Abstract
Antecedentes comentario El papel de los glicoconjugados de la superficie celular en la mucosa bucal enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) todavía no está claro, a pesar de que los cambios moleculares en el epitelio oral es esencial para la patogénesis de estas lesiones. En este estudio, se investigó los cambios en la unión de manosa (Man) Lente específico de culinaris
lectina (ACV) en la mucosa oral de ratas con EICH.
Métodos
se inyectaron células de bazo de ratas Lewis en ( Lewis x Pardo Noruega) F
1 ratas para inducir EICH sistémica, incluyendo lesiones de la mucosa oral. muestras de la lengua y del bazo se evaluaron usando histoquímica de lectinas, inmunohistoquímica, Western Blot, ensayos de migración transwell y Stamper-Woodruff ensayos de unión.
: Resultados de la unión del hombre-LCA específica ampliar a las capas epiteliales de la lengua en la EICH-ratas . Una expansión de LCA unión estaba relacionado con el aumento de la expresión de manosiltransferasa en la mucosa oral. CD8 + células, las células efectoras de GVHD de la mucosa oral, expresa la proteína de unión a manosa (MBP) y ha migrado al medio que contiene hombre en el ensayo de migración transwell. La adhesión de las células CD8 + células de epitelio oral puede ser inhibida por el pretratamiento de CD8 + células con anticuerpos MBP y /o por el tratamiento previo de las secciones con el Hombre-LCA específica.
Conclusiones
aumento de la expresión del hombre en queratinocitos conduce a la migración y /o adhesión de CD8 + células en el epitelio de la superficie, que está mediada en parte por la vía de MBP /Hombre-unión durante el desarrollo de GVHD de la mucosa oral.
Palabras clave
Graft frente a la lente enfermedad huésped culinaris
lectina de la proteína de unión a manosa-CD8 + linfocitos material complementario Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-5) contiene complementaria material, que está disponible para usuarios autorizados.
Antecedentes
enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es una complicación que puede ocurrir después de un trasplante de médula de células madre hematopoyéticas o hueso, que las células del donante recién trasplantadas atacan al trasplante el cuerpo del receptor. GVHD se caracteriza por la inflamación selectiva epitelial que afecta a los órganos mucocutáneas, el tracto gastrointestinal y el hígado [1]. Ambos estudios clínicos y experimentales han identificado mucosa oral como uno de los sitios críticos afectados por GVDH [2, 3]. Los cambios histopatológicos en la EICH mucocutánea incluyen satelitosis, en la que los linfocitos forman grupos alrededor disqueratósicas y /o queratinocitos necróticos (KCS). Los linfocitos, particularmente CD8 + células, migran desde el intersticio perivascular en la capa epitelial que recubre e inducir cambios degenerativos en KC, lo que sugiere que la determinación de la naturaleza de la destrucción KC puede ayudar en la comprensión de la patogénesis de la EICH mucocutánea [4]. Durante este proceso, la expresión de moléculas específicas, tales como MHC de clase II y molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), se produce en el epitelio KC para interactuar con las células efectoras [5-8]. En particular, el aumento de expresión de ICAM-1 en KC conduce a la migración de las células efectoras en el epitelio de la superficie, que está mediada en parte por la vía de ICAM-1 asociado a la función /linfocitos antígeno-1 (LFA-1) [3].
recientes avances en la glicobiología se ha puesto de manifiesto que los glicoconjugados de la superficie celular desempeñan un papel esencial en eventos de reconocimiento. sondas lectina típicamente se han utilizado para detectar glicoconjugados de la superficie celular, ya que las lectinas se definen como proteínas de unión a carbohidratos distintos de enzimas o anticuerpos (Abs) [9]. Están implicados en diversos procesos biológicos en muchas especies, como el aclaramiento de las glicoproteínas del sistema circulatorio, la adherencia de agentes infecciosos a las células huésped, el reclutamiento de leucocitos a los sitios inflamatorios, y las interacciones de células en el sistema inmune en relación con los tumores malignos y la metástasis [ ,,,0],9]. La unión de lectina se modifica durante el proceso de diferenciación epitelial y la estimulación de lesiones de la piel y mucosa oral [10-13]. Entre las lectinas, Lens culinaris
lectina (LCA), conocido como un aglutinante de manosa (Man), posee especificidades de unión único, con un núcleo de 1,6-biantenario fucosilado oligosacáridos y glicanos de transferrina de suero humano y α-fetoproteína [ ,,,0],14]. de la superficie celular El hombre es también un ligando para la proteína de unión a manosa (MBP), que funciona en la opsonización de microorganismos para los fagocitos y mediada por células actividad citotoxicidad antitumoral-[14, 15]. Estos estudios han llevado a la hipótesis que la determinación de los cambios en la expresión en el hombre KCS ayudar en la comprensión de la patogénesis de la GVHD de la mucosa oral. Nuestra aproximación a esta premisa ha sido centrarse en la expresión del hombre de la superficie celular por KCS y su interacción con MBP en ratas EICH mucosa oral de las ratas. Nuestro estudio tuvo tres objetivos: (1) para determinar la superficie celular Hombre de expresión por los KC utilizando LCA hombre-específica, (2) para investigar si CD8 + células, las células efectoras en la EICH mucosa oral, migrar a una que contiene hombre- medio, y (3) para determinar si la expresión del hombre por los KC media la unión de MBP que expresan CD8 + células a KCS. Los resultados indican que durante el desarrollo de GVHD de la mucosa oral en ratas, el aumento de expresión del hombre por KC conduce a la migración y /o adhesión de CD8 + células en la superficie del epitelio, mediada en parte por el MBP /Hombre-unión vía.
Métodos
ratas hembra adulta
endogámica Lewis (LEW, RT1 l) y Lewis Brown Norway × F 1 híbrido (LBNF 1, RTL 1 /ratas n) con un peso de 250 a 350 gramos se compraron de Kyudo Co. (Saga, Japón). Se llevaron a cabo los estudios en animales, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales de Fukuoka Dental College.
La inducción de la EICH
extirpado el bazo de ratas LEW fueron disecados en solución de Hanks, forzada a través de un tamiz de acero inoxidable, y se filtra a través de una malla de nylon (Tamices célula; BD Biosciences, CA, EE.UU.). Las células se lavaron tres veces en solución de Hanks y se resuspendieron a 10 8 /ml en medio RPMI-1640 con suero de ternera fetal 10%. La viabilidad celular se determinó mediante análisis de exclusión con azul de tripano. EICH se indujo mediante una inyección intraperitoneal de 3 ml de 3 × 10 8 células en LBNF 1 ratas. Sin tratar LBNF 1 ratas y LBNF 1 ratas inyectadas con un número igual de singénico LBNF 1 esplenocitos se utilizaron como controles. Todas las ratas se pesaron diariamente y cuidadosamente controlar los signos clínicos de la enfermedad.
Evaluación de GVHD
La evaluación clínica de GVHD se determinó por la pérdida de peso y el desarrollo de eritema cutáneo o mucosal, especialmente en las orejas, la mucosa nasal, los pies -pads, y los labios. Ambas condiciones clínicas aparecieron en el día 10 después de la inyección y se convirtió a partir de entonces severa. Un ensayo de peso del bazo se realizó en la autopsia para confirmar la evaluación inmunológica de GVHD. Después de día 10, las ratas experimentales mostraron notable esplenomegalia como una sobreexpresión de la respuesta inmune relacionada con la EICH-[16]. Todos los animales de control sobrevivieron y parecían sanos.
Preparación de tejidos
Toda la lengua se escindió 1-21 días después de la inyección de cinco animales en cada grupo de tratamiento. La mitad de las muestras de la lengua se fijaron en 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Secciones de parafina (4 m) fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para examinar los cambios histopatológicos. La otra mitad se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido, y las secciones congeladas de serie se utilizaron para la inmunotinción, histoquímica de lectinas, e in vitro
ensayos de adhesión.
Histoquímica de lectinas
LCA, Ulex europaeus
I (UEA- 1), y Archis hypogaea
(maní: PNA) se utilizaron para la detección de α-D-Man, α-L-fucosa, y β1,3galactosamine galactosa, respectivamente (vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE.UU. ). LCA vinculante se detectó usando el Alexa Fluor 568 - método de estreptavidina marcada con biotina. secciones congeladas fijadas en acetona se incubaron con LCA biotinilado (25 mg /ml; Vector Laboratories) durante 30 min y Alexa Fluor estreptavidina 568 marcado con (1: 400; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. controles histoquímicas sustituidos LCA no conjugada para el conjugado LCA-biotina y la reacción con LCA biotinilado inactivado por su inhibidor específico de azúcar (D-manosa, 2 mM; EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA, EE.UU.)
inmunohistoquímica Abs utilizados en este estudio fueron los siguientes: (a) un anticuerpo policlonal de conejo Ab contra ALG11, reactivo con manosiltransferasa (1: 300; Novus Biológicas, Littleton, CO, EE.UU.), (b) un anticuerpo policlonal de conejo Ab contra LMAN2, reactivo con MBP 2 (1: 100; Aviva Biología de Sistemas, San Diego, CA, EE.UU.), (c) un anticuerpo monoclonal de ratón Ab contra 1A29, reactivo con ICAM-1 (1: 100; Cederlane Lab, Ontario, Canadá.), y ( d) un anticuerpo monoclonal de ratón Ab contra OX-8, reactivo con CD8 (1:. 100; Cederlane Lab). secciones congeladas fijadas en acetona se incubaron primero con suero de conejo normal para disminuir la unión no específica y después se hace reaccionar con uno de los Abs, durante la noche a 4 ° C. Las secciones fueron incubadas con fosfatasa alcalina conjugada anti-conejo Ab o anti-ratón Ab (dilución 1: 150; DakoCytomation, Tokio, Japón) durante 45 min a temperatura ambiente. reacciones de inmunohistoquímica se visualizaron utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /solución de cloruro de tetrazolio nitro azul (solución BCIP /NBT; DakoCytomation). Como control, las secciones se trataron con IgG de conejo normal en lugar de la primera serie de Abs.
Western Blot
proteína total fue extraído a partir de muestras de bazo y de la lengua en ratas de control o GVHD utilizando tampón de lisis de células enfriado con hielo (20 m m Tris-HCl, pH 7,5; 150 mMNaCl; 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]; Na 1 mM 2EDTA; ácido etilenglicol tetraacético 1 mM; 1% [v /v] Triton-X 100; de sodio 2,5 mM pirofosfato; 1 mMβ-glicerofosfato; 1 mM Na 3Vo 4, y 1 mg /ml de leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Cantidades iguales de proteína (20 mg) se separaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; 12% de separación de gel). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japón). Las transferencias se bloquearon con 1% de caseína en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente y después se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. se utilizaron Abs primaria contra LMAN2 (descrito anteriormente) y β-actina (Sigma-Aldrich). Las membranas se lavaron en TBS-T y se incubaron con Ab marcado con peroxidasa de rábano secundaria durante 1 h a temperatura ambiente. complejos Ab unidos se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia (Bio-RadLaboratories).
Aislamiento de células CD8 + de los bazos de las ratas GVHD mediada
CD8 + células de ratas GVHD se utilizaron en los ensayos de migración transwell y Stamper- Woodruff ensayos de unión. Los linfocitos se burlaban de bazo, exhibiendo esplenomegalia, de ratas GVHD y se suspendieron en medio RPMI-1640 a 4 ° C. Las células se dispersaron por el rápido, pipeteado en-out, y de los grupos de células se eliminaron mediante el paso a través de una malla de nylon (Tamices célula; BD Biosciences). La suspensión de una sola célula resultante se lavó tres veces en el mismo medio y se resuspendieron a una concentración de 3 × 10 7mononuclear células /ml. CD8 + células de la suspensión se aislaron por purificación de perlas magnéticas usando microperlas Miltenyi CD8a de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, Tokio, Japón).
Ensayo de migración Transwell de células efectoras
migración de CD8 + células de la GVHD-bazo en un sistema de Transwell® de inserción en el que los pocillos superior e inferior fueron separados por membrana de policarbonato (tamaño de poro de 3 micras; Corning, NY, EE.UU.). CD8 + células, pre-incubados o no con anti-MBP Ab (50 g /ml), se sembraron a una densidad de 5 x 10 4 células insertos transwell /pocillo en 3-M. La cámara inferior se llenó con 500 l de medio RPMI solamente o medio que contiene Man (2 mM), una mezcla de Man y LCA (50 g /ml), o galactosa (Gal, 2 mM; EY Laboratories). Las células se incubaron durante 4 horas a 37 ° C (5% de CO 2) y después se tiñeron con Diff-Quik (Sysmex Corp., Hyogo, Japón). actividad de migración se evaluó como la migración por ciento de las células de la cámara superior de la transwell insertar a la cámara inferior en tres campos de alta potencia (100x) por pocillo. El experimento se realizó por triplicado.
Ensayo de unión de Stamper-Woodruff (SWBA)
-de tipo Woodruff Stamper de cortes congelados Los ensayos se realizaron como se describe anteriormente [3]. Brevemente, alícuotas que contiene 2,5 × 10 se añadieron 5 aisladas CD8 + células en 200 l de medio RPMI-1640 que recién cortado (8 M) secciones congeladas de la lengua obtenido de ratas en los grupos de control y de EICH. Las secciones se agitaron en un agitador rotatorio (60 rpm) durante 60 min a temperatura ambiente. A continuación, la suspensión de células se decantó cuidadosamente, y las células que se adhieren a las secciones se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en PBS durante 5 min. a continuación, las diapositivas se lavaron en PBS y se tiñeron con azul de toluidina al 0,5%. El número de adherentes CD8 + células se determinó mediante examen de microscopía de luz de campos en 200 × magnificación (Cada campo de gran aumento representó aproximadamente 400 micras de epitelio oral). Se contó el número de células CD8 + células unidas directamente sobre los KC (pero no en la capa córnea). Varios experimentos de bloqueo se realizaron de la siguiente manera: (a) secciones congeladas de la lengua de ratas GVHD se incubaron con 25 g /ml de LCA, PNA o UEA-I de 30 min a temperatura ambiente después de un breve lavado con PBS, y después se añadió a linfocitos; (B) CD8 + células se preincubaron con 50 g /ml de MBP Ab durante 30 min a temperatura ambiente, antes de que toda la mezcla de reacción se transfirió a secciones congeladas de los GVHD lenguas; Se utilizaron (c) los dos enfoques simultáneamente, es decir, CD8 + células fueron tratadas con MBP Ab y las secciones de tejido fueron tratados con MBP. Los resultados se calculan como el porcentaje de relación con el control linfocitos y secciones de tejidos expuestos a tampón solo unión.
El análisis estadístico
análisis estadístico se realizó con el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) y pruebas de comparación múltiple de Scheffe para determinar estadística las diferencias entre las muestras. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD) y P
valores de & lt; 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados
EICH la mucosa oral se caracteriza por la expresión de ICAM-1 y CD8 + de células T se infiltra
En primer lugar hemos examinado si las características de inmunohistoquímica puede ser detectada en la mucosa oral durante el desarrollo de EICH . En lenguas de control no tratados, no hay cambios histológicos se observaron con H & amp; E tinción (Figura 1a). ICAM-1 de expresión se restringe a las células endoteliales y perivasculares de los vasos sanguíneos (Figura 1c). Sólo se observaron unas pocas células CD8 + en la lámina propia y el epitelio oral (Figura 1e). Los resultados fueron los mismos en las secciones de tejido tomadas de ratas experimentales 8 días después de la inyección. Sin embargo, 10 días después de la inducción de GVHD en LBNF 1 ratas, no se observaron cambios histológicos e inmunohistoquímicos en las lenguas. H & amp; E tinción reveló lesiones típicas de la EICH mucocutánea aguda, lo que indica eosinofílica degeneración citoplasmática y necrosis del epitelio KC (el llamado satelitosis) como resultado de la infiltración intraepitelial de linfocitos (Figura 1b). se observó ICAM-1 expresión en el basal a las capas espinosas del epitelio (Figura 1d) y el número de CD8 + células aumento en la lámina propia de la lengua (Figura 1f). Además, estas células se infiltraron en el epitelio de la superficie donde KC epiteliales se tiñeron con anti-ICAM-1 Ab. Figura 1 Expresión inmunohistoquímica de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) y CD8 + en la enfermedad (GVHD) de injerto contra huésped mucosa oral -related. A y B: No hubo cambios evidentes se observan en hematoxilina y eosina (H & amp; E) teñidas secciones lengüeta de mando (a). En secciones de tejido de la lengua de ratas GVHD, se observa la destrucción epitelial (b). C y D: En la lengua muestras procedentes de ratas de control, ICAM-1 se expresa sólo en las hendiduras vasculares (flechas) (c). Epitelial ICAM-1 de expresión se observó en el basal a las capas espinosas de la mucosa oral de ratas GVHD (d). e y f: células Sólo unos pocos CD8 + se encuentran en el control (e). En las ratas GVHD, el número de células CD8 + aumento se observan tanto en la lámina propia y la superficie del epitelio (f). La línea punteada muestra una unión entre la superficie del epitelio y la lámina propia de la lengua. Barra = 100 micras.
Las alteraciones en la mucosa LCA vinculante en la EICH
Para dilucidar si la expresión histoquímica de células de la superficie epitelial del hombre en los KC se ve afectada por el desarrollo de EICH, se analizó la tinción de LCA en las lenguas de control y ratas GVHD. LCA unión estaba restringido a la superficie celular de la basal para parabasales KC en el epitelio de la superficie de las lengüetas de las ratas de control (figura 2a). El mismo patrón de tinción se demostró en las secciones de tejido tomadas de ratas experimentales ocho días después de la inyección. En contraste, el nivel de tinción LCA extiende a las capas espinosas de la superficie del epitelio 10 días después de la inyección, lo que indica que los oligosacáridos en KC podrían modificarse durante el desarrollo de GVHD (Figura 2b). Además, el patrón de extensión de la tinción de LCA era idéntica a la de ICAM-1 de expresión. Figura 2 lectina Lens culinaris (LCA) de unión en la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) mucosa oral. LCA de unión se produce en la superficie celular de las células basales a parabasales en lenguas de control (a). La tinción se extiende a las capas espinosas de la superficie del epitelio en ratas GVHD (b). La línea punteada blanco circunscribe la capa epitelial de la superficie de la lengua. Barra = 100 micras.
Aumento de la expresión del complejo mannosyltransferase en la EICH de mucosa oral
A continuación examinó la expresión inmunohistoquímica de mannosyltransferase compleja, utilizando ALG11 Ab, en lenguas de ambas ratas de control y de EICH, para dilucidar si el mannosyltransferase podría ser responsable de la suma del Hombre en los oligosacáridos en los KC durante el desarrollo de EICH. En lingual normal ALG11 obligado débilmente y /o débilmente a KCS basales y parabasales de la superficie del epitelio (Figura 3a). sitios reactivos con ALG11 extendidos hasta el citoplasma de la KCS en las capas espinosas de la superficie del epitelio en las lenguas de ratas GVHD (Figura 3b). La gama reactivo con ALG11 parecía ser idéntica a la de LCA de unión, lo que sugiere que el aumento de expresión de manosiltransferasa en las capas epiteliales puede estar relacionado con una amplia unión de LCA. Figura 3 Detección inmunohistoquímica de complejo manosiltransferasa en la enfermedad (GVHD) de injerto contra huésped mucosa oral -afectado. ALG11, anticuerpo (Ab) de complejo de manosiltransferasa, es débilmente y débilmente reactiva en basal y las células epiteliales parabasales de lenguas de control (a). Por el contrario, la tinción con ALG11 se extiende a los queratinocitos (KCS) en las capas espinosas de lenguas de ratas GVHD (B). Barra = 100 micras.
MBP /Hombre vinculante vía induce la migración CD8 + células in vitro
para dilucidar si la migración de las células CD8 + células está mediada por la vía de MBP /Hombre vinculante, se analizó la expresión de MBP en las lenguas de las ratas EICH y el ensayo de migración transwell para CD8 + células. En primer lugar, se examinó la detección inmunohistoquímica de MBP en secciones de tejido de la lengüeta de la GVHD-ratas. MBP se observaron + células infiltrantes tanto en la lámina propia y la superficie del epitelio superior de las lengüetas (Figura 4a). También se examinó la expresión de proteínas de MBP en las lenguas y el bazo de ratas control y EICH por Western blot. Como se muestra en la Figura 4b, la cantidad de acumulación de MBP se incrementó marcadamente tanto en la lengua y el bazo de ratas GVHD. En contraste, la expresión de la proteína MBP era débil o negativo tanto en la lengua y el bazo de las ratas de control (Figura 4b). Estos resultados sugieren que MBP puede ser inducida en células efectoras relacionados GVHD y MBP en las células efectoras pueden reaccionar contra la superficie celular hombre de la KCS en las lenguas de ratas GVHD. Para probar esta hipótesis, se realizó el siguiente transwell ensayos de migración de las células efectoras. Como se muestra en la Figura 5, el porcentaje de migración de CD8 + células para el hombre aumentó drásticamente (77,9 ± 4,6) comparado con el control (1,7 ± 0,6). El porcentaje de la migración de las células CD8 + células se convirtió en baja en la cámara inferior que contiene el Hombre y ACV (8,3 ± 0,7) y Gal (1,5 ± 0,7). Además, la migración CD8 + célula para hombre disminuyó drásticamente (5,6 ± 0,4) cuando las células se pre-incubaron con anti-MBP Ab. Estos resultados indican que la migración de las células CD8 + células para hombre está mediado por la vía MBP /Hombre-unión. Figura 4 la proteína de unión a manosa (MBP) expresión en las muestras de la lengua y de bazo de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) ratas. células infiltrantes se expresan inmunohistoquímicamente por el anticuerpo anti-MBP (Ab) (a). El análisis de transferencia Western de los niveles de MBP de la lengua y el bazo de ratas control y GVHD (B). Tanto la lengua y el bazo de las ratas GVHD mediada muestran una notable reacción con MBP. β-actina (ACTB) se analizó de manera similar como control de carga. Barra = 100 micras.
Figura 5 Inducción de la manosa (Man) a la migración de células CD8 +. la migración de células CD8 + fue examinado por el ensayo de migración transwell. El hombre, el hombre con lectina Lens culinaris
(LCA), o la galactosa se colocó en la cámara baja también. Los pocillos de la cámara superior reciben aislado CD8 + células, pretratada o no con la proteína anti-manosa-de unión del anticuerpo (MBP) (Ab). RPMI se utilizó como control negativo. La figura representa los resultados de tres experimentos diferentes expresaron como media ± desviación estándar. Los mismos símbolos no muestran diferencias estadísticamente significativas. Otros, significativamente diferentes a P Hotel & lt; 0.05.
Anti-MBP Ab y LCA inhiben la adhesión de las células CD8 + a KCS en muestras de la lengua de ratas con GVHD
En el modelo GVHD rata, las células efectoras se pueden unir a lesional KC por la ICAM-1 /LFA-1 vía [3]. Se realizó SWBA utilizando CD8 + células y /o células epiteliales orales tomados de ratas con EICH, para proporcionar evidencia de un papel directo de la vía MBP /Hombre-unión en la unión de las células CD8 + células epiteliales KC . El tratamiento previo de las secciones de tejido preparadas a partir de la mucosa oral con PNA y UEA-I no tuvo ningún efecto, mientras que disminuyó la adhesión de linfocitos LCA por 42,3% del valor de control (Figura 6). Cuando los linfocitos de ratas con GVHD se incubaron con anti-MBP Ab, la adhesión de linfocitos a epitelial KC era 42,7% del valor de control (Figura 6). Cuando se aplicaron los dos enfoques de forma simultánea, es decir, cuando los linfocitos se trataron con anti-MBP Ab y las secciones de tejido se trataron con LCA, la adhesión de linfocitos se redujo a & lt; 40% del valor de control (Figura 6). Estos resultados indican que la adhesión de CD8 + células epiteliales KC está mediada en parte por la vía de MBP /Hombre-unión. Figura 6 Efecto de lectinas y proteínas anti-manosa vinculante (MBP) de anticuerpos (Ab) sobre la adhesión celular CD8 + en el epitelio oral en GVHD. La adhesión de las células CD8 + a los queratinocitos orales (KCS) se investigaron por Stamper-Woodruff ensayo (SWBA) de unión. La unión de las células CD8 + se redujo significativamente cuando las células fueron pretratadas con anti-MBP Ab, así como cuando los epitelios se pretrataron con Lens culinaris
lectina (LCA). La figura representa los resultados de tres experimentos diferentes y se expresó como media ± desviación estándar. Los mismos símbolos no muestran diferencias estadísticamente significativas. Otros, significativamente diferentes a P Hotel & lt; 0.05.
Discusión
En este estudio utilizamos el haploidentical F alogénico 1 modelo de rata híbrida para dilucidar el papel de la expresión de la superficie celular de los residuos de Man por KC en la EICH. Aunque este modelo no representa directamente trasplante de células hematopoyéticas en clínica humana, que proporciona un sistema conveniente y genéticamente bien definido desde el cual para obtener información sobre los mecanismos que subyacen a daños tisulares mediadas inmunológicamente de tejido epitelial de host mediante el estudio in vivo
interacciones entre KCS y linfocitos [17]. Se presentan tres líneas de evidencia para apoyar la conclusión de que la expresión de la superficie celular del hombre por el KC juega un papel en la migración y /o adhesión de las células CD8 + en las células del epitelio durante el desarrollo de EICH. En primer lugar, un enfoque histoquímica de lectina confirmó que la expresión de la superficie celular del hombre por el KC fue hasta reguladas en el desarrollo de EICH. En segundo lugar, la expresión de proteínas y los resultados de migración transwell indicaron que la migración CD8 + celular para hombre estaba relacionado con una interacción entre el hombre y la MBP. En tercer lugar, CD8 + adhesión celular del epitelio de la mucosa superficial fue mediado por la vía MBP /Hombre vinculante como lo revela el uso de SWBA. Sobre An regulación de LCA vinculante sobre la superficie celular de los KC indica que el por células expresión en la superficie del Hombre se modifica durante el desarrollo de EICH la mucosa oral. En la EICH mucocutánea, los cambios moleculares específicos se producen en KC para permitir la migración de linfocitos en la capa epitelial de la superficie [7, 8, 18]. Un estudio previo ha informado de que la inducción de ICAM-1 expresión en KC conduce a la migración de CD8 + células en el epitelio y que este proceso está mediado en parte por la ICAM-1 /LFA-1 vía [3] . Los resultados presentados aquí proporcionan apoyo adicional para los cambios moleculares en los KC durante el desarrollo de EICH mucsal oral. El estudio inmunohistoquímico de Ab anti-ALG11 informó aquí muestra que AB sitios reactivos también se expanden a las capas espinosas en la superficie del epitelio de la lengua EICH. ALG11 se conoce como alfa-1,2-manosiltransferasa en la glicoproteína ligada a N y se localiza en el lado citosólico de la retículo endoplasmático en las células basales de epitelio escamoso normal [19]. Estos hallazgos sugieren que la amplia expresión de complejo manosiltransferasa puede ser indirectamente responsable de la regulación positiva de la expresión del hombre en la superficie celular de la KCS en la lengua GVHD. En futuros trabajos se por qué la expresión de mannosyltransferase hombre complejo y expandir durante el desarrollo de EICH.
inmunohistoquímica y Western blot análisis presentados aquí revelan que las células efectoras de la EICH muestran la expresión de MBP usando LMAN2 Ab, además de CD8. MBP, también llamada proteína de unión a manosa o lectina de unión a manosa, es una de Ca2 + - dependiente (tipo C) animales lectina [20-22]. Un estudio reciente reveló que esta proteína podría mostrar un efecto específico en la activación de células T [23]. MBP se une preferentemente a los hidratos de carbono terminados con Man, N-acetilglucosamina, fucosa o [24]. Por lo tanto, los linfocitos que expresan MBP-parecen interactuar con los KC-Man expresar en EICH la mucosa oral. Nuestros resultados del ensayo de migración transwell indican que la migración de la CD8 MBP-expresión + células se acelera por medio que contiene Man. CD8 migración + celular se inhibió en una mezcla de Man y LCA y el pretratamiento de las células con LMAN2 Ab, lo que indica que MBP en CD8 + células reconocen específicamente hombre. Estos resultados sugieren que la migración de las células efectoras, CD8 + linfocitos, para hombre-expresión de KC puede ser mediada por una interacción entre MBP y el Hombre.
CD8 + de adhesión celular en el epitelio teñido con Hombre- LCA específica se demostró utilizando SWBA. Por lo tanto, la unión de CD8 + células en la superficie del epitelio durante el desarrollo de GVHD aumenta a lo largo con la expresión Hombre y se correlaciona con la progresión de la enfermedad. Estos resultados son consistentes con las observaciones in vivo
de la KCS expresar LCA-Man específico para adherirse a CD8 + células durante la progresión de la GVHD. En un proceso de adhesión, MBP en CD8 + células juegan un papel importante como un factor adhesiva del Hombre-expresión de los KC durante el desarrollo de EICH. Por otra parte, los resultados de los experimentos de LCA y Ab-bloqueantes apoyaron la idea de que representan las interacciones MBP /hombre para la unión de CD8 + células. Por lo tanto, LMAN2 Ab, LCA, o LMAN2 Ab junto con LCA, bloquearon toda CD8 + unión celular en comparación con el reconocimiento de los residuos lecitns hombre no relacionados. Nuestro estudio anterior reveló que la inducción de ICAM-1 expresión en KC llevó a la adhesión de CD8 + células a la superficie del epitelio y que esto fue mediado en parte por la ICAM-1 /LFA-1 vía [3]. Las interacciones /Man MBP presentados aquí pertenecen a otra vía de adhesivo para la migración y adhesión de las células efectoras en la superficie del epitelio durante el desarrollo de EICH la mucosa oral.
En resumen, estos resultados definen el papel del hombre en la expresión durante el KC desarrollo de EICH como la inducción de la migración de MBP que expresan CD8 + células en el epitelio oral en la que se adhieren a KCS. La regulación positiva de la expresión del hombre en los KC es, sin duda, un paso clave en la patogénesis de la EICH la mucosa oral.
Conclusión sobre An aumento de la expresión del hombre en los KC conduce a la migración y /o adhesión de las células CD8 + en las células la superficie del epitelio y esto está mediada en parte por la vía MBP /hombre durante el desarrollo de EICH de mucosa oral
abreviaciones
ACTB:.
β-actina
Ab:
Anticuerpo
EICH:
La enfermedad de injerto contra huésped
H & amp; E:
