?
Resumen Antecedentes
Hay confusión sobre la definición del término "estado de la viabilidad (s)" de microorganismos. "Tinción de viabilidad" o "técnicas de tinción vitales" se utilizan para distinguir en vivo de bacterias muertas. Estas coloraciones, primera establecidos en las bacterias planctónicas, pueden tener graves deficiencias cuando se aplica a las biopelículas de múltiples especies. Los resultados de las técnicas de tinción deben ser comparados con los datos microbiológicos apropiados.
Discusión ¿Cuántas términos describen los "estados de vida" de los microorganismos, sin embargo, varios de ellos son engañosos. Los autores definen "viable" como "capaz de crecer". En consecuencia, los métodos de tinción son sustitutos, ya que no se puede demostrar la viabilidad tinción México La fiabilidad de una "viabilidad" comercial tinción de ensayo (Molecular Probes) se analiza en base a la correspondiente ficha de producto:. (I) Principio de tinción; (II) Las concentraciones de bacterias;.
(III) Cálculo de proporciones vivos /muertos en vitro
Resultados del kit "viabilidad" dependen de la concentración de las manchas 'y en su relación con el número de bacterias en el prueba. En general, este sistema de tinción no es adecuado para múltiples especies biopelículas, por tanto, declaraciones incorrectas han sido publicados por los usuarios de esta técnica.
Para comparar los resultados de la tinción con parámetros bacterianas técnicas apropiadas deben ser seleccionados. La evaluación de las unidades formadoras de colonias es insuficiente, y no es necesario el cálculo de eficiencia de plaqueo. tinción fluorescente vital con fluoresceína diacetato de bromuro de etidio y parece ser el método más adecuado probada y en la investigación de biopelículas.
Con respecto a la mutagenicidad de los componentes de tinción usuarios deben ser conscientes de que no sólo bromuro de etidio podría ser perjudicial, sino también una variedad de otros sustancias de las que no se informa de la toxicidad y mutagenicidad
Resumen CD -. la nomenclatura en relación con la "viabilidad" y "vitalidad" debería usarse con precaución CD -. el manual del kit comercial "viabilidad" sí señala que el kit no es adecuado para la investigación de múltiples especies biofilm natural, como el apoyo de una gran variedad de literatura
-. los resultados obtenidos con varias manchas se ven influidos por la relación entre el número de bacterias y la cantidad de mancha utilizado en la prueba. Correspondientes datos de vida son propensos a cambio artificial CD -. Como parámetro microbiológico de la eficiencia de plaqueo se debe utilizar para la comparación.
- Bromuro de etidio es mutagénico. Los investigadores deben ser conscientes de que los compuestos de tinción alternativos también pueden ser o incluso son mutagénicos.
Palabras clave
estado dental placa de biofilm Microorganismos Viabilidad de fluorescencia Vital kit de viabilidad bacteriana Mutagenicidad Antecedentes
La definición del llamado "estado viabilidad ( s) "de microorganismos ha sido motivo de confusión y debate desde hace décadas (para tener una idea de la gran cantidad de literatura ver [1-5]). Recientemente, dos manuscritos discuten este tema. Hannig et al. [6] investigó la influencia de una novela de enjuague bucal que contiene microclusters de hidroxiapatita sobre la adherencia bacteriana mediante el uso de la BacLight ™ vivo técnica de tinción /muerto. Tawakoli et al. [7] en comparación diferentes vivos /muertos "tinciones para la detección y cuantificación de microorganismos adherentes"
en la biopelícula oral inicial. En línea con la literatura anterior estos dos artículos demuestran que los intentos serios se han hecho en las últimas décadas para definir los diferentes estados entre los muertos y vive microorganismos (marinos y orales), y que "la tinción de viabilidad" o "técnicas de tinción vital" han sido y todavía se utilizan como un ensayo para superar el problema de distinguir entre los microorganismos vivos y muertos en las biopelículas.
en los últimos años cada vez que se haya familiarizado con las manchas de la vitalidad /viabilidad disponibles en el mercado, especialmente el ensayo BacLight (más científicos en la investigación biofilm dental BLA; BacLight ™ en vivo /muerto técnica de maquillaje). Sin embargo, este principio tinción tiene graves deficiencias cuando se aplica a muestras de biofilm de múltiples especies naturales no definidos. Los resultados de esta y otras técnicas de tinción deben ser comparados con las técnicas microbiológicas clásicas como la evaluación de las unidades formadoras de colonias (UFC) y, más fiables, el cálculo de la eficiencia de plaqueo bacteriana (PE). Estas comparaciones con un "patrón oro" son muy raros cuando se utilizan kits comerciales en la investigación de biopelículas. Por otra parte, los componentes de estos colorantes vitales pueden ser potencialmente mutagénicos.
En resumen, el objetivo de este manuscrito es debatir la base, la utilidad y el riesgo de manchas "viables" y "vitales", especialmente en la investigación de biopelículas, con atención específica a los biofilms dentales naturales y tinción vital fluorescente con fluoresceína diacetato /bromuro de etidio [8]. Desde un punto de vista científico, es importante que los datos derivados de este tipo de técnicas de tinción deben reflejar el estado bacteriana correctamente.
Discusión
¿Cuál es la raíz del problema?
Desde el punto de vista del debate holístico abarca diferentes niveles. En primer lugar, la discriminación de los microorganismos vivos o muertos representa un problema crucial en bacteriología (medio ambiente). Este problema básico ha existido durante décadas, y aún no ha sido resuelto. A este respecto, los términos "vida" y "viabilidad" se utilizan a menudo y muy a menudo mezclados - algunos investigadores intercambian por completo estos términos [9]
En segundo lugar, "manchas vitales" son por lo general sólo sustitutos, pero son rápidos y sencillos. dispositivos en los estudios que examinan, por ejemplo, el efecto antibacteriano de las sustancias. Aquí el problema es la gran variedad de sustancias de tinción y por lo tanto de los principios de tinción, de modo que el "gran cantidad de opciones añade a la confusión"
[10]. Del mismo modo
Pamp et al. [11] Estado: "Las manchas más recientemente desarrollados, como las manchas Syto .... puede manchar de manera eficiente las células en prácticamente cualquier color del arco iris "con descuento que puede sonar gracioso -. sino que simplemente refleja el problema. Como se acaba de mencionar, Tawakoli et al. [7] combinaciones de varias manchas utilizado (por ejemplo FDA, CFDA, TCFDA, EB, así como SYTO 9 /PI, Sytox rojo, además de calceína AM). Davey [10] se refiere también a la FDA, PI y SYTO 9, pero por otra parte a sustancias como SYTO Me verde, DIBAC4, pironina Y, rodamina 123 y naranja de tiazol. No es de extrañar que este autor [10] se refiere a otros cuatro comentarios sólo para informar sobre el "modus operandi" Red de los diferentes manchas fluorescentes y la "gran diversidad de posibilidades en cuanto a la selección de la mancha, concentración, tiempo de tinción, etc ".
al analizar más a fondo, el problema se vuelve aún más compleja. Algunos autores critican el uso limitado de yoduro de propidio (PI) como la viabilidad celular (sic!)
Indicador [12, 13], mientras que otros monitorizadas marcadas diferencias entre SYTO 9 y 12 SYTO con respecto a la influencia de porinas en la cinética de absorción de estos colorantes [14]. Esto significa que cuando se evalúan sustancias antibacterianas alterar la integridad de la membrana celular al uso de esas técnicas vitales de tinción puede ser engañosa. Un aspecto inherente a este problema, a saber, la idoneidad de los métodos de tinción, es la dependencia de las concentraciones de las manchas 'de los resultados (véase más adelante).
En tercer lugar, los usuarios son en su mayor parte por desgracia, sin saber que este tipo de pruebas "seductoras" sólo se han validado para un número muy limitado de especies bacterianas [13, 15]. De 15 000 "hits" (250 comentarios) generados en PubMed pidiendo "citometría de flujo & amp; bacterias ", sólo tres se quedaron después de la filtración de la base de datos cuando se utiliza" biopelícula "como un término rastreo adicional. Ninguno de estos tres artículos contribuye al debate.
Es crucial que las manchas "vitales" y, mucho más importante, sus combinaciones se compararse directamente con los datos bacteriológicos convencionales. Como se discute en detalle más adelante esto no puede ser la evaluación de CFU, pero de PE. En odontología algo de trabajo correspondiente se hubiera realizado en un solo o un número de especies lúcida in vitro
sin llevar a cabo pruebas bacteriológicas [6, 16-18], mientras que algunas empresas utilizan este método de tinción de confiar en sí misma
en su fiabilidad [ ,,,0],19, 20]. Cuando la combinación SYTO 9 /PI fue de hecho relacionado con las evaluaciones correspondientes microbiológicos el resultado era incompatible [21-23]. En nuestra opinión, es imposible averiguar los estudios en los ejemplos particulares de estos colorantes vitales y sus combinaciones se comparan adecuadamente y relacionados con los datos microbiológicos en relación con especies múltiples biopelículas naturales como la placa dental.
Por último, los colorantes pueden ser o son tóxicos o mutagénicos . Con respecto a la lista de compuestos, como se ha mencionado anteriormente y Fuente de [7] y [10], se debe determinar si existe un daño o riesgo en el uso de estas sustancias.
Viabilidad frente Vitalidad
Netuschil [8] registraron 49 términos para describir los "estados de vida" de los microorganismos (por ejemplo: los microbios activos, el crecimiento críptica, recuento viable directa [DVC], la inactividad progresiva, la latencia vegetativa, las células enanas, las células moribundas, nonculturability, nonplateable, la supervivencia de estasis, viabilidad reproductiva, viable pero no cultivable [VBNC], no viable pero resuscitable, vital, viviform, etc.), como se cita en 34 diferentes publicaciones correspondientes [1, 2, 4, 24-54] (cf. Tabla 1). Mientras que la tabla muestra las referencias de 1962 hasta 1998, el debate es antiguo y ya era relevante en el cambio de la 19
ª a la 20 siglo XX [55-60]. Un ejemplo es el "Gran Placa de Count Anomalía" [61, 62] Véase también [63]. Incluso en ese momento se debatieron tinciones vitales para ser utilizado como un ensayo para superar los inconvenientes de las técnicas de cultivo [64-68]. Parece que el pasado debate [69] fue "revitalizado" a comienzos de este siglo [41, 70-78]. Cabe destacar que algunos términos (por ejemplo, en estado latente, VBNC) son aún más relevantes cuando se refiere a las bacterias probióticas [79, 80] .Tabla 1 Los términos utilizados para describir los "estados de vida" de los microorganismos (a partir de [8])
Aclimatación [ ,,,0],30]
"Las células quiescentes" [17]
microbios activos [20]
reanimación [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive, "vitalidad" [15]
"apagar las células", "estado de apagado" [17]
"Anabiotic (inactivo) estado "[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" bolsas de enzimas "[4, 12]
la hambruna [10, 17, 29]
crecimiento Cryptic [24, 26, 27, 29]
- "La verdadera hambre" [15]
Culturable, culturability [4 , 10, 11, 31]
"sustrato muerte acelerada", "sustrato
- no cultivable, nonculturability [22, 24]
estrés acelerado" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
Debilitamiento [9]
Supervivencia [5, 11, 20, 22, 29]
muerto, muerte [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29]
- "supervivencia" [3]
- "muerte fase "[15, 29]
-" Stasis supervivencia "[25]
" Die-off "[31]
viable [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
recuento viable directa (DVC), método DVC [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- no viable [3, 15, 16, 20]
viabilidad [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
Durmiente, la latencia [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32]
- "viabilidad aparente" [6, 15]
- "letargo progresivo" [1, 30]
- "viabilidad reproductiva" [23]
- "letargo vegetativo" [15]
CD - "La verdadera viabilidad" [6]
células enanos, enanos inactivos, ultramicrobacteria [6, 14, 15, 29, 32]
"viable pero no cultivable" ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
La detención del crecimiento [25]
- VBNC hipótesis [2-4 , 7]
"Killer fenotipo" [15]
- estado VBNC [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34]
lisis [20]
- [31] las células
moribundos "viable, pero no recuperable" [29]
- "Non -viable pero resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24]
- "no cultivables pero viables" [28]
protista pastoreo [ ,,,0],11]
Vital, vitalidad [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Referencias:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. 1996 [41]
3Bogosian et al. 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton de 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Campana et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver 1997 [53]
17Koch 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Desafortunadamente, varios de los términos encontrados y utilizados en publicaciones son incorrectas, engañosas o incluso paradójica, especialmente el término usado a menudo "viables pero no cultivables (VBNC)", que difumina la línea entre la vitalidad y viabilidad. Para minimizar la confusión tanto como sea posible que se refieren a Kaprelyants et al. [4]: "Se han presentado varias clasificaciones de los estados fisiológicos de los microorganismos. Hemos sugerido anteriormente
[3] que todos los tipos de células consideradas puede reducirse a tres grupos, a saber: "viable" para referirse a una célula que puede formar una colonia en una placa de agar, «vital» para referirse a uno que sólo puede hacerlo después de la reanimación y "no viable" para hacer referencia a una celda que no puede hacerlo bajo cualquier condición probada. De acuerdo con esta terminología, las células latentes son vitales "gratis (ver Tabla 2) .Tabla 2" Glosario de términos utilizados para describir los 3 principales estados fisiológicos definidos en el presente documento "(citado en [3])
estado fisiológico
Fenotipo
viable
Capaz de división; formará una colonia en una placa de agar.
Vital o durmiente
No se puede dividir o para formar una colonia en una placa de agar sin una fase de reanimación precedente .
no viables
Incapaz de división; no formará una colonia en una placa de agar bajo cualquier condición probada.
Utilizamos las frases "hambre" o "células que mueren de hambre 'para referirse a las condiciones ambientales en las que se incuban las células, en lugar de a un estado fisiológico. Por lo tanto las células de hambre (o células que han sufrido otras tensiones) pueden o no pueden estar en estado latente. A pesar de su uso histórico de estos términos, las frases "directa recuento viable 'y términos incorrectos' viables pero no cultivables-'son, puesto que tales células no son viables como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con [4] nos definir "viable" estrictamente como "capaz de crecer". En este sentido cualquier otra prueba, por ejemplo pruebas de elongación (DVC; [50]) o métodos de tinción, no son más que servidores proxy, ya que ningún tipo de tinción puede demostrar la viabilidad. Por lo tanto, el término "mancha de viabilidad" es un término equivocado por definitionem
y estas manchas correctamente debería llamarse "manchas vitales". Por desgracia, el término equivocado es usado frecuentemente por Invitrogen Ltd (BacLight ™), y, en consecuencia, - pero incorrectamente - adoptado por los usuarios de estas pruebas de vitalidad Francia El BacLight ™ kit de viabilidad bacteriana (BacLight Ensayo, BLA)
. según el fabricante [81] BLA consta de dos manchas, yoduro de propidio (PI) y SYTO 9, que tanto los ácidos nucleicos de la mancha. SYTO9 es una membrana permeable de intercalación molécula fluorescente verde y tiñe todas las células. Por el contrario, el PI es una mancha roja de intercalación y es impermeable a la membrana, y por lo tanto queda excluida por las células "sanas". El fabricante describe que PI tiene una afinidad más fuerte a los ácidos nucleicos que SYTO 9; Por lo tanto, cuando las dos manchas están presentes dentro de una célula, SYTO 9 será desplazada a partir de ácidos nucleicos y la célula (s) será fluorescente en rojo. Para probar las poblaciones de mecanismo [82] llevaron a cabo mediciones fisicoquímicas "libres de células" con la "Viabilidad de la mancha, Bac
luz", y podría revelar que el principio de tinción no es tan simple. Este autor establece una llamada transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), sin embargo, bajo ciertas condiciones de tinción, emisión SYTO 9 supera la emisión PI. El aumento de la concentración de SYTO 9 puede por lo tanto mejorar la emisión PI, provocando una doble tinción de las células. Las acciones [82] subraya varias veces que para una interpretación de los resultados de tinción "las concentraciones relativas de PI, SYTO9 y ADN fueron de importancia crucial" Opiniones y "que los experimentos de control o de validación apropiados (debería ser) realizado".
tinción y /o FRET doble también fue documentado por otros autores [41, 83], que examinaron los parámetros de viabilidad de cultivos viables y mató con formaldehído o sometidos a tratamiento UVA, respectivamente. La siguiente discusión del manual SONDAS MOLECULARES debe considerarse en este contexto
En cuanto a la fiabilidad del "kit de viabilidad" que se utiliza en la investigación de biopelículas nos gustaría citar directamente la hoja (s) del producto de sondas MOLECULAR., 2001; Información sobre el producto LIVE /DEAD ® Kit ™ BacLight viabilidad bacteriana, Revisado: 26-Enero-2001, así como de revisión: 15-julio-2004 (por la que ésta representa la versión más reciente en octubre de 2013) [81] :( I) "... manchas difieren tanto en sus características espectrales y su capacidad para penetrar en las células bacterianas sanos. Cuando se usa solo, la mancha SYTO 9 etiquetas generalmente todas las bacterias en una población - aquellos con membranas intactas y aquellas con membranas dañadas. En contraste con yoduro de propidio penetra sólo las bacterias con membranas dañadas, causando una reducción en la tinción de SYTO 9 cuando los dos colorantes están presentes. Así, con una mezcla adecuada de los SYTO 9 y yoduro de propidio manchas, bacterias con membranas celulares intactas mancha verde fluorescente, mientras que las bacterias con membranas dañadas mancha roja fluorescente. "
(II)" Las bacterias de la tinción con ya sea L7007 o L7012 Kit - 4.1 Ajuste las suspensiones de E. coli (vivas y muertas) a 1 × 10
8
bacterias /ml o las suspensiones de S. aureus (vivas y muertas) a 1 × 10
7
bacterias /ml. S. aureus suspensiones normalmente debe ser de 10 veces menos concentrada que la E. coli para la microscopía de fluorescencia. "
de ahí que el número de E. coli y S
. aureus
distintos por un logaritmo. gratis (III) por último, debido a: (I) una mezcla de 50% de vida y el 50% de las bacterias muertas no suele conducir a una fluorescencia 50/50 verde /rojo . Y viceversa:
50% de las bacterias fluorescentes verdes en una muestra no quiere decir que hay un 50% de células vitales. Por lo tanto, "coeficientes de fluorescencia verde /rojo
(tiene que ser) calculado para cada proporción de E. Coli viva /muerta."
Este último punto fue confirmado por Hanning y col . [6] en su documento relativo a la viabilidad de S. mutans in vitro
. Se determinó que una "concentración inicial de bacterias viables en el ensayo de" Red de 50% conduce a diferentes "/bacterias muertas de emisión de emisión relación vitales" valores
de aproximadamente 9,5, 6,5 o 8,0 en sus muestras de control de NaCl. Además, Hannig et al. [6] afirman que "la proporción de bacterias avital aumentó como se indica por la relación de avital a las células vitales. Se varió entre 0,1 ... y ... 29.0 ... Después del enjuague con clorhexidina, la proporción asciende a 190 (6 h) o 10.2 (12 h) ... "
Tomando la información de su figura uno en cuenta, no queda claro qué es esto diferente relaciones de hecho pueden significar en términos de valores de vida "real".
en resumen, los puntos antes mencionados de tres descritos en el manual muestran BLA del usuario que, de conformidad con las existencias [82], una "mezcla apropiada
" de las dos manchas debe ser determinado y establecido para cualquiera de las especies individuales de bacterias antes de usarlos en un experimento. Esto puede ser posible en una situación en
vitro, donde el BLA puede ayudar a ahorrar tiempo en el largo plazo, tras cuidadosa, y el tiempo que consume pasos de calibración críticos para cada especie bacteriana individuales. Sin embargo, esto es imposible de manejar en forma natural biofilms debido a la singularidad de las biopelículas de placa de matriz en donde en realidad puede haber más o menos de 1000 especies microbianas diferentes [84]. Por otra parte la aplicación de la mancha SYTO 9 /IP no se considera adecuado para las biopelículas, debido a los fenómenos de difusión debido a exo-polímeros que resultan "en una subestimación de los recuentos viables"
[21].
Sin embargo, no parece ser un inconveniente adicional. Giertsen et al. [23] criticaron discrepancias considerables entre la vitalidad de biopelículas esperado y el resultado de la tinción de SYTO 9 /PI. Por otra parte, estos autores describen un comportamiento inestable y un cambio de color de la tinción de verde a rojo, es decir, la de comprobar el
más bacterias "muertas". Recientemente estos resultados se explican por Tawakoli et al. [7] postulando que las células teñidas perdieron su viabilidad poco después de la intercalación de los tintes, escribiendo: "Esta hipótesis fue confirmada por el análisis de TEM en el presente estudio (Figura dos). Las imágenes mostraron inmensa lisis y la destrucción de las células adherentes .... "
Tabla 3 enumera una gran cantidad de estudios [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [ ,,,0],82, 83, 85-98] que utiliza la BLA. Sin embargo, en casi todos los estudios que tenía que aclarado (a) si las biopelículas de placa como o, al menos, se evaluaron muestras de saliva, o si las investigaciones se hicieron con especies bacterianas individuales y /o (monoespecíficos) biofilms artificiales; (B) si el régimen de la tinción de las muestras de biofilm se ajustó de acuerdo con el manual de BLA (validación); (C) factor de dilución que se utilizó entre SYTO 9 y PI, debido a un procedimiento de validación de acuerdo con (b); (D) cómo se siguió el procedimiento de incubación, sobre todo el tiempo de incubación de las muestras de bacterias junto con la mezcla de las manchas; (E) si los resultados de la BLA se compararon con otros parámetros, y si estos últimos eran apropiado (g) o no (f); (H) si los resultados de ajuste con los otros parámetros (ya sea adecuado o no) la BLA. Durante todo ello, estábamos interesados (i) si los resultados BLA cumplen las expectativas de la users.Table 3 La información de antecedentes sobre el uso de la prueba BacLight® (BLA) para la evaluación de (dental) vitalidad biopelícula
estudios utilizando el BLA (n = 30) guía empresas [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [82] * [83, 85-98]
gratis (a) ¿se biopelículas en placas como evaluados
n:? [5, 16-18, 22, 23, 41, 82, 83, 86], [87, 93, 96-98]
Sí: [6, 7, 9, 19, 20, 71, 73, 85], [88-92, 94, 95]
(b) validación
No: [5, 7, 9, 16-18, 20, 22, 23, 41], [71, 73, 82, 85-91, 94-98]
Sí: [6, 19 ?, 83, 92, 93?]
factor de (c) La dilución
No se indica: [16, 18, 23, 73, 86, 94, 95, 98]
1: 1 [6, 7, 9, 17, 20, 22, 41, 71], [85, 87-92, 96, 97]
página 2: 1 [93]
4: 1 [5]
6: 4 [19]
1: 6 [83]
(d) procedimiento de incubación
No se indica: [16, 18, 71, 86, 95, 96]
10 min, RT [6, 7, 20]
15 min, RT [5, 9, 17, 19, 22, 23, 41, 73], [85, 87 -91, 97, 98]
20 min, RT [83, 92]
& gt; 20 min, 2 ° C [93]
30 min [94]
(e) Comparación
No: [16-18, 20, 22, 71, 82, 83, 85, 88], [90, 91, 94, 95]
Sí: [5-7, 9, 19, 23, 41, 73, 86, 87], [89, 92, 93, 96-98 ]
(f) ... con métodos inadecuados
[6, 7, 9, 19, 23, 41, 73, 86], [87, 89, 92, 93, 96-98]
(g) ... con los métodos adecuados
[5] *
(h) ¿Se traduce ajuste a la otra la BLA parámetros
n:? [7, 19, 86, 89, 92, 93] (DAPI), [96, 97]
Sí: [5, 23, 41, 93] (FDA), [98]
(i) ¿los resultados BLA cumplen las expectativas del usuario (s) guía empresas no:? [23, 83, 86]
Sí: [5, 7, 16, 18-20, 22, 41, 71, 82], [85, 87-98]
(a) (i) véase la descripción en el texto
no se indica:. o bien no se proporcionó información por los autores, o los autores afirmaron que la tinción se llevó a cabo "de acuerdo con las instrucciones del fabricante", lo que significa generalmente un factor de dilución de 1 : 1, y un tiempo de incubación de 15 minutos
* [5]:. Decker registrado los recuentos de bacterias totales (como log BC /ml) y la CFU (como log CFU /ml), sin embargo no dio datos relativos a la PE .
* [82]:. mediciones fisicoquímicas "libres de células" para elucidar el mecanismo del procedimiento de tinción BacLight
de las 30 investigaciones que figuran en la Tabla 3 de la mitad (15) fueron clasificados en la categoria "plaque- como biopelícula ". Esta alta parte es debido al hecho de que hemos tratado de considerar la literatura relativa a biofilms orales. También se incluyó saliva Natural por ejemplo
[89-91], así como "placas de microcosmos", que se cultivaron en una boca artificial y /o eran por ejemplo establecido a partir de saliva [20, 71, 92] o de una placa subgingival de la muestra [96]. Algunos otros estudios trataron las bacterias de aguas profundas de sedimentos o muestras de aguas residuales [73, 93], que fueron considerados por nosotros como sistemas de múltiples especies naturales.
Es sorprendente, pero espera, que se basan sólo cinco estudios en un procedimiento de validación precedente (línea (b) en la Tabla 3) [6, 19, 83, 92, 93], de la cual dos casos eran incluso cuestionable [19, 93]. Sin embargo, una calibración podría suponer allí. La descripción de Filoche et al. [92] aclara la metodología laboriosa (cf. sus Materials & amp; sección Métodos, párrafos 2.5 Generación de la norma viabilidad; 2.6 Preparación de la norma viabilidad de placa individual, 2.7 Preparación de la norma viabilidad agrupados; 2,8 protocolo de tinción para Live /DEAD® BacLight ™ y 2,9 medición y análisis de datos de fluorescencia). Sorprendentemente, el procedimiento de calibración de estos autores [92], incluso parecía funcionar cuando las muestras y los controles se fijaron en paraformaldehído al 4%, y /o se almacenaron durante un máximo de tres meses.
Como consecuencia de no tener ninguna validación de los usuarios máximos confiar en los consejos del fabricante con respecto al factor de dilución entre las dos manchas Syto 9 y PI. Sólo cuatro grupos de investigación no siguieron la recomendada dilución 1: 1. Curiosamente, sus factores abarcan un intervalo de 1: 6 hasta 4: 1 (línea (c) en la Tabla 3). Esto refleja generalmente la naturaleza seductora del procedimiento de tinción [13] y las peticiones de los investigadores tienen hacia una aplicación fácil y rápida. La preocupación de las poblaciones [82] que las concentraciones relativas de PI, SYTO9 y los ácidos nucleicos son de crucial importancia es sobre todo descuidada por los usuarios.
A primera vista, lo mismo es cierto para el procedimiento de incubación (línea (d) en Tabla 3), sin embargo, esto podría ser un problema más grave. Veintidós de los usuarios no indicó el procedimiento o se apoyaron en las instrucciones del fabricante. Algunos otros reducen la incubación recomendado 15 minutos a 10 minutos [6, 7, 20], mientras que otros ampliaron el tiempo de incubación entre las manchas BacLight y sus muestras a 20 o incluso 30 minutos [83, 92-94]. Sin embargo, el hallazgo de Tawakoli et al. [7] que las células teñidas bajo investigación cambiarse o incluso perdieron su viabilidad poco después de la intercalación de los colorantes sugiere que el tiempo de incubación "simple" es un factor crucial y potencialmente destructiva. Es a la pregunta de si un tiempo de 10, 20 o 30 minutos ( "en la oscuridad", pero a temperatura ambiente, y sólo una vez en 2 ° C [93]) puede ejercer un efecto de deterioro sobre el resultado del procedimiento de tinción. [7]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
