susceptibles de metilación en KLF4
gen y el promotor. Se muestra la secuencia de ADN analizadas en este estudio (la secuencia en el exón 1 se escribe con mayúscula). Citosinas potencialmente sensibles a la metilación y su número numérica fueron resaltados en rojo, y se subrayó una hypermethylated región de 237 bps. Tabla S1. Un resumen de metilación establece en cada metilación de citosina susceptibles. (PDF 160 kb) Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Contribución de los autores
AY, KK, AT, AS, HA, TH, DU, KY y TC completado todos los experimentos. TC y KI diseñó el estudio, y KI escribió el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
