Resumen Antecedentes
Un número de patógenos puede causar una grave destrucción del aparato periodontal durante el curso de la periodontitis. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un dispositivo de diagnóstico para el uso en el punto de necesidad para la detección de patógenos periodontales para permitir una terapia personalizada para el tratamiento de periodontitis.
Métodos
Este sistema de ensayo se basa en la reacción en cadena de la polimerasa de ADN aislado de los patógenos periodontales y se examinó para detectar con precisión las secuencias específicas de especie en un chip de rotación con reactivos liofilizados para la reacción en cadena de la polimerasa. La conservación de los reactivos se optimizó para asegurar su estabilidad durante el almacenamiento.
Resultados
En el presente trabajo, hemos desarrollado un modelo de dispositivo de punto de cuidado y mostró una prueba de concepto. Requiere bajo volumen de muestra, es que ahorra tiempo y por lo tanto puede facilitar el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades periodontales temprano.
Conclusiones Francia El dispositivo desarrollado puede proporcionar un diagnóstico rápido de la composición y cantidad de la flora bucal de los pacientes y podría ayudar a evaluar la etapa de la infección periodontitis. Esto puede facilitar una optimización de los enfoques terapéuticos con el fin de prevenir algunas de las consecuencias más graves de la enfermedad.
Palabras clave
cuantificación bacteriana periodontitis-PCR en tiempo real microbianos diagnóstico material complementario liofilización Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /s12903-015-0155-y) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
Aproximadamente el 90% de la población experimenta problemas dentales u orales del mundo durante su. tiempos de vida [1]. 11,2% de los adultos se ven afectados por periodontitis severa, por lo que es un tema pertinente en el sector del cuidado de la salud dental [2].
La periodontitis es una compleja respuesta inflamatoria del cuerpo humano contra los microorganismos, lo que puede conducir a la destrucción tisular severa en la cavidad oral [3]. los factores de riesgo
que conducen a infecciones se han identificado como el fumar, la diabetes, la aparición de microorganismos especiales, obesidad, psicológicas y aspectos de higiene. Por otra parte, los factores genéticos, la edad, el género y la etnia también podrían desempeñar un papel en el desarrollo de la enfermedad periodontal [4].
Para el diagnóstico de periodontitis, se han establecido varias prácticas. exámenes periodontales directos incluyen anamnesis de los pacientes, las mediciones de la profundidad de sondaje y el nivel de inserción clínica y la toma de radiografías dentales. Adicionalmente, las pruebas de susceptibilidad genética o el examen de la microflora subgingival y fluido gingival son métodos opcionales para evaluar la enfermedad periodontal [5]. Dependiendo de los resultados del diagnóstico médico y etapa de la enfermedad, una terapia apropiada sigue. Enfoques, tales como la optimización de la higiene bucal, profesional regular limpieza, raspado /desbridamiento y alisado radicular, el uso de antibióticos para controlar la formación de placa bacteriana y la inflamación, e incluso en casos extremos, la cirugía puede ser necesaria para prevenir la pérdida de dientes [6].
de las especies aproximadamente 600-700 bacterianas que viven en zonas subgingivales, sólo unos pocos de ellos están asociados a la periodontitis y puede dar lugar a cambios significativos en la comunidad microbiana bucal, cantidad y composición [7, 8]. Con el fin de evaluar la etapa de infecciones periodontitis e iniciar tratamientos eficaces, es útil para determinar tanto la identidad de las especies que interactúan, así como el número total de los agentes patógenos que viven en las bolsas periodontales. El trabajo que aquí se presenta se centra en especies de bacterias demostrado estar asociadas con periodontitis, que puede ser trazada en tres clases basadas en la patogenicidad: E. corrodens, F. nucleatum, P. micra ¿Cuáles son levemente patógena, P. intermedia, C. recto, E. nodatum ¿Cuáles son moderadamente patogénico y A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. dentícola de
organismos patógenos fuertemente [9]. A pesar de que otras especies, la expresión de biomarcadores típicos y el estilo de vida individual de las personas pueden influir en el desarrollo de la enfermedad, así, la detección de estas especies de marcador puede ser un primer paso en el proceso de identificación de una enfermedad o la condición médica en la más detalle.
Si se pueden identificar los tipos de especies bacterianas que viven en las bolsas periodontales, esta información se puede utilizar para clasificar mejor la naturaleza y gravedad de la infección y adaptar una terapia personalizada que mejor se adapte a revertir su curso [10].
Sólo unos pocos puntos de los dispositivos de atención para el ácido nucleico que han sido desarrollados y detección basada establecidos en el mercado hasta el momento. GeneXpert de Cepheid, por ejemplo, es un dispositivo automatizado para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cartuchos de preparación de muestras especial para los agentes patógenos de la tuberculosis, el SARM o estreptococos del grupo B. Sin embargo, este sistema de alto costo no permite la opción de implementar varias reacciones multiplexados en una prueba de funcionamiento. IQuum presentó recientemente el análisis impulsado por PCR del VIH en 1,5 h utilizando el analizador de LIAT y Lutz et al.
Demostrado un sistema de laboratorio-on-a-lámina de la realización de una reacción de amplificación para MRSA en menos de 20 minutos [11]. Además, Van Oordt et al. [12] informó en 2012 sobre un sistema integrado para la detección de ácidos nucleicos o inmunoensayos con la ayuda de una plataforma Labdisk desechable.
En el presente estudio, el desarrollo de un sencillo de usar y de bajo costo sistema de laboratorio en un chip para la detección, identificación y cuantificación de bacterias periodontales es la principal consideración en el diseño del ensayo biológico molecular y dispositivo de diagnóstico. El sistema de diagnóstico se compone de dos elementos principales: un cartucho de microfluidos, que contiene todos los reactivos de PCR necesarios en un formato deshidratado, y un dispositivo de hardware responsable de impulsar y controlar el flujo de trabajo. Este último es un conjunto de bloque de calefacción radialmente dividido que contiene múltiples zonas de temperatura estables para los diferentes escalones de la PCR, combinadas con un motor giratorio situado en el centro que contiene un montaje para un policarbonato (PC) chip de PCR. Este chip alberga la muestra del paciente en las cámaras de reacción y gira a través de las zonas de temperatura en el bloque de calentamiento con el fin de llevar a cabo la PCR. La cantidad de amplicón aumento puede ser detectada a través de las mediciones de fluorescencia.
Existen dispositivos de rotación conceptualmente similares, tales como el enfoque de 3M ™ Integrated Cycler, que utiliza la combinación de la fuerza centrífuga y la energía infrarroja como fuente de calor para la PCR. Análisis de las muestras se realiza ya sea en un disco universal desechable para ensayos de usuario o para las enfermedades particulares en un chip con kits específicos que requieren muchos pasos de pipeteado o de enfriamiento de reactivos [13]. También Sun et al.
[14] demostraron 2007 un microchip circular para ferrofluidos de amplificación y la aplicación de fuerzas magnéticas, dejando al descubierto el problema del bajo rendimiento de la muestra. Francia El sistema de amplificación y medición lab-on-a-chip basado en el presentado este trabajo tiene el potencial para optimizar el diagnóstico de periodontitis convencionales en el futuro, reduciendo al mínimo etapas de manipulación de laboratorio y permitir la realización rápida de la PCR, evitando un largo tiempo de envío de muestras de pacientes. Además, la configuración basada en el chip puede ser integrado con módulos para el aislamiento de ADN en versiones posteriores. De esta manera, nuestro objetivo es eliminar los pasos que requieren mucho tiempo y mucha mano de obra durante la preparación de la muestra.
Métodos Cepas bacterianas
/condiciones de cultivo /aislamiento de ADN
bacterias que causan la periodontitis se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y cultivos celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) y se cultivan en un medio apropiado (véase la disposición 1: Tabla S1). Colonias o bacterias sedimentadas de medios líquidos por centrifugación podrían ser recogidos para el aislamiento de ADN. purificación del ADN se llevó a cabo con la ayuda de la QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. el rendimiento y la pureza del ADN se midieron con el instrumento NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, EE.UU.).
PCR México La detección y cuantificación de la amplificación bacterias periodontales se llevaron a cabo utilizando un LightCycler 480 II. Primer secuencias se dan en el archivo adicional 2: Tabla S2. Los cebadores para la amplificación del fragmento de ADN específico de la especie fueron diseñadas durante este proyecto con la ayuda del software Primer3. Universal 16S cebadores fueron adoptados de Kommedal et al. [15]. Las condiciones de ciclación
para la amplificación fueron las siguientes: 5 minutos de incubación inicial a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de amplificación (95 ° C durante 10 s, 51 ° C durante 10 s y 72 ° C durante 15 s). Después de cada ejecución PCR, un análisis adicional de curva de fusión se llevó a cabo para caracterizar las moléculas de ADN producidas.
Curvas estándar
Para establecer las curvas de calibración, serie de dilución de ADN bacteriano que van desde 2 a 2 millones de equivalentes de genoma se utilizaron en una intento de cuatro veces para cuantitativa en tiempo real PCR. Las curvas de calibración se crean de forma predeterminada con el método de puntos de ajuste del programa LightCycler. Para el recuento de bacterias en general, Porphyromonas gingivalis
sirven como representante de 16S PCR con un número medio de copias de copias del gen 16S cuatro. La norma fue creada para alcanzar un número de patógenos estimado para la cuantificación. Se sabe que varias copias del gen 16S pueden ocurrir dentro de un genoma procariota, con un máximo de 15 copias de Bacillus thuringiensis
. Este hecho hace que sea difícil calcular un recuento de bacterias en general realista en una población diversa de bacterias con diferentes fuertemente el número de copias entre las especies individuales. Los organismos que causan la periodontitis utilizados en nuestra investigación se cree que estar en el rango menor número de copias de acuerdo a la información dada en la base de datos de ARN ribosomal operón número de copias [16]. Para probar esto, el número de copias desconocido para E. corrodens
se determinó durante el curso de este trabajo. Para los organismos unsequenced, la determinación del número de copias se puede lograr con la ayuda de análisis de Southern Blot. Una sonda 16S puede detectar el número de regiones equivalentes en el genoma restringido, como se muestra previamente por Lee et al. [17].
Transferencia Southern
Para determinar los 16S número de copia E. corrodens
a través de Southern Blot, aproximadamente 10 g de ADN se digirieron con las enzimas de restricción Eco RI
HF, Hind III
(New England Biolabs, Ipswich, EE.UU.), Nco
I, Pst
I, Xba I
(Jena Bioscience GmbH, Jena, Alemania) y Xho I
FD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE.UU.) a 37 ° C durante la noche. Las muestras, junto con el amplicón 16S PCR como control positivo, se separaron en un gel de agarosa al 1% a 4 ° C. El gel se preparó para la transferencia capilar con despurinación (M HCl 0,25), la desnaturalización (1,5 M NaCl, NaOH 0,5 M) y la neutralización (3 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl), seguido de transferencia durante la noche a una membrana de nylon.
para la hibridación, la biotina PCR Labeling Master (Jena Bioscience, Jena, Alemania) se utilizó para generar una sonda. cebadores 16S y la plantilla de ADN de E. corrodens
se aplicaron para producir un amplicón biotinilado mediante la incorporación de dUTPs biotina durante la PCR. La sonda se purificó con el gel NucleoSpin® y PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Para asegurar una secuencia diana completa para la hibridación, se llevó a cabo un examen de posibles sitios de corte dentro de la secuencia: una incubación enzimática del amplicón 16S con las enzimas mencionadas anteriormente y la posterior verificación comparando el tamaño de la banda de amplicón digerido con el ADN de control en un agarosa gel se llevó a cabo.
Después de pre-hibridación durante una noche a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 2 horas a 42 ° C, la hibridación con la sonda de 200 ng /ml de tampón se llevó a cabo. Se llevaron a cabo procedimientos de hibridación y detección tal como se describe en el Kit de Detección Biotina cromogénico (Thermo Scientific, Schwerte, Alemania), que producirá un precipitado de color.
PCR-on-a-chip de Francia El PCR se llevó a cabo en 1 mm de espesor chips de PC con cavidades que tienen un volumen de 10 l de mezcla de reacción. Los chips se sellaron con láminas de sellado (nerbe más GmbH, Winsen /Luhe, Alemania) a partir de ambos lados con la mezcla PCR incorporado.
Para la amplificación, el chip PCR gira en el dispositivo de ciclos térmicos, que se muestra en la Fig. 1. En pocas palabras, se compone de seis bloques dispuestas circularmente en forma de pastel rebanada de calefacción, tres de ellos para llevar a cabo la desnaturalización, etapas de recocido y elongación y tres bloques adicionales para lograr cambios rápidos de temperatura en el interior de las cavidades. Higo. 1 dispositivo de ciclos térmicos con diferentes zonas de temperatura y un chip PCR giratorio. Izquierda: Un dibujo esquemático ilustra la disposición de los elementos de calentamiento (Ta = temperatura de recocido) y el detector de fluorescencia. Un chip de rotación pasa cada zona y a 72 ° C se mide la señal de fluorescencia. La imagen de la derecha muestra el laboratorio de puesta a punto, incluyendo el motor y el control de la temperatura conduce Opiniones de prueba de concepto del aparato, una PCR bien establecida de S. aureus gratis (ATCC 2592), con un tamaño de amplificación de se utilizó 279 pb. Las condiciones de ciclación fueron un 5 min de desnaturalización inicial, seguido de 30 s en cada uno de los secuenciales 95, 61 y 72 ° C pasos para la amplificación para un total de 40 ciclos, con 5 s pasaron sobre las placas situadas entre cada uno de los tres.
mezclar la propia reacción fue optimizado con varios aditivos tal como se describe en la sección "liofilización" siguiente con el fin de aumentar la PCR-compatibilidad de PC y para permitir la liofilización de la mezcla.
liofilización
Una prueba para determinar la efecto de la liofilización de reactivos de la PCR en la reacción de amplificación se realizó usando el E. Corrodens
PCR específica del sistema de ensayo como bien caracterizado. La mezcla de PCR contenía una concentración final de 0,25 M para cada cebador, 50% 2x SBYR verde Mastermix (Roche, Mannheim, Alemania), 5% de trehalosa, 0,25 g /l de BSA, 0,75% de PEG 8000, 10 ng de ADN y el resto ddH
2O. La mezcla de liofilización se congeló a -80 ° C durante 15 min y finalmente se secó por congelación durante tres horas en un liofilizador preenfriado. Almacenamiento de larga duración de hasta cuatro meses a 4 ° C y la temperatura ambiente se compararon, con mezclas protegidos de la luz, con y sin la adición de polimerasa estabilización de trehalosa, el uso del sistema LightCycler para PCR en tiempo real. Un control negativo se ejecutó durante la liofilización para excluir cualquier contaminación durante el proceso.
Resultados
Las curvas de calibración
Para la detección y cuantificación de los diez bacterias que causan la periodontitis utilizados en este estudio, y para determinar los límites de detección , se establecieron ensayos de PCR cuantitativa. Mediante la utilización de series de dilución del número de copias del genoma bacteriano, las curvas de calibración se han creado de acuerdo con las curvas de amplificación resultantes. A modo de ejemplo, las curvas estándar de C. gingivalis
y E. corrodens
se da en la Fig. 2. Para obtener resultados fiables y reproducibles, la eficiencia de la PCR debe ser mayor que 1,8. Las curvas de calibración se establecieron para las bacterias periodontales restantes de la misma manera. Higo. 2 Las curvas de calibración: punto (CP) frente a la concentración de la muestra de cruzar. un C. gingivalis con una eficiencia de 1,80 que van desde 20 a 2 millones de bacterias, y (b) E. corrodens con una eficiencia de 1,99 que van desde 200 a 2 millones de bacterias. Todos los datos se presentan como medias ± límites de detección SD
determinados por el LightCycler 480 II fueron los siguientes: P. intermedia
2.000 copias /reacción, C. gingivalis
20 copias /reacción, C. rectus
2 copias /reacción, A. actinomycetemcommitans
10 copias /reacción, P. gingivalis
10 copias /reacción, E. corrodens
200 copias /reacción, P. micra
2000 bacterias, T. dentícola
20000 copias /reacción, en general contar con 200 copias /reacción.
de transferencia de Southern México La endonucleasas de restricción Eco RI
, Hind III
, Nco
I, Pst I
, XbaI y XhoI
I se utilizaron para estimar el número de operones 16S presentes en el genoma de E. corrodens.
Estas enzimas se ensayaron adicionalmente para asegurarse de que no había ningún sitio de corte dentro de la región 16S , donde la sonda de detección se hibrida durante la transferencia Southern, con el fin de prevenir la aparición de muchas bandas resultantes de la unión de la sonda para cortar secuencias diana. Como se muestra en la Fig. 3, un número máximo de cuatro bandas se pudo detectar después del corte con Eco RI
, Hind
I. III y Pst
La presencia de un menor número de bandas visibles de la restricción con Nco
I, Xba I y Xho
que podía ser el resultado de la aparición de hebras largas de ADN que contiene dos o más regiones 16S después de incubación enzimática. De acuerdo con nuestras investigaciones, un número 16S operón de cuatro es muy probable para E. corrodens
, por lo tanto el uso de P. gingivalis
, que contiene el mismo número operón 16S, como el estándar para estimar el recuento de bacterias en general, parece ser muy apropiado. Higo. 3 16S número de copias de E. Corrodens determinada por hibridación de Southern. El ADN genómico se cortó con 1) Eco RI
, 2) Hind
III, 3) Nco
I, 4) Pst
I, 5) Xba
I, 6) Xho
I. 7) control positivo. Eco
RI, Hind III y Pst
que muestran el número máximo de 4 bandas
PCR-on-a-chip
primeras mediciones de fluorescencia se realizaron con el sistema de medición de fluorescencia Qiagen ESElog colocado directamente encima de la zona de temperatura C 72 ° del dispositivo de termociclado, que es responsable de la etapa de elongación de la PCR. El ESElog E470 USB /D520 es adecuado para la detección de la SYBR tinte verde DNA-intercalantes contenida en la mezcla maestra de PCR.
Por cada ciclo durante el cual el chip que contiene la muestra pasa a través de cada una de las diferentes zonas de temperatura en el dispositivo de termociclado, se midió el continuo aumento en la fluorescencia correspondiente a la cantidad de S. aureus
amplicón específico de presente en ese momento. El aumento resultante en la fluorescencia según se mide más de 40 ciclos por el detector se puede ver en la Fig. 4. Fig. 4 de detección de fluorescencia en tiempo real. Singleplex PCR se muestra en el sistema de laboratorio en chip. una medida de fluorescencia se muestra a modo de ejemplo para dos muestras. b resultante amplicón en un 2% de agarosa gel
Durante las etapas de calentamiento, la formación de burbujas en las cámaras de PCR dio lugar a aberraciones en el curso de la amplificación tal como se muestra a modo de ejemplo en el ciclo 20 y 39 de la muestra 2 (ver Fig. 4a). Sin embargo, el aumento esperado de la fluorescencia y un resultado positivo por PCR de la región de 279 pb específico de S. aureus
se demostró en las pruebas iniciales (ver Fig. 4b).
Liofilización
Conservación de la actividad biológica de la polimerasa después de la liofilización se demostró para el período examinado de cuatro meses. E. corrodens
específico de evaluación de PCR muestra que este almacenamiento a largo plazo a 4 ° C después de la liofilización no condujo a ningún cambio de la curva de amplificación, mientras que el almacenamiento a temperatura ambiente aplanado el curso típico de la curva y su característica exponencial incrementar. En este caso, los puntos de paso de la PCR en tiempo real se produjeron de forma retardada (ver figura 5 y archivo adicional 3:. Tabla S3). Higo. 5 prueba de liofilización. Comparación de la actividad de la polimerasa después de 1 (a) y 4 (b) meses de almacenamiento de) de almacenamiento liofilizado PCR mixes.1-3 a 4 ° C, 4) de almacenamiento a 4 ° C sin la adición de trehalosa, 5-7 ) de almacenamiento a temperatura ambiente, 8) de almacenamiento a temperatura ambiente sin adición de trehalosa, 9) de control negativo de PCR, 10) de control negativo se almacena a 4 ° C, 11) de control positivo después de la liofilización
la adición de trehalosa a la mezcla de PCR demostrado ser esencial para el almacenamiento a largo plazo, especialmente a temperatura ambiente. La amplificación con la mezcla de reacción sin trehalosa llevó a una señal deficiente, los niveles más bajos de fluorescencia en general y CPs retraso después del almacenamiento a temperatura ambiente durante cuatro meses.
Discusión y conclusiones
La periodontitis es una enfermedad omnipresente en todo el mundo con la necesidad de diagnósticos eficaces , el tratamiento rápido y la inhibición de su progresión a fin de evitar la pérdida de dientes. Además, las infecciones orales pueden potencialmente conducir a enfermedades secundarias graves como sepsis, sistémica o trastorno cardiovascular y la neumonía [18].
Con el fin de facilitar la detección y cuantificación de especies de bacterias indicadoras de la enfermedad, hemos desarrollado una PCR-driven dispositivo de punto de atención para la identificación de patógenos asociados a la periodontitis y mostró la funcionalidad básica. Francia el ensayo de PCR cuantitativa para las cepas bacterianas se desarrolló con éxito y las curvas de calibración se establecieron con el sistema LightCycler. Para la cuantificación absoluta, las concentraciones desconocidas de las muestras se pueden comparar con las curvas de calibración ya establecidos, en los que al menos una muestra estándar único de concentración conocida que cae dentro del rango de la curva importado tiene que ser incluido en cada ejecución PCR para servir como una referencia. Ximénez-Fyvie et al.
Ya demostró en 2000 que las muestras de placa subgingival de pacientes sanos a menudo contienen el número de bacterias significativamente más bajos, por lo que los límites de detección obtenidos aquí de tan sólo dos bacterias en algunos casos son adecuadas para analizar la frecuencia muy alta cargas bacterianas en casos de periodontitis existentes [19]. El desarrollo del dispositivo adicional, el procedimiento de cuantificación descrito será transferido en el dispositivo de punto de cuidado para permitir el ensayo de muestras de pacientes derivada en el futuro.
Análisis Southern Blot podría identificar cuatro copias de la región 16S en el genoma de E. corrodens
. Este método evita la secuenciación completa del genoma de E. corrodens
, cuya secuencia completa no está disponible todavía. Sin embargo, este número puede ser mayor en el caso de corte incompleta por las enzimas de restricción o en el caso de dos o más áreas 16S estando situados en un fragmento de ADN que surge de digestión de restricción. Sin embargo, estos resultados muestran que el uso de P. gingivalis
como representante para bacterias periodontopatogénicas es apropiado para generar la curva estándar para los recuentos bacterianos en general con una 16S típicos número de copias de cuatro. El uso de esta bacteria para la generación de una curva estándar universal para la evaluación de los recuentos microbianos totales ya fue descrito por Kirakodu et al.
[20].
Como prueba de concepto, el ensayo de PCR se puede muestran para trabajar en los chips de PCR rotación sobre varias zonas de calentamiento en un dispositivo de termociclado especialmente diseñado. Debido al pequeño volumen de reacción requerido y la falta de necesidad de calefacción y refrigeración pasos por los propios bloques de calentamiento, el tiempo de reacción era de un tercio más rápida que en termocicladores convencionales, incluso sin ningún cuidado especial tomado para optimizar además las etapas de PCR individuales.
En el futuro, esta reacción se puede optimizar con pasos más cortos de desnaturalización /hibridación y PCR-aditivos o polimerasas rápidas, por ejemplo, una rápida KAPA2G ADN polimerasa (Kapabiosystems, Wilmington, EE.UU.) con un alargamiento del tiempo de aproximadamente 1 s /kb , lo que conduce a un tiempo total de reacción acortado significativamente. Por otra parte, una reducción adicional del volumen de reacción puede acelerar la transferencia de calor, por consiguiente, la reducción de la cantidad necesaria de reactivos y los costes [21].
En nuestro sistema de punto de cuidado, pasos de pipeteado de los reactivos individuales se minimizan conduciendo a menos fuentes de error y el aumento de la comodidad para el usuario final. Por lo tanto, el uso de mezclas de reacción liofilizadas se puso a prueba con el fin de permitir el almacenamiento a largo plazo. Se demostró que la Taq polimerasa
podría estar protegido contra la degradación y pérdida de inactividad cuando se almacena a 4 ° C, mientras que una actividad algo menor fue evidente cuando se almacena a temperatura ambiente durante un máximo de cuatro meses. Basándose en estos resultados la mezcla de reacción es adecuada para el almacenamiento en los refrigeradores convencionales.
Sin embargo, estudios a largo plazo para examinar la vida útil de las mezclas de reacción se lleva a cabo actualmente con el fin de ver si Taq
está dañado después de un período más largo de tiempo después del proceso de deshidratación.
el sistema óptico para la detección de la fluorescencia fue integrado en el dispositivo, dejando al descubierto el problema de la formación de burbujas dentro de la muestra durante la PCR. PCR de la mezcla de desgasificación, un mayor contenido de glicerol y el cambio de hidrofobicidad como se sugiere por Trung et al.
Y Jankowski et al.
[22, 23] se observaron no eliminar por completo este problema y aberraciones ocasionales en el curso de las medidas de fluorescencia . Reequipamiento del sistema con un calentador o un ventilador de aire caliente en la parte superior del chip con cavidades más altas podría ayudar a prevenir la evaporación y la posterior formación de burbujas.
En el ulterior desarrollo de este dispositivo, un módulo de purificación de ADN en el chip serán integrados en el chip y reacciones multiplex con sondas fluorescentes específicas de secuencia deben establecerse con el fin de evitar el uso de tintes de intercalación inespecíficos. Además, las pruebas de biomarcadores se podrían implementar en la construcción de chips, que ayuda a caracterizar y optimizar el estado de salud de los pacientes también.
En general, un problema significativo para el tratamiento y prevención de la periodontitis es que, hasta ahora, casa estándar productos de cuidado dental, tales como cepillos de dientes y el hilo no puede eliminar por completo la formación de placa bacteriana y prevenir la aparición de la enfermedad [9]. por ejemplo, las medidas terapéuticas cirugía, extracción de dientes y, finalmente, las dentaduras postizas son una carga financiera enorme para los pacientes o seguro dental, si se ha adquirido. En conjunto, esto demuestra la importancia de desarrollar una rápida aplicación, sistema fiable de punto de atención para el diagnóstico y la clasificación cuantitativa de las infecciones periodontales con el fin de facilitar la aplicación inmediata del plan de atención médica óptima que está disponible y para la etapa diagnosticado de la enfermedad. Socransky et al.
[10] mostró 1998 en su teoría compleja que hay colonizadores típicos temprano y tarde en la progresión de la enfermedad periodontal, lo que indica las diferentes manifestaciones de la periodontitis que requiere un tratamiento individualizado respectiva.
Para obtener información sobre la composición microbiana de muestras de pacientes subgingivales, dentistas por lo general tienen que enviar las muestras de placa a un laboratorio clínico. Cultivo, inmunológica o análisis de la sonda de ADN y sistemas de prueba basados en ácido nucleico recientemente más sensibles, como el microIDent® (Hain Lifescience, Nehren, Alemania) puede ofrecer información para la terapia óptima, sin embargo, todavía con la necesidad y el costo de envío a los laboratorios [24 ].
el simple, modelo de sistema de punto de atención se presenta aquí, que se puede aplicar fácilmente en cada consultorio dental, reduce tanto el tiempo y los costos para el diagnóstico y elimina la necesidad para el transporte a laboratorios externos y por lo tanto facilita tratamientos rápidos cruciales en el futuro. Además, el chip se puede ajustar y se utiliza para otras aplicaciones en las áreas médicas con una necesidad de la detección y el análisis de los agentes patógenos, tales como los que causan sepsis o pandemias regionales /mundiales rápido.
Disponibilidad de datos de apoyo sobre The datos suplementarios de archivo adicional 1: Tabla S1, la disposición 2: Tabla S2 y archivo adicional 3: Tabla S3 disponer de los métodos y resultados de este artículo se incluyen dentro de los archivos de Excel adicionales
abreviaciones
BSA:.
albúmina sérica bovina
CP: punto de cruce
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PC: policarbonato
PEG: polietilenglicol
Declaraciones
Agradecimientos Este proyecto
fue apoyado por el Ministerio Federal de Economía y Energía (FIA-proyecto KF2302705AK1). Además agradecemos al Dr. David M. Smith para la crítica constructiva y la revisión del manuscrito logo articles abierto AccessThis se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento 4.0 Licencia Internacional (http:.. //Creativecommons org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que se dé el crédito correspondiente al autor (s) original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http: //creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /.) Se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
adicional. archivos
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Contribuciones de los autores
CG redactó el manuscrito, llevaron a cabo experimentos de liofilización y PCR-on-a-chip junto con KN . LG contribuido al análisis de transferencia de Southern y JB, NL, LR han participado en tiempo real los experimentos de PCR. CB ayudó con el montaje del dispositivo y desarrolló el software para el análisis de PCR. KV y DK concibió el proyecto, participaron en el diseño y coordinación. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.