epitelial bucal
Abstract
Antecedentes
células epiteliales gingivales son la población principal del tejido gingival, en calidad de la primera línea de defensa contra la intrusión microbiana y la regulación de la homeostasis del tejido periodontal en la salud y la enfermedad a través de la familia NLR Pyrin inflamasoma dominio que contienen-3 (NLRP3), que reconoce patrones moleculares de patógenos asociados y de peligros (PAMPS y apaga). El objetivo de este estudio fue determinar si la activación de NLRP3 inflamasoma depende de la infección con el patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), o la estimulación con P. gingivalis
lipopolisacárido (LPS), y /o extracelular trifosfato de adenosina (ATP).
Métodos
Una línea de células epiteliales orales se trató con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP. La expresión génica y proteica de los componentes inflamosoma NLRP3 se cuantificaron por el tiempo real de RT-PCR e inmunotransferencias. La producción de IL-1β e IL-18 se midió por ELISA.
: Resultados de la No hubo un aumento en la expresión de genes NLRP3 inflamasoma después de P. gingivalis
infección a menos de pre-estimulada por ATP. aumentos evidentes de la expresión de genes NLRP3 inflamasoma se observó después de P. gingivalis
estimulación LPS, incluso pre-estimulada por ATP en 2 h.
Conclusiones
Los resultados indican que la activación de NLRP3 inflamasoma no se basa en P . gingivalis
infección, a menos estimulado por P. gingivalis
LPS y /o ATP extracelular, lo que sugiere diversas vías de señalización están implicadas en la respuesta inmune del huésped.
Palabras clave
extracelular trifosfato de adenosina inflamasoma (ATP) NLRP3 Porphyromonas gingivalis gratis (P. gingivalis
) P. gingivalis
LPS Antecedentes
periodontitis crónica, una de las enfermedades más comunes y frecuentes en los seres humanos en todo el mundo [1], se define como una infección crónica impulsada enfermedad inflamatoria del periodonto que resulta en la destrucción del tejido gingival, la absorción de hueso alveolar y, finalmente, la pérdida de dientes [2]. Cuando se produce la infección, el sistema inmune innato será la primera línea de defensa contra patógenos y activa el sistema inmune adaptativo para la protección sostenida de tales invasiones [3]. Empresas El intracelulares varios complejos de proteínas, conocidas como "inflamosomas NLR" jugar un papel central en la inmunidad innata. Entre inflamosomas, el dominio de-3 que contiene (NLRP3) inflamasoma pirina es el más estudiado [4]. células epiteliales gingivales expresan una inflamasoma NLRP3 funcional que puede ser activado por patrones moleculares de patógenos o asociado de peligros (PAMP o apaga) [4]. NLRP3 se ensambla con la ASC adaptador de proteínas (proteína mota similar a la apoptosis asociada) en un complejo multi-proteína que regula la activación de caspasa-1 y la posterior maduración del de citoquinas pro-inflamatorias interleuquina (IL) -1β y /o IL-18 en la respuesta del huésped a la infección periodontal [4]. células epiteliales gingivales pueden percibir y reconocer PAMP o DAMPS [5] a través de la estimulación de los receptores de reconocimiento de patógenos (PRRS) [1, 3], con la posterior liberación de las citoquinas proinflamatorias IL-1 e IL-18 [6]. El trabajo fundamental de Bostanci y col. [7] en primer lugar indicaron que inflamosomas NLR están involucrados en la enfermedad periodontal, que las respuestas a la infección por P. gingivalis
clínicos y los estudios in vitro
.
Interleucina-1ß (IL-1β), que pertenece una citoquina proinflamatoria a la familia IL-1, es fundamental en la defensa del huésped frente a infecciones microbianas [5] y regula las respuestas inmunes e inflamatorias innatas. IL-18 es otra citoquina proinflamatoria que pertenece a la familia de IL-1 [6], y recientemente se ha descrito como un elemento importante en el sistema inflamasoma que activa la caspasa-1 y conduce a la activación del proceso de la inflamación. La evidencia reciente ha demostrado que la maduración y secreción de IL-1β y IL-18 están regulados por el complejo inflamasoma NLRP3 que contiene el andamio NLRP3, caspasa-1 y la proteína de la mota de apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas C-terminal (ASC) [8 ]. El exceso de IL-1β y IL-18 contribuyen a un número creciente de respuestas inflamatorias humanos [9]. Aunque la IL-1β y IL-18 pertenecen a la misma familia de las citocinas, su expresión génica y secreción son regulados diferencialmente en células monocíticas humanas en respuesta a P. gingivalis
[10]. Por lo tanto, las citoquinas de la familia IL-1 pueden participar a través de diferentes vías
en el complejo patogénesis de la periodontitis [10].
P. gingivalis
, una bacteria anaerobia gram-negativa [11], se ha confirmado ser un patógeno periodontal predominante [12] y produce una serie de posibles factores de virulencia para perturbar el sistema de defensa del huésped [13] e inducir una respuesta inflamatoria en las enfermedades periodontales [14]. Sin embargo, el efecto de P. gingivalis
en la activación de la inflamasoma NLRP3 sigue siendo controvertido. El lipopolisacárido (LPS), como el componente principal de la pared celular de P. gingivalis
[15], se considera un importante factor de virulencia provocar la respuesta inflamatoria en la enfermedad periodontal [16]. Parece ser por unanimidad de acuerdo en que el tratamiento LPS de los fagocitos mononucleares, [17] macrófagos [18] y las células epiteliales orales [19] induce significativamente la expresión de NLRP3 y procaspasa-1 tanto en el ARNm y los niveles de proteína. Los estudios han demostrado que cualquier polimorfismo funcional en LPS-receptores afecta al proceso inflamatorio y los resultados clínicos de la enfermedad periodontal [20]. Los hallazgos descritos anteriormente sugieren que P. gingivalis enteros
y P. gingivalis
LPS pueden tener diferentes efectos sobre la activación del sistema de inflamasoma NLRP3.
ATP extracelular (adenosina trifosfato), uno de los primeros activadores descritos a inducir la formación inflamasoma NLRP3, se atribuye al grupo de DAMPS endógenos liberados por moribundas o heridos células [21, 22]. Su presencia es insignificante en los tejidos sanos, pero puede aumentar a niveles micromolares altas siguiente daño a los tejidos en sitios de inflamación [23]. Los estudios han demostrado ATP inducida por la caspasa-1 de activación y la posterior liberación de IL-1β [24, 25]. Además, Özlem et al. demostrado que la IL-1β no se segregó a menos LPS-tratada o células epiteliales gingivales infectados (GECS) fueron posteriormente estimulado con ATP, ATP y que no tenía ningún efecto adicional sobre NLRP3 ASC o expresión en P. gingivalis
infectado GECS [26] . Estos resultados señalan la necesidad de evaluar el papel de ATP en la activación inflamasoma NLRP3.
Por lo tanto, la activación del complejo inflamasoma NLRP3 en un modelo de célula epitelial bucal cultivaron por P. gingivalis
infección, o P. gingivalis
LPS, o la estimulación ATP se puso a prueba. Esta mayor comprensión provisto del mecanismo detrás de la inflamación periodontal.
Métodos
cultivo de células epiteliales oral
La línea celular epitelial (H413) derivada de un carcinoma oral de células escamosas humano [27], muestra la morfología celular epitelial estratificado en cultura. H413 líneas celulares clonadas se establecieron utilizando un método de dilución límite, como se describe anteriormente [28]. Las células clonadas se cultivaron en medio (JMEM, modificación Joklik, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) de Eagle esencial mínimo, penicilina /estreptomicina (100 IU /ml, Sigma) y 10% de suero de ternera fetal (FCS, CSL Limited , Victoria, Australia) a 37 ° C en 5% de CO
2 [29]. Los cultivos se recogieron con una triple expreso (reemplazo para la tripsina, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) en PBS y se subcultivaron cada 3 días.
Cultivo de células bacterianas
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 gratis () se cultivó anaeróbicamente durante 24 horas a 37 ° C en un caldo de tripticasa de soja complementado con hemina (5 mg /ml, Sigma) y la menadiona (1 mg /ml, Sigma). En el día de tratamiento con células, las bacterias se centrifugaron a 5000 rpm, y 4 ° C durante 15 min, se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS frío, pH 7,3.
De tratamiento de la célula
cultivos de células confluentes H413 (5 x 10 6 células en T-25 cm 2 frascos) se lavaron tres veces con PBS y se infectaron con P. gingivalis
a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 células bacterianas por una célula epitelial [30 ] para 2 y 4 h [31, 32], o se estimularon con 1-g /ml de lipopolisacárido ultrapura (LPS) de P. gingivalis
(Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.) en el medio de crecimiento celular para 2 y 4 h. Las células no infectadas y no estimuladas sirvieron como controles.
Los experimentos también se llevaron a cabo después de la pre-incubación de las células con 5 mM de trifosfato de adenosina (ATP) (Invivogen) para 3 h antes de la infección con P. gingivalis
o estimulación con P. gingivalis
LPS para 2 y 4 h. Las células pre-incubaron con ATP 5 mM durante 3 h eran como controles para estos grupos.
De aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Después del tratamiento, las células se recogieron en 1 ml de reactivo Trizol (Invitrogen) y ARN extraído según el protocolo Trizol. Para la transcripción inversa, los de la primera cadena de ADNc se sintetizaron con oligo (dT) 12-18 (Invitrogen), dNTP 10 mM (Promega, Madison, WI, EE.UU.), 5 × tampón de la primera posición, RNaseOUT ™ recombinante inhibidor de RNasa (Invitrogen) y superíndice ™ III transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
cebadores para genes que codifican componentes inflamasoma (NLRP3, ASC y la caspasa-1) y las citoquinas IL-1 y IL-18 (Tabla 1) fueron diseñados utilizando el software Oligo Explorer (1.1.0) y sintetizada por las tecnologías de ADN integrados (IDT, Coralville, IA, EE.UU.). Análisis en tiempo real de RT-PCR se realizaron mediante ensayos basados SYBR Green utilizando el Sistema de Stratagene MxPro-Mx3005P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Se llevaron a cabo reacciones de PCR con 2 l de muestras de ADNc diluidos, 200 nM de cada respectivo avance y retroceso cebador en una mezcla de reacción final l 20 con Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). muestras de ADNc aisladas de células H413 clon-1 no manipuladas se cuantificaron por PicoGreen kit (Invitrogen) y luego se utilizan para la construcción de las curvas de calibración (2-2000 pg) por referencia a la expresión del gen de mantenimiento que codifica β-actina. Las reacciones de PCR para cada gen se llevaron a cabo por triplicado en placas de 96 pocillos, e iniciado por activación a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de PCR de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, recocido y extensión a 60 ° C durante 30 s. Los resultados se analizaron mediante MxPro 4.10 software.Table 1 Los cebadores utilizados para tiempo real RT-PCR
Genes
Oligos
Primers5'-3 '
amplicón esperado
tamaño
números UniGene
NLRP3
F-imprimación
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216 pb
Hs.520640
R-imprimación
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
inmunoensayo de ELISA para cuantificar los niveles de IL-1β e IL -18
Un ensayo ligado a enzima inmuno-sorbente sándwich estándar (ELISA) se utilizó para medir la producción de citoquinas de IL-1β y IL-18. En pocas palabras, los sobrenadantes de ensayo (tratados con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP + P. gingivalis
o ATP + P. gingivalis
LPS) y cultivos de células de control se recogieron en cada hora ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), a continuación, partículas eliminadas por centrifugación y se analizaron inmediatamente o en alícuotas y se almacena a -20 ° C. Human IL-1β y IL-18 monoclonal específico y anticuerpos policlonales (1 mg /ml) se pre-revestido sobre placas de 96 pocillos (Corning Incorporated, EE.UU.) de alta unión en tampón de carbonato (pH 9,0) a 4 ° C durante la noche. Después de retirar la solución de recubrimiento y lavar la placa tres veces con 200 l de PBS-/pocillo, con la placa se bloqueó con albúmina de suero bovino 3% (BSA, Sigma) a 4 ° C durante la noche. Se añadieron las muestras de ensayo a pocillos por triplicado durante 90 minutos a temperatura ambiente, y seguido de lavado con 0,05% de Tween 20 /PBS (TPBS) tres veces; después se incubaron con anticuerpo secundario (IgG de ratón /conejo de cabra-anti, (DAKO, Glostrup, Dinamarca) conjugada con fosfatasa alcalina (AP)) diluido 1: 1500 en TPBS durante 2 horas a temperatura ambiente después se lavó con tampón TPBS 3 veces. conjugados unidos se detectaron por pNPP (p-nitrofenil-fosfato) y la absorbancia medida a 405 nm en un lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) después de 15-30 min de incubación a temperatura ambiente. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de un volumen igual de NaOH 1,00 M. La IL-1β humana y la IL-18 concentración de las muestras se interpretaron a partir de una curva estándar.
Inmunotransferencias para NLRP3, ASC y la caspasa-1 proteínas
a medir la expresión de proteínas inflamasoma, 2- y 4-H culturas de las diferentes condiciones (tratados con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP 3 h + P. gingivalis
o ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) se extrajeron en tampón de muestra SDS y separados por PAGE usando gradiente de 5 a 12% mini-geles, transferidos a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) y se bloquearon durante la noche con 3% de BSA (Sigma) en 0,1 M Tris tamponada solución de sales pH 7,4 (TBS). antígenos borrados se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anticuerpos anti-humanos CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, caspasa-1 (1 g /ml, Abcam, Cambridge, Reino Unido), y β-actina (0,1 mg /ml, GenTex, Zeeland, MI , EE.UU.) como control de carga en 0,05% Tween 20 /TBS durante 4 h, se lavó tres veces y posteriormente se incubaron con fosfatasa alcalina (AP) conjugada con anticuerpo secundario (de cabra anti IgG de conejo, DAKO) diluido 1: 1500 en Tween 20 /TBS durante 2 h. El anticuerpo unido se visualizó con AP sustrato (Bio-Rad) después del desarrollo de la reactividad de las proteínas de anticuerpo de control. El análisis estadístico
Todos los datos fueron analizados por t pareada
-test (media ± desviación estándar, de dos colas , 95% gama de CI) a partir de al menos tres experimentos consecutivos de tiempo real RT-PCR y ELISA. Para la cuantificación de transferencia Western, el análisis densitométrico se realizó sobre la intensidad del nivel de gris de las bandas de objetivo en relación con el control de bandas de beta-actina derivados de películas escaneadas, procesa mediante el uso de la herramienta de Gene software de análisis de imágenes (GeneToos, versión 4.02; Syngene, Cambridge, Reino Unido) [33]. P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
inflamasoma (NLRP3, ASC y la caspasa-1) expresión en respuesta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP además de P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
En todos los experimentos, no hubo diferencias significativas en la expresión de genes entre los grupos de control no estimuladas y grupos de control tratados previamente con ATP.
Como se muestra en la Fig. 1a, hubo baja regulación de la expresión génica NLRP3 después de la infección por P. gingivalis
a las 2 y 4 h en comparación con el grupo control. Por el contrario, hubo un aumento de la expresión de genes NLRP3 a las 2 h con P. gingivalis
estimulación con LPS. Además, NLRP3 fue significativamente hasta reguladas después de la pre-incubación con ATP durante 3 h, después la infección con P. gingivalis
y la estimulación con LPS de P. gingivalis
de 2 h, pero se redujo reguladas a las 4 h. En el nivel de proteína (Fig. 2), mientras que las células se incubaron durante 2 y 4 h con P. gingivalis
y P. gingivalis
estimulación LPS o el tratamiento previo con ATP durante 3 h, las tendencias de la proteólisis de NLRP3 bandas correspondían a la de la expresión génica. Esto indicaba que la activación de NLRP3 dependía de P. gingivalis
LPS o /y ATP, pero no P. gingivalis
infección. Higo. 1 expresiones de genes de NLRP3, ASC y la caspasa-1. Los cambios significativos en los genes que codifican inflamasoma NLRP3 (a), proteína adaptadora asociada (ASC) (b), y la caspasa-1 (c) con diferentes tratamientos de P. gingivalis
infección, P. gingivalis
LPS estímulos, y ATP además de P. gingivalis
o P. gingivalis
LPS en las células epiteliales H413. * P Hotel & lt; 0,05, ** P Hotel & lt; 0,01, t pareada
test
Fig. 2 Western blot que muestra la expresión de proteínas en las células epiteliales NLRP3 H413 tratadas con diferentes condiciones (P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP, más P. gingivalis
o P. gingivalis
LPS). Las tendencias de las bandas NLRP3 medidos corresponden a la expresión de genes NLRP3. * P Hotel & lt; 0,05, t pareada
test
En la figura 1b, durante el transcurso del tiempo de la infección por P. gingivalis
, hubo una disminución significativa en los niveles de ARNm de ASC (2 y 4 h) en comparación con el grupo control, y se observaron aumentos significativos de los niveles de ARNm de ASC a 2 h de la estimulación con P. gingivalis
LPS. Para más ATP P. gingivalis
infección, no había regulación de ASC a las 2 h, seguido de la regulación a la baja a las 4 h en comparación con el grupo de pretratamiento de ATP. Para ATP más P. gingivalis
estimulación con LPS, se produjo una reducción marcada de la ASC a las 4 h en comparación con el grupo pre-tratamiento ATP. Estos resultados sugieren que los cambios de ARNm de ASC son críticos en la P. gingivalis
LPS y ATP inducida por la activación NLRP3 inflamasoma. A nivel de proteínas, se midieron cambios similares en la proteína ASC (datos no presentados).
Además, como es evidente en la Fig. 1c, los datos mostraron que no hubo aumento en la caspasa-1 la expresión génica tanto en P. gingivalis
infectadas y P. gingivalis
LPS estimulan grupos. Después de que se pre-incubaron las células con ATP durante 3 h, el nivel de caspasa-1 en ambos P. gingivalis
infección (2 h) y P. gingivalis
estimulación LPS (2 y 4 h) grupos fue significativa arriba regulado en comparación con el grupo de tratamiento previo ATP. Estos resultados indican que la caspasa-1 de activación depende de la estimulación ATP en P. gingivalis
infectados o P. gingivalis
LPS células tratadas. No hubo cambios en la caspasa-1 nivel de proteínas por inmunotransferencia (datos no mostrados).
La expresión de IL-1β en respuesta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP además de P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
Del mismo modo, para determinar los cambios en la expresión de IL-1β través de la activación componentes inflamasoma, la expresión génica de IL-1β se midió por tiempo real de RT-PCR (Fig. 3a). Durante el transcurso de tiempo de P. gingivalis
infección, un aumento significativo en el nivel de mRNA pro-IL-1β se midió en 2 h en comparación con el grupo de control, que luego disminuyó al nivel de control a las 4 h. Aumento de los niveles de ARNm de pro-IL-1 también se observaron después de las células pre-tratadas con ATP durante 3 h entonces infectados por P. gingivalis
a las 2 y 4 h. No hubo cambios con las células estimuladas con LPS de P. gingivalis
y ATP, más P. gingivalis
LPS. En los sobrenadantes de cultivo de células (Fig. 3b), había una alta concentración de IL-1β madura en 2 h en los gingivalis P.
grupo infección, y a las 3 y 4 h en el ATP más P. gingivalis
grupo de la infección, que se correspondía con la expresión de genes pro-IL-1β (Fig. 3a). No hubo secreción de IL-1β detectado en los gingivalis P.
grupo de estimulación LPS, pero un aumento retrasado notable en respuesta a ATP más P. gingivalis
grupo LPS en 5 h (Fig. 3b). Estos resultados indican que P. gingivalis
infección tiene una mayor capacidad para inducir la secreción de IL-1β de P. gingivalis
LPS. Higo. 3 a cambios en los niveles pro-IL-1β de mRNA en células H413 tratadas con P. gingivalis
la infección y el tratamiento previo ATP. b Los datos del ELISA muestran madura proteína IL-1β liberado de las células H413 después de diferentes tratamientos. * P Hotel & lt; 0,05, ** P Hotel & lt; 0,01, t emparejado
-test
IL-18 expresión en respuesta a en respuesta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP más P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS México La expresión del gen de la IL-18 también se midió por tiempo real de RT-PCR (Fig. 4a). No hubo cambio en pro-IL-18 medida en los gingivalis P.
grupo infección, pero disminuyó significativamente pro-IL-18 en los gingivalis P.
grupo estímulos LPS a 2 h. Además, el pre-tratamiento de las células con ATP durante 3 h inducidas la sobre regulación de la pro-IL-18 en todos los puntos y aumentó significativamente la expresión de IL-18 tanto en el gingivalis
infección por P. gingivalis y P. grupos estímulos
LPS. En los sobrenadantes de cultivo de células (Fig. 4b), las células estimuladas con P. gingivalis
LPS tuvo un incremento significativo en la secreción de IL-maduro 18 que alcanzó un pico entre 4 h y 5 h. Esto no fue evidente en la P. gingivalis
grupo infección. Este nivel de proteína de alta no se corresponde con el nivel bajo pro-IL-18 mRNA en los P. gingivalis
grupo LPS, posiblemente como la concentración de proteínas se ve afectado por varios parámetros - principalmente la síntesis y la división [34]. Después las células se trataron previamente con ATP durante 3 h, la secreción de IL-18 madura en medios de cultivo celular se midió en el ATP más P. gingivalis
grupo infección, y demostró un aumento notable en la concentración de citoquinas. Sin embargo, en los gingivalis ATP además P.
grupo LPS, se muestra una curva bifásica, que no refleja el nivel de ARNm [34]. Estos resultados indican que P. gingivalis
infección no indujeron madura secreción de IL-18, mientras que P. gingivalis
LPS o estimulación ATP condujeron a una madura producción de IL-18. Higo. 4 a cambios en los niveles de pro-IL-18 mRNA en células H413 con diferentes tratamientos de P. gingivalis
LPS y ATP estímulos más P. gingivalis
infección o P. gingivalis
LPS. b Los datos del ELISA muestran madura proteína IL-18 liberado de las células H413 después de diferentes tratamientos. * P Hotel & lt; 0,05, ** P Hotel & lt; 0,01, t pareada
test
Los cambios en el complejo inflamasoma NLRP3 después de la estimulación con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP
Figura 5 muestra un resumen de la respuesta inmune innata frente a P. gingivalis
infección, y P. gingivalis
LPS y la estimulación ATP en este modelo celular. Cuando las células no se tratan previamente con ATP (panel izquierdo), la infección con P. gingivalis
en este modelo no desencadena la activación del complejo inflamasoma NLRP3, incluyendo NLRP3, ASC y la caspasa-1, hasta que P. gingivalis
la estimulación con LPS, a pesar de que en un corto período de tiempo 2 h (excepto la caspasa-1). En particular, la producción de IL-1β no se basó en la activación de la inflamasoma NLRP3 y está implicado en las primeras etapas de la inflamación. IL-18 de producción requiere tanto NLRP3 y activación ASC después de la estimulación con LPS de P. gingivalis
. Cuando las células se tratan previamente con ATP (panel derecho), una respuesta rápida de la activación de NLRP3 inflamasoma se muestra (2 h), con posterior producción de las citocinas IL-1 beta y IL-18 en células con P. gingivalis
infección . Sin embargo, cuando las células se estimularon con P. gingivalis
LPS, la producción de IL-1β requiere la activación de caspasa-1 y mostró un aumento retardado en respuesta al tratamiento ATP (panel derecho). Los resultados indican que P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS y ATP todos tienen diferentes efectos sobre las células epiteliales para producir la respuesta inflamatoria final. Higo. 5 Respuesta inmune innata a P. gingivalis
infección o P. gingivalis
LPS y la estimulación ATP en las células epiteliales. En el panel izquierdo, cuando las células se estimularon con P. gingivalis
infección o P. gingivalis
LPS sin ATP tratamiento previo, el complejo inflamasoma NLRP3 se inhibe hasta que P. gingivalis
estimulación LPS, a excepción de la caspasa-1 . la producción de IL-1β no es NLRP3 inflamasoma depende, sin embargo, la secreción de IL-18 se basa en NLRP3 y activación ASC. En el panel derecho, las células pretratadas con ATP, que activa NLRP3 inflamasoma, da como resultado la posterior liberación de las citocinas IL-1 e IL-18 en P. gingivalis
células infectadas. ATP también puede promover la activación de la caspasa-1 a P. gingivalis
estimulación con LPS. La secreción de IL-1β es siempre coherente con la caspasa-1 de activación tras la estimulación con P. gingivalis
Discusión LPS
En este estudio, la infección por P. gingivalis
regula a la baja componentes inflamosoma NLRP3, incluyendo NLRP3 , ASC y la caspasa-1 en las células epiteliales en todos los puntos, lo que indica que P. gingivalis
puede o bien un máximo de regular o regular a la baja la expresión NLRP3, dependiendo del tipo de células [35]. En este modelo, P. gingivalis
puede amortiguar el punto final la respuesta inmune innata mediante la inhibición de la activación de NLRP3 inflamasoma y evadir la vigilancia de acogida, que ofrece una ventaja de supervivencia para todos los organismos que cohabitan del biofilm [35]. Mientras tanto, hasta reguladas expresión génica de IL-1β después de P. gingivalis
infección, demuestra que la IL-1β es una citocina crítica en la defensa del huésped contra la infección por P. gingivalis
[5]. Por otra parte, IL-1β no es NLRP3 o caspasa-1 dependiente de [5, 36] y otros factores que también pueden influir en la secreción de la proteína IL-1β. Por lo tanto, se especula que la secreción de IL-1β en las primeras etapas de P. gingivalis
infección jugaría un papel muy importante en la lucha contra el patógeno invasor como parte de la respuesta inmune innata [37]. Esto es consistente con la conclusión de Dinarello que la IL-1β es una de las primeras citoquinas que se secretan durante las fases iniciales de la inflamación y participa en casi todos los eventos involucrados en la activación y regulación de la inflamación [36]. Este tipo de activación de la IL-1β inflamasoma-independiente puede contribuir sustancialmente a la inflamación de los tejidos [38].
En el presente estudio, LPS provoca una respuesta inmune sorprendente a través de la regulación de la expresión génica de NLRP3 y ASC, pero no caspasa -1, que indica que P. gingivalis
LPS serían un factor clave en la obtención de la respuesta inflamatoria que conduce al estado enfermo [16] y se considera un factor de virulencia importante en la patogénesis de la enfermedad periodontal. Sin embargo, la investigación Jain y de Darveau ha dilucidado que la activación de NLRP3 y ASC después de estímulos proinflamatorios tales como LPS pueden estar involucrados en la apoptosis de las células huésped, que apoya la idea de P. gingivalis
la muerte celular inducida por [39], que que facilitaría periodonto-patógenos para invadir y destruir los tejidos epiteliales. Además, la caspasa-1 se sintetiza como un zimógeno inactivo. Su activación está estrechamente regulada por inflamosomas y se asocia con una forma rápida y lítico de muerte celular conocida como pyroptosis [40]. Esto podría explicar el mecanismo que la caspasa-1 se inhibe la activación después de P. gingivalis
estimulación con LPS hasta que se activa con estímulos de ATP en el presente estudio.
ATP es una señal de socorro extracelular muy eficiente [41]. Como uno de los primeros activadores descritos para inducir la formación inflamasoma NLRP3, que se atribuye al grupo de DAMPS endógenos, que provienen de las células que mueren [22]. En este estudio, se demuestra que el ATP activa el inflamasoma NLRP3, posteriormente la liberación de citoquinas IL-1 β e IL-18, a pesar de que el efecto es muy transitoria y la concentración puede no ser lo suficientemente alta para mantener el nivel de inflamasoma NLRP3 activado. Estos resultados apoyan que extracelular ATP, como una señal de peligro, los resultados en el montaje de NLRP3 inflamasoma y la secreción de citoquinas maduras en P. gingivalis
células infectadas [26]. Además, un denominador común de ATP extracelular activación NLRP3 tiene la capacidad de formar poros de la membrana que inducen daño de integridad de la membrana o que causan la perturbación de la concentración de ion intracelular [22].
Por otra parte, después de la estimulación con ATP y P. gingivalis
LPS, la reducción de la expresión génica ASC pueden servir como un mecanismo para el cierre de la inflamación, evitando de este modo la respuesta inmune demasiado entusiastas [32]. Del mismo modo, la línea de células epiteliales (H413) utilizado en este estudio tiene la función de frenar la actividad y la secreción de IL-1β [42] para proteger la célula contra la destrucción del tejido. Esto puede explicar nuestro hallazgo que muestra un aumento aplazado de la IL-1β en respuesta a ATP, más P. gingivalis
estimulación con LPS.
Conclusiones
Los resultados indican que P. gingivalis
estimulación con LPS indujo una mayor proinflamatorias reacción de P. gingivalis
infección, y esta acción se hace más intensa después del pre-tratamiento de la ATP. Estos resultados pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre los objetivos de las estrategias terapéuticas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como la periodontitis
abreviaciones
ASC:.
Apoptosis asociada a la proteína de la mota similar
ATP: adenosina trifosfato
DAMPS:
peligro asociado-patrones moleculares
NLRP3:
Nod receptor-como (NLR) de la familia, el dominio que contiene 3-pirina
PAMP:
patógenos asociados a patrones moleculares
P . gingivalis
: Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis
LPS:.
lipopolisacárido de P. gingivalis
Declaraciones
Agradecimientos
agradecemos al profesor Neil Hunter y el Dr. Ping Ye como su técnico y de laboratorio apoya. También se agradece a Dr. Gao Jinlong y el Dr. Zhou Xiaoyan para proporcionar P. gingivalis
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