diferente
Resumen Antecedentes
regeneración de los tejidos periodontales es un objetivo importante de la terapia periodontal. Las células madre de la pulpa dental (DPSCs) muestran propiedades de células mesenquimales con potencial para la ingeniería de tejido dental. derivado de la matriz del esmalte (EMD) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) son ejemplos de materiales que actúan como moléculas de señalización para mejorar la regeneración periodontal. trióxido mineral agregado (MTA) se ha demostrado ser biocompatible y parece tener algunas propiedades osteoconductivas. El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de EMD, MTA, y PDGF en DPSC diferenciación osteogénica.
Métodos
DPSCs humanos se cultivaron en un medio que contiene EMD, MTA, o PDGF. También se establecieron grupos de control. Evaluación de la osteogénesis logrado se llevó a cabo mediante análisis por ordenador de la fosfatasa alcalina (ALP) teñidas cámaras, y análisis espectrofotométrico de nódulos mineralizados S-manchado rojo de alizarina.
Resultados
EMD aumentó significativamente las cantidades de expresión de ALP y la mineralización en comparación con todos los otros grupos (P
& lt; 0,05). Mientras tanto, MTA dio resultados variables con ligeros incrementos en ciertos parámetros de diferenciación, y PDGF no mostró aumento significativo en la diferenciación alcanzado.
Conclusiones
EMD mostró una capacidad muy fuerte osteogénico en comparación con PDGF y MTA, y las presentes resultados proporcionan apoyo para su uso en la regeneración periodontal.
Palabras clave
células madre de la pulpa dental osteogénesis MTA EMD PDG Antecedentes Francia El principal objetivo de la terapia periodontal es regenerar las estructuras de soporte del diente destruido por la enfermedad periodontal [1]. la ingeniería de tejidos periodontales implica interacciones complejas entre diferentes células y moléculas de señalización, así como andamios biológicos [2]. Hoteles en un intento de imitar los eventos originales de desarrollo, el uso integrado de poblaciones de células precursoras con estimulantes biológicos específicos está bajo investigación [ ,,,0],3, 4]. Las células madre representan células no especializadas primitivas con amplias capacidades para la diferenciación y regeneración de tejidos. Hasta la fecha, las células madre mesenquimales se han aislado con éxito de varios órganos del cuerpo [5], incluyendo múltiples tejidos con orígenes dentales [6-9]. Se encontraron Tales células madre derivadas de tejido dental para retener potente capacidad de diferenciación específica en células formadoras de tejidos dentales [6, 10, 11]. Gronthos y sus colegas aislaron con éxito células madre de la pulpa dental humana (DPSCs), y demostró tanto su multipotencia y la capacidad de auto-renovación [11, 12]. Estudios posteriores confirmaron sus hallazgos [13, 14]. Este multipotencia, además de su accesibilidad relativa, hizo DPSCs una fuente atractiva de células para su aplicación en la medicina regenerativa [15-18]. De hecho, varios trabajos han demostrado su superioridad en diferentes aspectos, incluyendo la diferenciación osteogénica [19, 20], que apoya su uso para la regeneración de defectos craneofaciales [21, 22], así como defectos óseos alveolares [23, 24]. Además, los orígenes embrionarios similares de células de la pulpa dental y periodontal células [25] y su presencia dentro de capas de protección de la estructura del diente han alentado a su uso para la regeneración del tejido periodontal [26, 27].
Estudios sobre la ingeniería de tejidos han utilizado mediadores biológicos para mejorar selectivamente el reclutamiento de poblaciones celulares en las heridas periodontales [28]. derivado de la matriz del esmalte (DME) es una proteína cosechada de los dientes en desarrollo de la especie porcina que se ha informado de inducir formación de cemento y la regeneración periodontal [29]. A nivel celular, DME fue demostrado tener efectos reguladores sobre múltiples tipos de células periodontales [28, 30].
Del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) es un factor regulador muy potente que inicia los eventos de curación casi todas las heridas. La función principal de PDGF es estimular la replicación celular (mitogénesis) de células madre capaces de curación y células osteoprogenitoras parcialmente diferenciadas, que son parte del tejido conectivo-cicatrización ósea celular maquillaje [31]. Los aumentos significativos en el hueso y la formación de cemento se han reportado histológicamente [32]. A nivel celular, PDGF aumentó el número de células de la síntesis de colágeno [33] y estimuló sialoproteína ósea transcripción [34].
Otro material con la capacidad de inducir la regeneración es agregado de trióxido mineral (MTA). MTA es una mezcla de silicato dicálcico, silicato tricálcico, aluminato tricálcico, yeso, y tetracálcico aluminoferrita [35]. Torabinejad et al. [36] informó de un rendimiento biológico favorable de MTA cuando está en contacto directo con el hueso, a través de la deposición y formación de apatito de hidroxilo en su superficie. También se encontró que el material para mejorar la producción celular de colágeno de tipo I, osteocalcina, fosfatasa alcalina (ALP), sialoproteína ósea, osteopontina y [37]. Una revisión sistemática de las respuestas histológicas del periodonto al material llegó a la conclusión de que la MTA promueve la curación hacia la regeneración [38].
Los resultados anteriores sugieren actuaciones clínicas similares para los tres materiales con intentos anteriores para las comparaciones directas. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue examinar y comparar los efectos de EMD, PDGF, y el MTA en la diferenciación osteogénica de DPSCs.
Resultados
Célula de aislamiento y caracterización
células madre de la pulpa dental en la primaria culturas comenzaron a aparecer en 5-14 días y se convirtieron unido a las superficies de las placas (Fig. 1a). Las células de la segunda paso formado con éxito múltiples colonias, con alrededor de 50 células por colonia (Fig. 1B). El flujo expresiones positivas análisis de citometría confirmados de marcadores asociados a las células del estroma, con expresiones negativas de marcadores hematopoyéticos y endoteliales (Fig. 1G). Las células que se sometieron a la inducción osteogénica mostraron un aumento de la tinción de ALP comparación con las células de control negativo (Fig. 1c, d), mientras que las células cultivadas en el medio adipogénico exhibieron varias O-positivo rojo gránulos de lípidos de aceite (Fig. 1e, f). Higo. 1 invertidos imágenes microscópicas de luz que muestran un dentales células madre de la pulpa mesenquimales en cultivo primario, Ampliación 5 ×. b unidad formadora de colonias de fibroblastos (CFU-F) de aumento de 5 x, c, d tinción de fosfatasa alcalina para DPSCs 14 días después de la osteoinducción (c) frente al control negativo (d), una lupa de 10 aumentos, y la tinción rojo O Aceite de DPSCs 14 días después inducción adipogénico (e) versus control negativo (f), ampliación de 40 aumentos. Los resultados del análisis FACS g de una línea de células de la pulpa dental representante aplicación de Windows material
tinción ALP
Las muestras mostraron diferentes grados de tinción ALP (Fig. 2). ANOVA de una vía reveló diferencias significativas entre los grupos de comparación (P & lt; 0,0001) (Tabla 1). Higo. 2 imágenes Scanoscope para ALP tiñeron diferentes grupos experimentales de DPSCs. La imagen interna representa el campo evaluado, lo que hace alrededor de 1/4 de la imagen. Aumento original 1,4 ×. La barra de escala 1 mm. Un control negativo, control de referencia b (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabla 1 representa los resultados del análisis de la fosfatasa alcalina para todos los grupos de
material /Grupo
media
Desviación Estándar (SD)
post hoc test de Tukey para la significación entre los grupos
Porcentaje total positivo
Control negativo
16.29
4,95
OT *
EMD *
MTA *
PDGF *
OT
72.92
9.24
negativo control*
EMD*
MTA*
PDGF*
EMD
95.59
4.69
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
64.19
9.95
-ve control*
OT*
EMD*
PDGF*
PDGF
48.80
12.62
Negative * Control
OT *
EMD *
MTA *
media densidad óptica
negativo control
0.18
0.01
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
0.26
0.02
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
0.35
0.03
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.26
0.02
Negative control*
OT
EMD*
PDGF
PDGF
0.24
0.03
Negative * Control
OT *
EMD *
MTA
registro histológico
negativo control
20.633
7.034
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
132.974
22.944
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
221.992
23.818
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
114.340
20.914
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
82.330
28.254
Negative * Control
OT *
EMD *
MTA *
comparación NBIntergroup fue estadísticamente significativa mediante la prueba de ANOVA, P Hotel & lt; 0,0001
* Indica la significación estadística con P Hotel & lt; 0.05
para todos los parámetros examinados, EMD fue significativamente mayor que todos los otros grupos (P & lt; 0,05). EMD reveló significativamente mayor porcentaje de área total de tinción positiva, la densidad óptica media, y las puntuaciones histológicas (95,6 ± 4,7%, 0,35 ± 0,03, 221,99 ± 23,8) que MTA (64,19%, 0,26 ± 0,02, 114,34 ± 20,90; P & lt; 0,05) PDGF (48,8% ± 12,62, 0,24 ± 0,02, 82,33 ± 28,3; P & lt; 0,05). y de control de referencia
en contraste, MTA dieron resultados inconsistentes, aunque aumentó la actividad de ALP en una manera similar a la de control de referencia cuando evaluadas por la densidad óptica media, el material dio lugar a reducciones de los otros parámetros en comparación con el control de referencia, a pesar de estas reducciones no siempre fueron significativas (P
& gt; 0,05)
con respecto a PDGF, la expresión de ALP en general. revelado resultados más bajos en comparación con el control de referencia para los tres parámetros, respectivamente, y estas reducciones fueron consistentemente significativa (P & lt; 0,05; Tabla 1): perfil de alizarina S tinción roja
Hubo diferencias obvias en las cantidades de mineralización entre. los grupos (Fig. 3). ANOVA de una vía reveló estas diferencias significativas (P
& lt; 0,0001) (Tabla 2). Higo. 3 Imagen invertida del microscopio óptico presentar rojo de alizarina S tinción para diferentes DPSCs grupos experimentales. aumento original × 10. Barra de escala de 200 micras. Un control negativo, control de referencia b (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabla 2 representa la velocidad media de absorbencia rojo de alizarina S cámaras manchadas de todos los grupos de materiales
/Grupo
promedio
desviación estándar (SD)
prueba post hoc de Tukey para la significación entre los grupos
negativos control
0.079
0.007
OT
EMD*
MTA*
PDGF
OT
0.107
0.016
Negative control
EMD*
MTA
PDGF
EMD
1.197
0.132
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.163
0.117
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
0.097
0.010
Negative Control
OT
EMD *
MTA *
OT
control de referencia para la osteoinducción , EMD
Emdogain, MTA
agregado de trióxido mineral, PDGF
plaquetas de crecimiento derivado de factor BB de
comparación NBIntergroup fue estadísticamente significativa mediante la prueba de ANOVA, P Hotel & lt; 0,0001
* Indica la significación estadística con P Hotel & lt; 0.05 Francia El grupo EMD tuvieron un aumento significativo del importe de la formación de nódulos mineralizados en comparación con todos los demás grupos, dando una absorbancia media de 1,2 ± 0,13 (
P & lt; 0,05). Francia El grupo MTA aumentado de manera significativa cantidad de mineralización (absorbancia: 0,16 ± 0,12)., con relación al grupo control negativo (0,08 ± 0,01), y el grupo de PDGF (0,09 ± 0,01): perfil a pesar de la absorbancia del grupo de PDGF media (0,09 ± 0,01) parecía ser ligeramente diferente de los otros grupos, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (P Hotel & gt; 0,05; Tabla 2).
Discusión
En este estudio, éxito en el aislamiento de las células de la pulpa dental se logró a través de la aplicación del enzimática la digestión con ciertas modificaciones en el protocolo de Gronthos et al. [11]. Las células obtenidas se sometieron a varias investigaciones para evaluar sus propiedades. Según la Sociedad Internacional de Terapia Celular [39], los criterios mínimos para la definición de las células multipotentes mesenquimales estromales incluyen: (1) la adhesión a platos de plástico; (2) potencial de diferenciación multipotentes; y (3) expresión de marcadores de la superficie estromal específicos (CD73, CD90, CD105) con la falta de expresión de marcadores hematopoyéticos (CD45, CD34, CD14 y /o CD11b, CD19, CD79α) y el marcador de HLA-DR. Las células aisladas en este estudio presentan todas las características anteriores.
Se evaluaron diferentes concentraciones de material, y se seleccionaron las concentraciones con el mejor diferenciación. Estas concentraciones fueron 200 mg /ml para EMD, 5 ng /ml para PDGF, y 0,05 mg /ml para la MTA. Las mismas concentraciones se utilizaron previamente en otros estudios [34, 40, 41]. En este estudio, se seleccionaron análisis por ordenador para la actividad de ALP y una técnica de evaluación semicuantitativa de alizarina S tinción de rojo, como se informó de estas dos técnicas para dar resultados con sensibilidad relativa, y se han aplicado en los estudios anteriores [42, 43].
Para EMD, los resultados revelaron un aumento significativo en la expresión de ALP y mejora la mineralización abundante después de su aplicación. Estos resultados están de acuerdo con otros estudios que evalúan los efectos de este material en varias líneas celulares [40, 44-48]. Duan et al. [44] encontró que EMD aumentó la diferenciación osteogénica de células madre pluripotentes inducidas, como se evidencia por el aumento de la expresión de ARNm RUNX2. Kemoun et al. [45, 46] evaluaron los efectos de la EMD en las células foliculares [45] y las células madre del ligamento periodontal [46]. En ambos estudios, se encontró EMD para mejorar la liberación de ALP y la deposición de calcio, además de la elevación de varios marcadores de mineralización. Otro estudio realizado por Guven et al. [47] encontró que Emdogain era el material más eficaz para mejorar tanto la proliferación y la diferenciación odontogénico de células madre germinales diente humano a través de la evaluación de la actividad ALP, la tinción de Von Kossa, y análisis RT-PCR para la dentina sialophosphoprotein (DSPP), y la inmunotinción para colágeno tipo I y DSPP. Un estudio realizado por Wang et al. [48] encontró que Emdogain mejora la mineralización de DPSCs así como su expresión de marcadores osteogénica /odontogénico. Sin embargo, los estudios con resultados contradictorios también están disponibles [49, 50]. Se informó que EMD podría no tener efectos apreciables sobre la diferenciación osteoblástica en las células del ligamento periodontal [49] o las células de médula ósea de rata [50]. Aunque el mecanismo de control exacto no está claro, estos efectos fueron explicados por las diferencias en los grados de inmadurez celular, es decir, el material fue pensado para aumentar la proliferación celular de las células más inmaduras, pero la diferenciación de las células en etapas posteriores de la madurez [51].
En el presente estudio, la MTA dio resultados inconsistentes. El material revelado mejora de la mineralización en comparación con el control de referencia, las disminuciones de determinados parámetros (ALP por ciento de área total de tinción positiva y la puntuación histológica), y mantenimiento de otros parámetros (densidad óptica media). Aunque Yasuda et al. [52] y Lee et al. [53] informó de que MTA aumentó la producción de ALP y /o la formación de nódulos mineralizados en comparación con las células de control, tanto Koh et al. [54] y Nakayama et al. [55] informó de la expresión de ALP similar entre las células tratadas con MTA y células de control negativo. Estas inconsistencias sugieren que una mayor evaluación de los diferentes parámetros que guían y que afectan el rendimiento de este material está garantizado. Vaya con respecto a PDGF en el presente estudio, se observó que la expresión de ALP en general, reveló resultados más bajos en comparación con el grupo control negativo así como todos los otros grupos de materiales, y las diferencias fueron siempre significativos. Independientemente de la acción del material de mejora en proliferativa, PDGF-BB parecía tener ningún beneficio adicional para la diferenciación osteogénica, de acuerdo con los parámetros evaluados en este estudio. Varios otros autores observaron resultados similares [33, 56]. De hecho, PDGF mejorada degradación del colágeno óseo [33], y interrumpido o la formación de la matriz ósea inhibida [56]. Nakashima et al. [57] encontró que el PDGF incrementa la síntesis de ADN, mientras que provoca una inhibición del 40-65% de la actividad de la ALP. Tanaka y Liang [58] informaron de que el material ejerce ningún efecto sobre la actividad de la ALP celular o la síntesis de colágeno. Yokose et al. [59] informó de que el PDGF-BB redujo significativamente la actividad de la ALP de DPSCs.
Conclusiones interacciones de superficie celular
favorables con EMD se demostraron, incluyendo la expresión de ALP y abundante mineralización. EMD dio resultados superiores en comparación con MTA y PDGF con respecto a la diferenciación osteogénica de DPSCs. Los efectos de la MTA en la osteogénesis de DPSCs no fueron concluyentes y se requieren estudios adicionales. Además, nuestros datos sobre PDGF no apoyaron su capacidad para inducir la diferenciación osteogénica de DPSCs. Sin embargo, PDGF hizo facilitar la unión y el crecimiento celular, lo que sugiere un mecanismo de acción diferente que merece una mayor investigación.
Métodos
aislamiento de células madre
DPSCs humanos fueron aislados y caracterizados por los autores en la Unidad de Células Madre, rey Saud University, Reino de Arabia Saudita (datos no publicados). Los dientes se obtuvieron de pacientes después de que siempre y firmaron un consentimiento informado, de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité de ética institucional (Facultad de Odontología del Centro de Investigación-CDRC).
En pocas palabras, el contenido de pulpa de los dientes molares recién extraídos se combinaron y se sometieron a 20-40 minutos de digestión enzimática utilizando colagenasa tipo I (1 mg /ml) y dispasa (5000 unidades caseinolíticas). Posteriormente, se dejó que las células de crecer bajo condiciones de cultivo celular normales (37 ° C, 5% de CO
2), utilizando medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS), 1% penicilina estreptomicina (Pen-Streptoc), y 1% de aminoácidos no esenciales (todos adquiridos de Gibco-Invitrogen, EE.UU.).
Caracterización de las células madre formadoras de colonias unidad
-fibroblastos (CFU-F)
CFU -F fueron evaluados mediante el cultivo de 2,5 × 10 3 células en el segundo pasaje en placas de cultivo de 6 cm. Al día 14, las células se fijaron con paraformaldehído al 1%, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta, y se sometieron a la evaluación microscópica utilizando un microscopio de contraste de fase de luz invertido (Zeiss, Leica, Alemania).
Citometría de flujo
Cuarta células de paso (1.5 × 10 6) se lavaron con tampón FACS (1 x solución salina tamponada con fosfato, 5% de FBS, 0,1% de azida de sodio), y se diluyeron en 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, el ratón conjugado con PE anti-humana de CD146, CD73, CD29 y HLA-DR, FITC de ratón conjugado anti-CD34 humano, ratón CD90, CD45, CD13, CD31 y, y APC-conjugado anti-CD105 humano, CD14, y anticuerpos CD44 se prepararon en la oscuridad (todos de BD Biosciences, EE.UU., excepto para el anticuerpo monoclonal contra CD105 humano, que se adquirió de amp I +; D Systems, EE.UU.) y utilizada. En cada tubo de FACS, 100 l de células se mezcló con 10 l de la correspondiente anticuerpo, y se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Las expresiones de marcadores celulares se evaluaron utilizando un citómetro de citómetro de flujo Becton Dickinson (BD Biosciences, EE.UU.), y se analizaron los datos resultantes usando la versión de la célula de Quest Software Pro 3.3, la biociencia BD, EE.UU.).
Diferenciación osteogénica y adipogénica
las células en el cuarto paso se cultivaron en placas de 6 pocillos. En el 60-70% de confluencia, la diferenciación osteogénica se indujo usando medio de osteoinducción preparado de acuerdo con el protocolo de Vishnubalaji et al. [60], y compuesto de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% Pen-Strept, /ml de ácido L-ascórbico 50 mg (Wako Chemicals GmbH, Alemania), sal disódica de fosfato de glicerol 10 mM (β-glicerofosfato), 10 nM dexametasona y 10 nM calcitriol (1α, 25-dihidroxivitamina D3) (Sigma, UK). Las células mantenidas en el medio de cultivo regular sirvieron como controles. La osteogénesis resultante se evaluó después de 14 días a través de la tinción citoquímica para ALP.
Diferenciación adipogénica también se indujo utilizando medio adipogénico estándar [60], compuesto de DMEM suplementado con 10% FBS, suero de caballo al 10%, 1% Pen-Strept, 100 nM de dexametasona, 0,45 mM isobutil metil xantina, 3 mg /ml de insulina (todo adquirido de Sigma, Reino Unido) y 1 M de rosiglitazona (BRL49653; Novo Nordisk, Dinamarca). La diferenciación resultante se evaluó a los 14 días mediante el uso de aceite de tinción O rojo.
Aplicación Materiales
Inicialmente, un estudio piloto se llevó a cabo para evaluar tres concentraciones diferentes para cada material, y las concentraciones obteniéndose la mayor cantidad de diferenciación fueron seleccionados para las comparaciones (Fig. 4). Posteriormente, las células en el cuarto paso se cultivaron y se dividieron en cinco grupos, como se muestra a continuación. Higo. 4 imágenes Scanoscope para ALP tiñeron diferentes grupos experimentales de DPSCs. Aumento original 1,4 ×. La barra de escala 1 mm. a, b, c EMD a concentraciones de 50, 100, 200 mg /ml respectivamente. d, e, f PDGF a concentraciones de 5, 10, 20 ng /ml respectivamente. g, h, i MTA en concentraciones de 0,02, 0,2, 2,0 mg /ml respectivamente. Células mantenidas en el medio de cultivo celular regular para todo el experimento (DMEM con 20% FBS, 1% Pen-Strept, 1% no: j Porcentaje de área total tinción positiva para diferentes concentraciones de cada material
1. control negativo examinó aminoácidos esenciales).
2. Control de Referencia (OT): Las células cultivadas en el medio de osteoinducción, preparado de acuerdo con el protocolo de Vishnubalaji et al. [60].
3. Grupo EMD: Las células cultivadas en el medio osteoinducción suplementado con 200 mg /ml EMD (Straumann, EE.UU.) guía empresas 4.. Grupo PDGF: Las células cultivadas en el medio osteoinducción suplementado con 5 ng /ml de PDGF-BB (Osteohealth, EE.UU.) guía empresas 5.. Grupo MTA:. Las células cultivadas en el medio osteoinducción suplementado con 0,02 mg /ml MTA (Dentsply, EE.UU.)
La diferenciación alcanzado fue analizada por la evaluación de la expresión a través de ALP tinción ALP y la deposición de iones de calcio a través de la alizarina rojo S tinción.
actividad ALP
las células se sembraron en portaobjetos de 8 cámaras en la densidad de 0,02 × 10 6 células /cámara y deja que se unan y crecer a 50% de confluencia. A partir de entonces, los portaobjetos se dividieron en cinco grupos diferentes a los mencionados anteriormente y se aplicó regular o medio osteogénico en consecuencia. En el día 5, las células se fijaron y se tiñeron para ALP con solución de naftol-AS-TR-fosfato (Sigma, UK). A continuación, las cámaras fueron evaluados bajo un microscopio digital de alta resolución en cámaras de todo el manchadas fueron escaneados con un escáner de diapositivas ScanScope (Aperio Technologies Inc., EE.UU.) a 40 × aumento del objetivo. Las imágenes digitales de las seis cámaras diferentes de cada ensayo fueron vistos y analizados usando las funciones de visualización y análisis de imágenes herramientas del software de Image Ámbito Aperio (Versión 10.2.2.2352; Aperio Technologies Inc.). Todo el experimento se repitió tres veces de forma independiente, dando un total de 18 cámaras /grupo para el análisis. Los resultados de la salida de análisis fueron exportados a hojas de Excel, centrándose principalmente en la zona porcentaje total tinción positiva, la densidad óptica media, y la puntuación histológica como los parámetros para el análisis estadístico y la comparación.
Rojo de alizarina S tinción
De la misma manera , las células se cultivaron en placas de 24 pocillos, y se establecieron los cinco grupos diferentes. Los medios fueron reemplazados dos veces por semana con medios regulares o osteogénicas recién hechos. En el día 12, las células se tiñeron con 40 mM AR-S rojo de alizarina (Sigma, Reino Unido), y se sometieron a evaluación espectrofotométrica de acuerdo con el protocolo de Gregory et al. [61] utilizando un lector de microplacas (Gen5 ™, versión 1.10; BioTek Instruments Inc., EE.UU.) para medir la absorbancia a 405 nM. El mismo protocolo se repitió tres veces independientemente, dando nueve lecturas diferentes para cada prueba gratis Análisis estadístico
datos se analizaron utilizando el software estadístico SPSS. (Versión 16.0; SPSS, EE.UU.). La estadística descriptiva (media y desviación estándar) se utiliza para describir las variables de resultados cuantitativos. Se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para comparar los valores medios de las variables de resultados a través de las variables categóricas (grupos), seguido de una prueba post-hoc de Tukey para comparaciones por pares. Los valores de p & lt;
0,05 fueron considerados estadísticamente significativos
abreviaciones
ALP:.
Fosfatasa alcalina
AR-S:
rojo de alizarina S mancha
BRL:
rosiglitazona
° C:
grado celsius o grados centígrados
CD:
grupo de diferenciación
CFU-F:
formadoras de colonias unidad de fibroblastos
DMEM:
Eagle modificado por Dulbecco (con alto contenido de glucosa, sodio y pyrovate L-glutamina)
ADN:
ácido desoxi-ribionucleic
DPSCs :
células madre de pulpa dental
EMD:
derivados de la matriz del esmalte
FACS:
fluorescencia de células activadas por la clasificación (análisis de citometría de flujo)
FBS: suero bovino fetal
FITC:
fluorescencia iso thioocyanide
Mg:
Miligramos
ml: Read Milliliter
l: microlitros
ARNm:
ácido ribonucleico mensajero
MTA:
trióxido mineral agregado
< DFN> PBS: tampón fosfato salino
Pen /Streptoc:
penicilina /estreptomicina
PDGF:
plaquetas factor de crecimiento derivado de
ARNm: ácido ribonucleico
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención No. 09-BIO740 -20 del plan Nacional de Ciencias y Tecnología Programa, Reino de Arabia Saudita. Agradecemos a todo el personal de la Unidad de Células Madre, Departamento de Anatomía de la Universidad Rey Saud, Riad para brindar su apoyo técnico en este estudio. Logo articles abierto AccessThis se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento 4.0 Licencia Internacional (http : //creativecommons. org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que le dan el crédito correspondiente al autor (s original) y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http:. //Creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
de la competencia. Grupos de interés los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
autores contribuciones
SA participó en diferentes aspectos de los estudios de laboratorio, incluyendo la caracterización de células, y la aplicación de materiales, además de la preparación del proyecto principal para este papel. NA ayudó en el desarrollo de la idea principal de la investigación, prepara el diseño básico del estudio, y siempre revisión crítica para toda la escritura del papel. Además, organizó para la obtención de los materiales de prueba dentales. AD proporcionó apoyo técnico general, especialmente en la caracterización celular y análisis de diferenciación, además de su papel en conseguir todos los materiales básicos de laboratorio. MN han ayudado en osteogénico celular y los estudios de diferenciación adipogénicos, y supervisó la redacción de la parte técnica del estudio (materiales y métodos). Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
