Resumen Antecedentes
En estudios recientes, la salud periodontal se ha relacionado con el sobrepeso y /u obesidad. Entre las bacterias orales comunes, Selenomonas noxia
ha sido implicado en la conversión de la salud periodontal a la enfermedad, y Selenomonas
especies también se han encontrado en las úlceras gástricas. El objetivo de este estudio fue desarrollar y validar una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de ensayo (qPCR) para la detección específica y rápida de S. noxia
.
Métodos
Dos pares de cebadores de oligonucleótidos y una sonda fueron diseñados y probado para determinar la señal de amplificación óptima con tres cepas de S. noxia
. El ensayo de PCR fue probado contra catorce organismos no objetivo, incluyendo Selenomonads orales estrechamente relacionadas, una bacteria filogenéticamente estrechamente relacionados, y dos bacterias orales comúnmente aisladas.
Resultados
Uno de los conjuntos de cebadores fue más sensible en la detección de la diana organismo y fue seleccionado para la optimización y validación de los experimentos. Los cebadores y la sonda diseñados amplifican el organismo diana con 100% de especificidad. inhibición de la PCR se observó con un control positivo interno, y se resolvió la inhibición diluyendo el extracto de ADN.
Conclusiones
El ensayo qPCR diseñado en este estudio se puede utilizar para detectar específicamente S. noxia
en el entorno clínico y en futuras investigaciones que implica la detección mejorada de S. noxia
. El ensayo también se puede utilizar en los estudios epidemiológicos para comprender el papel de S. noxia
en los procesos de enfermedad, incluyendo, pero no limitado a, la salud oral y la obesidad de origen infeccioso.
Palabras clave
bacterias salud y la enfermedad periodontal Selenomonas noxia
Antecedentes PCR Francia El género Selenomonas
fue descrita por primera vez en 1683 por Antony Van Leeuwenhoek como una bacteria con forma de media luna, de una muestra bucal [1]. Selenomonas noxia
es una bacteria que coloniza la cavidad oral humana, y se ha asociado repetidamente con la enfermedad periodontal [2-4]. Esta especie se compone de anaerobia obligatoriamente, móviles, no formadoras de esporas, gram negativos varillas [5]. S. noxia
fue una de las cinco nuevas especies del género Selenomonas
, Phylum Firmicutes, caracterizado por primera vez por Moore et al
. en 1987 [5]. Las enfermedades periodontales son probablemente una de las infecciones bacterianas más comunes en los seres humanos. Sólo unos pocos de los varios cientos de especies de microorganismos que han sido identificados dentro del surco gingival y de la bolsa periodontal se cree que desempeñan un papel importante en la iniciación y la progresión de la enfermedad [6], y S. noxia
estaba entre el nuevos organismos añadidos como un patógeno periodontal putativo [7]. Muy poca literatura está disponible en la patogenicidad de S. noxia
, pero el género Selenomonas
se ha encontrado en proporciones más altas en comparación con otras bacterias orales en casos de periodontitis agresiva generalizada (GAP). Además, S. noxia
se ha detectado el uso de técnicas de cultivo y en ambos periodontitis crónica (PC) y GAP lesiones del ADN basada en [8, 9]. En un estudio realizado por Kumar et al.
[10], las muestras asociadas a la enfermedad se obtuvieron de los cuatro sitios más profundos en sujetos con periodontitis establecida, y las especies más numerosas de 16S análisis clonal pertenecían a los géneros Selenomonas
, Streptococcus
, veillonellas
, Campylobacter
, y Peptostreptococcus
. Mientras Selenomonas
clones orales no se asociaron con la enfermedad [8], otros estudios han sugerido que S. noxia
se encuentra entre las principales especies asociadas con los sitios de conversión de la salud periodontal de la enfermedad periodontal [3, 11]. Por otra parte, en un informe reciente realizado por Andersen et al.
[12], se encontró una Helicobacter
-Como Organismo (HLO) en la sección histológica de una úlcera gástrica humana a ser un Selenomonas
especies. La literatura y los estudios realizados hasta la fecha no dan datos precisos sobre la prevalencia total de S. noxia Hoteles en individuos sanos.
Las técnicas moleculares han proporcionado una buena base en la identificación del papel de Selenomonas
especies como la salud periodontal indicadores [8, 13]. En un estudio utilizando sondas de oligonucleótidos dirigidos a la mayoría de todos los aislamientos orales para explorar la distribución espacial de las especies Selenomonas
en biofilms subgingivales, una relativamente baja prevalencia de Selenomonas
se muestra en las BPA y los pacientes con PC. Sin embargo, una fluorescencia in situ
hibridación (FISH) análisis de la misma biofilm mostró que Selenomonas
hizo una contribución relevante para la organización estructural de los biofilms [9].
Además de la función de la S . noxia Hoteles en salud oral, un estudio realizado por Goodson y col.
[14] da a entender que S. noxia
puede estar asociado con la obesidad. El estudio demostró que el 98,4% de las personas con sobrepeso fueron correctamente identificados por la presencia de la única bacteria, S. noxia
. Este hallazgo proporciona una pista para una mejor comprensión de la asociación y /o la presencia de S. noxia
en la cavidad oral y el desarrollo de la obesidad. Recientemente, ha habido un creciente interés en la comprensión de la relación entre la diversidad microbiana humana y el sobrepeso o la obesidad. Teniendo en cuenta la probabilidad de que la enfermedad periodontal puede contribuir al desarrollo de la obesidad, el papel del microbioma oral en la obesidad ha ido ganando más atención [14]. El mecanismo por el cual las bacterias orales que contribuyen al desarrollo de la obesidad se explica en al menos tres formas: el aumento de la eficiencia metabólica, el aumento de apetito, y /o redirigir el metabolismo energético [14] México La creciente importancia clínica y epidemiológica de S. noxia.
requiere el desarrollo de un método de detección rápida. Hasta ahora, los métodos de detección de S. noxia
se han limitado a ensayos de hibridación de ADN y la cultura. El análisis de la cultura Selenomonas
spp. no es común en el laboratorio de microbiología clínica y puede llevar tiempo porque es una bacteria anaerobia obligatoriamente fastidioso. Con la técnica de cultivo anaeróbico, la discrepancia entre la recuperación salival y la presencia subgingival ha sido significativa, lo que hace este enfoque inadecuado para su uso en el diagnóstico microbiano de pacientes con periodontitis [15]. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con técnica de detección de especies cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos puede mejorar la detección rápida de S. noxia
. El método de PCR cuantitativa (qPCR) combina la química PCR con detección de sonda fluorescente de producto amplificado en el mismo recipiente de reacción, y se completa en dos horas o menos. El objetivo de este estudio fue desarrollar y validar un ensayo qPCR para la detección específica de S. noxia
. Detección mejorada de Selenomonas noxia Hoteles en la microflora oral es el primer paso en la aclaración de su implicación en la obesidad y las enfermedades humanas. Métodos
organismos de prueba
tres cepas diferentes de S. noxia
se obtuvieron
de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se utiliza para evaluar el protocolo de PCR diseñados (Tabla 1). Catorce organismos no objetivo, incluyendo otros Selenomonads orales estrechamente relacionadas, una bacteria filogenéticamente estrechamente relacionados, y dos bacterias orales que se encuentran comúnmente, España se obtuvieron a partir de ATCC y se utilizaron para probar la especificidad de los cebadores y la sonda (Tabla 1) diseñado. Tabla 1 Los organismos de ensayo
especies bacterianas
ATCC #
Bacillus cereus
14579
Candida albicans
14053
Centipeda periodontii
35019
Klebsiella pneumoniae
4352
Lactobacillus acidophilus
3456
Pectinatus cervisiiphilus
29359
Pseudomonas aeruginosa
27853
Selenomonas artemidis
43528
Selenomonas dianae
43527
Selenomonas flueggei
43531
Selenomonas infelix
43532
Selenomonas noxia
43541
Selenomonas noxia
51893
Selenomonas noxia
700.225
Selenomonas sputigena
35185
Staphylococcus aureus
25923
Streptococcus mutans
25175
extracción de ADN microbiano
ADN fue extraído utilizando el QIAamp® DNA Mini Kit ( Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, con los siguientes cambios; Se utilizaron 100 l de volumen de muestra para la extracción y el volumen de elución final fue 200 l. Las muestras seleccionadas se extrajeron con el kit de aislamiento de ADN UltraClean® suelo (MoBio, Carlsbad, CA). Los extractos de ADN se almacenaron a -70 ° C hasta que esté listo para su uso. México La presencia y cantidad de ADN en cada muestra se midió con un espectrofotómetro Spectronic GENESYS ™ 10 Bio UV-Visible utilizando el accesorio-0,2 mm de paso de luz nanocélula (Thermo Electron Corporation, Madison, WI) para analizar muestras de ADN sub-microlitros de solución. El ensayo se realizó con 1,5 l de muestra de ensayo, después de ser puesto a cero con TRIS-EDTA tampón (TE) (pH 7,4). se utilizó el modo de ADN /proteína de concentración (la absorbancia a 260 y 280 nm con corrección 320 nm) para la medición. Las concentraciones de ADN en S. noxia gratis (ATCC 43541, ATCC 700225, ATCC 51893) y fueron entre 4,2 y 11,7 ng /l. Las concentraciones variaron desde 4,2 hasta 150,8 ng /l en las muestras no objetivo (datos no mostrados). las concentraciones de la plantilla de ADN utilizados para la PCR variada, pero eran suficientes para obtener un resultado positivo en una prueba de presencia /ausencia, con base en la sensibilidad del ensayo (583 fg /reacción).
Primer y diseño de la sonda
La codificación de nucleótidos secuencia de la región y de toda la secuencia del genoma de datos de S. noxia
recuperadas desde el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, NCBI (http:.... //www NCBI NLM NIH gov /Genomas /) . la secuencia de montaje y la alineación se compararon en silico
contra todas las secuencias disponibles en línea con el algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, NCBI). Francia El ARN ribosomal 16S (1491 pares de bases) de S. noxia
(ATCC 43541) fue seleccionado para diseñar cebadores y sondas específicas mediante la comparación de la región V8 de este gen (Tabla 2). Esta región es altamente conservadas entre los miembros de las Selenomonas
género, pero más variable entre los Selenomonas
especies. cebadores y sondas TaqMan ® fueron diseñados y analizados utilizando el software Primer Express versión 3 (Life Technologies [] Applied Biosystems, Foster City, CA). cebadores seleccionados fueron examinados frente a la formación de estructuras secundarias, incluyendo la formación de estructuras de horquilla, y la auto-dímeros y transversales. La longitud del cebador, temperatura de fusión (T
m), la relación de G-C y otros factores se establecieron como valores por defecto en las Primer Express software.Table 2 Múltiples alineaciones de V8 regiones del gen 16S rRNA de Selenomonas
especies. Numeración utilizada según la Escherichia coli
16S rRNA genes [31]
Especies
ATCC #
región V8 (pb 1268-1296)
S. noxia
43541
CAGAGGGCAGCGAGAGA-GTGATCTTAAGC
S. artemidis
43528
..... Un .........-. CCC.C..GGGC ....
S. flueggei
43531
....... Un .......- .. GC.C..G.CGG ...
S. infelix
43532
..... Un .........-. CCC.C..GGGC ....
S. sputigena
35185
..... Un ................-. C ..........
S. dianae
43527
..... Un .........-. CCC.C .. GGGC ....
se seleccionaron dos pares de cebadores y una sonda para la prueba; i) Primer Set 1: Delantero SNF1 cebador, TCTGGGCTACACACGTACTACAATG (25 pb) y el cebador inverso SNR1, GCCTGCAATCCGAACTGAGA (20 pb), ii) la serie de cebadores 2: SNF2 cebador hacia adelante, GCATGTAAAGATGGGCACTCAA (22 pb) y el cebador inverso SNR2, CCGAACTGAGAAACGGTTTTTG (22 pb); con amplificación longitudes de 97 y 175, respectivamente. La sonda (SNP) seleccionado para ambos conjuntos de cebadores se marcó en el extremo 5 'con el colorante indicador 6-carboxifluoresceína (FAM) y el extremo 3' con el colorante indicador tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), SnP, [ ,,,0],6 ~ FAM] CAGAGGGCAGCGAGAGAGTGATCTTAAGC [TAMRA]. Los cebadores y la sonda diseñados se obtuvieron de Eurofins GTM Operon (Huntsville, AL). Ambos conjuntos de cebadores fueron probados con el ADN de dos S. noxia
cepas de referencia (ATCC 43541 y 51893) para determinar la señal de amplificación óptima.
Selección y optimización de cebadores de PCR
nueve combinaciones diferentes, entre 0,2 y 0,9 M M, de los cebadores directo e inverso y cinco concentraciones diferentes de sonda que van desde 0,05 M a 0,25 M se pusieron a prueba con el ADN (600 pg) de S. noxia
cepa de referencia ATCC 51893 para determinar la señal de amplificación óptima. Los parámetros de los ciclos de PCR fueron las siguientes: paso inicial de incubación de 50 ° C durante 2 min, la desnaturalización de la plantilla de ADN a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 1 min . Las condiciones de PCR fueron: 1X TaqMan PCR Universal mezcla maestra que contiene AmpErase® UNG (uracil-N-glicosilasa), DNA polimerasa AmpliTaq Gold, desoxinucleósidos trifosfato, referencia pasiva interna [colorante ROX ™], y componentes del tampón optimizados (Applied Biosystems), cebadores ( SNF1 y SNR1or SNF2 y SNR2) a una concentración final de 0,9 M, sonda a una concentración final de 0,2 M, y 5 l de plantilla de ADN. agua estéril libre de nucleasa (Promega, Madison, WI) se utilizó para ajustar el volumen de cada reacción a 25 l. Los análisis se realizaron en placas de 96 pocillos usando un rápido tiempo real instrumento sistema de PCR 7900HT (Applied Biosystems) en modo estándar. Los controles negativos que contienen 5 l de agua libre de nucleasa en lugar de DNA se incluyeron en cada ejecución para detectar cualquier ADN contaminación cruzada. ADN extraído de S. noxia
sirvió como control positivo en cada PCR plazo
control interno de amplificación
Un TaqMan exógeno control positivo interno disponible en el mercado. (IPC; Applied Biosystems) se utilizó para detectar la inhibición de la PCR. El kit de reactivos incluye 10X exógena IPC de Cebadores y Sondas (VIC ™ Probe) mezcla, 10X exógena IPC Reactivo de Parada, y el ADN exógeno IPC 50X. El ensayo qPCR se optimizó a condiciones adecuadas para la detección de tanto el organismo diana y el control positivo interno; por lo tanto, la ausencia o disminución de la amplificación del ADN IPC en cada reacción PCR multiplex indicaron la presencia de inhibidores de la PCR. Varias diluciones (es decir, 10 -1 a 10 -6) de cada muestra de ADN fueron probados para determinar y eliminar inhibidores potenciales de PCR. Se utilizó un espectrofotómetro con el accesorio nanocélula como se indicó anteriormente para demostrar la presencia de ADN en no objetivo muestras negativas de PCR se realizaron.
de análisis de datos
amplificaciones Replicar PCR (n = 4). Una vez que se completó la amplificación, se analizaron los datos y se representaron gráficamente (número de ciclo de fluorescencia vs.) utilizando el software proporcionado con el instrumento 7900HT PCR. El nivel de amplificación fue informado por el software que el valor umbral de ciclo media (Ct) de muestras replicadas. Ct se refiere al ciclo de PCR en la que la fluorescencia (es decir, producto de amplificación) se detecta primero, y es inversamente proporcional a la concentración inicial de plantilla de ADN. Un valor de Ct de 40 representa ningún ADN diana presente.
Resultados
cebador y sonda de diseño
Resultados de la proteína Clasificador de Familia (PFS) usando PATRIC mostró 14 proteínas únicas para S. noxia
, pero el BLAST proteína no encuentra una salida fiable para diseñar el cebador /sonda conjunto en esta región. Por lo tanto, los conjuntos de cebadores se diseñaron utilizando la secuencia 16S rRNA [GenBank: AF287799]. Ambos conjuntos de cebadores, cebadores 1 (SNF1, SNR1) y el conjunto de cebadores 2 (SNF2, SNR2) amplifica el organismo objetivo. Se encontró conjunto de cebadores 1 para producir los menores valores de Ct, indicando que era más sensible en la detección del organismo objetivo (Tabla 3). Por lo tanto, este conjunto de cebadores fue seleccionado para la optimización adicional y validación experiments.Table 3 resultados cuantitativos de PCR para la detección de S. noxia
organismo objetivo
conjunto de cebadores
Factor de dilución
100
10-1 10-2
ciclo umbral media (Ct) ± SE (N = 2)
S. noxia gratis (ATCC 43541) guía empresas 1
11,68 (0,56)
14.99 (0.42 )
17,97 (0,02)
2
13.55 (0.95)
15.51 (1.12)
18.21 (0.16 )
S. noxia gratis (ATCC 51893) guía empresas 1
9,39 (0,10)
13,56 (0,08)
16,91 (0,11)
2
11,66 (0,44)
13.35 (0.28)
17,23 (0,11)
PCR optimización
los nueve combinaciones diferentes de concentraciones de cebador probado produjo la amplificación de señal óptima en cinco de las nueve combinaciones, que oscila entre 19-20 valores de Ct para el 0,2 M /0,9 M, 0,5 /0,5 M, 0,5 /0,9 M, 0,9 /0,5 M, y 0,9 /0,9 M de avance y retroceso concentraciones de cebador, respectivamente (datos no mostrados). resultados de la optimización de la sonda mostraron que tres de las cinco concentraciones diferentes (es decir, 0,15 M, 0,2 M, y 0,25 M) produjo los valores más bajos de Ct (& lt; 20) (datos no mostrados). Según lo recomendado por el fabricante del instrumento y el software, 0,9 M de avance y retroceso concentraciones de cebador, y se seleccionaron 0,2 M concentración de la sonda para la prueba de especificidad. El límite inferior de detección del ensayo de PCR noxia
Selenomonas (usando S. noxia
ATCC 51893 como el organismo de ensayo) se situó en 583 fg /reacción.
Especificidad Exámenes
amplificación de PCR cuantitativa del organismo diana utilizando los cebadores y sondas, condiciones de reacción y parámetros de ciclo descritos anteriormente dieron como resultado la amplificación del esperado fragmento de 97 pb de los tres S. noxia
cepas analizadas (Tabla 4). El objetivo no Selenomonas
spp. probado no amplificar con los cebadores y la sonda diseñados. El resto de los organismos no objetivo tampoco se amplificaron con el ensayo desarrollado 16S qPCR (Tabla 4) prueba .Tabla 4 Especificidad de S. noxia
ensayo qPCR
Organismo de ensayo
ATCC #
resulta
PCR
Bacillus cereus
14579
negativo
Candida albicans
14053
La negativa
Centipeda periodontii
35019
negativo
Klebsiella pneumoniae
4352
negativo
Lactobacillus acidophilus
3456
negativo
Pectinatus cervisiiphilus
29359
negativo
Pseudomonas aeruginosa
27853
negativas
Selenomonas artemidis
43528
negativo
Selenomonas dianae
43527
negativo
Selenomonas flueggei
43531
negativo
Selenomonas infelix
43532
negativo
Selenomonas noxia
43541
positiva
Selenomonas noxia
51893
La positiva
Selenomonas noxia
700.225
positivo
Selenomonas sputigena
35185
negativo
Staphylococcus aureus
25923
negativo
Streptococcus mutans
25175
negativo
inhibición de la PCR Francia El gen diana se amplificó en todas las concentraciones de ADN analizadas a partir de tres cepas de S. noxia
. Sin embargo, el IPC PCR demostró la presencia de inhibición de la PCR, y estos extractos de ADN necesaria la dilución (10 -4 a 10 -5) para eliminar los inhibidores (Tabla 5) resultados .Tabla 5 muestra la inhibición de la PCR en S . noxia
muestras
: resultados de la PCR (valores de Ct)
Muestra
dilución
Muestra
IPC
S. noxia gratis (ATCC 43541)
100
14.60
15.01
40.00
40.00
10-1
17,76
17,94
40.00
40.00
10-2
21.30
21.23
40.00
40.00
10-3
24.79
24,71
40.00
31.21
10-4
28.13
28.01
28.08
28.11
S. noxia gratis ( ATCC 51893)
100
13,36
13.24
40.00
40.00
10-1
15.34
15.45
40.00
40.00
10-2
19.59
19.26
40.00
40.00
10-3
22.54
23.05
40.00
40.00
10-4
28.29
28.23
40.00
40.00
10-5
30.80
30,77
28.08
28.93
S. noxia gratis (ATCC 700225)
100
20.90
20.00
40.00
40.00
10-1
nd1
nd1
nd1
nd1
10-2
22.92
23.00
40.00
40.00
10-3
26.68
26.48
40.00
40.00
10-4
29,95
30.11
28.53
28.22
10-5
33.53
33.53
27.73
28.06
n control de plantilla
40.00
40.00
28.40
28.12
1No determinó
diluciones (10 -1 a 10 -6) eran necesarios para eliminar los inhibidores de extractos de ADN no diana (Tabla 6). En ausencia de inhibición, el ADN IPC (es decir, control sin molde) amplificada con un valor medio Ct de 29,4 ± 0,3 (error estándar; S. E.). Era necesario diluir las muestras de ADN de todo, el objetivo y no objetivo, para eliminar los inhibidores. Todos los extractos de ADN no diana producen resultados negativos (Ct = 40) para el S. noxia
ensayo de PCR incluso cuando inhibidores de la PCR se habían eliminado por dilución de la muestra. Estos no son objeto de las muestras negativas PCR contenían ADN como se demuestra por espectrofotometría con el accesorio nanocélula (datos no mostrados) .Tabla 6 de datos que muestra dilución a la que la inhibición se resolvió (n = 2 para todas las muestras, excepto aquellos en negrita que consistía en cuatro repeticiones)
resultados de la PCR (valor medio Ct)
Muestra
dilución
IPC
Bacillus cereus
1,00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-04
40.00
1.00E-05
31.43
1,00E-06
29.48
Candida albicans
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30,76
Centipeda periodontii
1,00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
40.00
1,00E-04
29.01
Klebsiella neumonía
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30.42
Lactobacillus acidophilus
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
29.84
Pseudomonas aeruginosa
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30.47
Pectinatus cerevisiiphilus
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.70
Staphylococcus aureus
1,00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1.00E- 03
29.73
Selenomonas artemidis
1,00E + 00
40.00
1,00E -01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28,72
Selenomonas dianae
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.22
Selenomonas flueggeii
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.82
Selenomonas infelix
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
29.32
Streptococcus mutans
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
< Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
