Abstract
Antecedentes
implantes de titanio en la cavidad oral están cubiertas con una película saliva derivados a los que los microorganismos que colonizan temprana tales como Streptococcus oralis
puede unirse. Los perfiles de proteínas de unas películas salivales en titanio no se han caracterizado bien y las proteínas de importancia para la unión son por lo tanto desconocido. bacterias Biofilm presentan diferentes fenotipos de sus homólogos planctónicas y el contacto con las proteínas salivales puede ser un factor que contribuye a la inducción de cambios en la fisiología. Hemos caracterizado salivales unas películas de superficies de titanio y se investigó cómo el contacto con superficies no revestidas de titanio y saliva con recubrimiento afecta a la actividad metabólica de las células adherentes de S
. oralis
.
Métodos
unas películas salivales sobre superficies de titanio lisas se desorbe y estos, así como la saliva humana purificada, se sometieron a electroforesis en gel de dos dimensiones y espectroscopía de masas. Un modelo de flujo de células de placas paralelas se utilizó para estudiar la unión de un aislado fresco de S
. oralis
a superficies de titanio sin recubrir y recubiertos de saliva. La actividad metabólica se evaluó mediante CTC kit de la luz y vitalidad confocal de barrido del Bac
microscopía láser. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se analizaron mediante la t de Student o ANOVA-test
.
Resultados
IgA secretora, se identificaron α-amilasa y proteínas cistatinas como dominantes en las unas películas salivales. adsorción selectiva de proteínas se demostró mediante el enriquecimiento de la proteína y la ausencia de zinc-α
relativa a la saliva de 2-glicoproteína prolactina-inducible. La adhesión de S
. oralis
al titanio condujo a una sobre regulación de la actividad metabólica en la población después de 2 horas. En presencia de una película salival, este efecto se ha mejorado y sostenido durante el siguiente período de 22 hora.
Conclusiones
Hemos demostrado que la adherencia a las superficies lisas de titanio bajo flujo provoca una sobre regulación de la actividad metabólica en el temprano por vía oral colonizador S
. oralis
, muy probablemente como parte de una adaptación al modo de biofilm de la vida. El efecto se ve reforzada por una película salival que contiene sIgA, α-amilasa, cistatinas y proteínas de prolactina inducible, que era, por primera vez, identificado como un componente abundante de unas películas salivales en titanio. Se necesitan más estudios para aclarar los mecanismos que subyacen en el efecto del contacto de la superficie sobre la actividad metabólica, así como para identificar las proteínas salivales responsables de mejorar el efecto.
Palabras clave
bacterias microbiana biopelícula dental implante estreptococos Electrónico material complementario
la versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes Francia el cavidad oral humano alberga un gran número de. diferentes especies bacterianas que se encuentran en complejos, las biopelículas de especies múltiples. En los dientes, estos biofilms se conocen comúnmente como la placa dental. Fundamental para la formación y el desarrollo de la placa es la adherencia de las especies pioneras tales como Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis Streptococcus gordonii Opiniones y
, así como Actinomyces Naeslundii
a la película salival que recubre la superficie del diente [1, 2]. Una vez que la formación de biopelículas se ha inicializado y la superficie del diente naciente está colonizado, co-adhesión de colonizadores posteriores conduce a la formación de biofilms orales maduros [3]. El desarrollo temprano de biofilms en implantes dentales no ha sido bien caracterizada, pero la secuencia de la colonización microbiana se cree que es similar a la de los dientes en la misma cavidad oral [4, 5].
Los dientes y los implantes dentales, así como las superficies mucosas, se cubren con una película que es una película delgada de proteínas adsorbidas derivados principalmente de saliva. proteínas película proporcionan una gran variedad de receptores potenciales para la unión de los primeros colonizadores. Una combinación de in vivo e in vitro
estudios utilizando enfoques basados en anticuerpos y la proteómica, ha mostrado que la película de esmalte adquirido contiene una gama de diferentes proteínas salivales incluyendo lisozima, histatinas, statherins [6], α-amilasa , cistatinas, la IgA secretora (sIgA), lactoferrina y proteínas ricas en prolina (PRP) [7], así como la gran mucina salival, MUC5B [8]. Para un resumen completo de las proteínas detectadas en unas películas de esmalte ver Siqueira et al
., 2012 [9]. La composición de una película adherente, así como la densidad y la conformación de las proteínas presentes en ella, se piensa generalmente para ser influenciado por las propiedades físico-químicas del sustrato, pero, hasta ahora, la composición general de las unas películas salivares formado en superficies de titanio modificadas de manera diferente son desconocidos. A pesar de la existencia de sólo unos pocos estudios, algunas proteínas salivales incluyendo cistatinas, sIgA, α-amilasa y proteínas ricas en prolina se han identificado en la película adherente formado en titanio in vitro
mediante Western Blot [10, 11]. Sin embargo, en todos estos estudios, los métodos utilizados para preparar saliva para su uso como una película puede tener un gran impacto en los resultados obtenidos. Por ejemplo, técnicas de filtración y centrifugación pueden eliminar grandes poblaciones de proteínas salivales que conducen a la formación de unas películas salivares que no son representativos de los presentes in vivo
. Francia El reconocimiento de que las biopelículas microbianas son un factor importante asociado con el fracaso de los implantes dentales [12], ha dado lugar a muchas investigaciones sobre la adhesión bacteriana a superficies de titanio. En vivo
, donde la adherencia de las bacterias y la formación de saliva película ocurren en paralelo, S
. oralis
y S
. mitis
estaban entre los primeros colonizadores predominantes en las superficies de vidrio recubiertas de titanio y no Actinomyces
especies se encontraron [13]. In vitro
, la presencia de saliva en ambas superficies lisas o rugosas moderadamente se ha demostrado que tanto aumentar como disminuir la adherencia de la colonizador temprano, S
. oralis
, [10, 14], mientras que la unión de un
. naeslundii
a titanio no se vio afectada por la presencia de una película salival [11]. En general, los resultados de los estudios de adherencia bacteriana a titanio en presencia de saliva no han dado una imagen clara y mientras que algunas de las diferencias observadas pueden atribuibles a la saliva se utiliza, la variación de las cepas bacterianas y tipos de superficie de titanio también pueden contribuir a la falta de consenso.
Si bien el desarrollo del biofilm es importante para el desarrollo de la enfermedad oral, factor de crucial importancia es la fisiología y el nivel de actividad de las bacterias adheridas. adaptación de las bacterias al modo de biofilm de la vida se sabe que está asociada con importantes cambios en la transcripción y la síntesis de proteínas [15]. Por ejemplo, en Porphyromonas gingivalis
transcriptomic análisis comparativo reveló que un gran número de genes que se expresan diferencialmente en las células del biofilm en comparación con sus homólogos de flotación libre [16]. En un estudio en el Streptococcus mutans
, la tasa relativa de síntesis de al menos 25 proteínas diferentes se mejoró el plazo de 2 horas de la unión a una superficie de vidrio. Estas proteínas se asocian principalmente con hidratos de carbono catabolismo [17] lo que sugiere que los cambios en la actividad metabólica pueden ocurrir durante la adhesión a las superficies. Poco se sabe actualmente, sin embargo, sobre el estado metabólico de las células durante las interacciones con proteínas peliculares en las primeras etapas de la formación de biopelículas. El objetivo de este trabajo fue estudiar la forma en la adherencia a las superficies de titanio afecta a la actividad metabólica de los primeros colonizadores S
. oralis
y para determinar el efecto de una película salival en este proceso. Para arrojar luz sobre la que las proteínas salivales pueden influir en la adherencia y la actividad metabólica, se han identificado las proteínas predominante presente en una película salival formadas en titanio.
Métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
un aislado clínico fresco de S
. oralis gratis (89C) se obtuvo de un paciente con una infección en curso alrededor del implante después de la aprobación ética había sido obtenida de la Facultad de Odontología [14]. Las bacterias se cultivaron durante la noche en agar sangre en una atmósfera de 5% de CO 2 en el aire a 37 ° C. Las colonias se suspendieron en 120 ml tampón fosfato salino [0,15 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,4 (PBS)] para dar una DO 600 nm = 0,6. Para los experimentos de células de flujo, se añadió un volumen igual de PBS para reducir a la mitad la concentración celular antes de la formación de biopelículas, mientras que para los experimentos planctónicos la suspensión bacteriana original, se mezcló con un volumen igual de PBS, o conjunto 50% saliva humana para dar una concentración final de 25% de la saliva. COLECCIÓN y preparación de la saliva
Toda la saliva recogida en hielo durante 1 hora a partir de diez individuos sanos se reunió y se preparó como se describe anteriormente [18] después de la aprobación ética se habían obtenido a partir de la Facultad de Odontología. Brevemente, la muestra se mezcló con un volumen igual de PBS, se agitó suavemente durante la noche a 4 ° C y se centrifugó en una centrífuga Beckman Coulter Avanti JE (Beckman JA 20 rotor; Beckman Coulter, Brea, CA) (20 minutos, 30 000 g
, 4 ° C). El sobrenadante se sometió a centrifugación en gradiente de densidad isopícnica en CsCl /0,1 M de NaCl en un Beckman Coulter Optima LE-80K Ultracentrífuga (rotor Beckman Ti 50.2, a partir de la densidad de 1,45 g ml -1) a 36.000 rpm durante 90 horas a 15 ° C. Las fracciones que contenían bacterias se desecharon y los restantes se agruparon, se dializaron frente a PBS y se almacenaron a -. 20 ° C
superficies de titanio
Las superficies de titanio utilizados en este estudio eran de titanio de grado IV comercialmente puro, que era suave, con una rugosidad media de la superficie (S a) de 0,1 micras [14]. Las placas (99 x 25 x 0,8 mm) se convirtieron, limpiado con detergente, enjuagarse con agua destilada y se esterilizan mediante irradiación γ (ELOS Pinol A /S).
Caracterización de unas películas de saliva
placas de titanio Dos, separados por un espaciador de caucho con espesor de 1,6 mm, se montaron en una celda de flujo y las superficies recubiertas con todo 50% durante la noche saliva humana. Después de este tiempo se drenaron las células de flujo y las superficies lavadas (2 x 2 min) con PBS en una placa basculante. Para quitar las unas películas asociadas a la superficie, una mezcla de Tween 80 (0,006% v /v) y Triton X-100 (0,012% v /v) se introdujo y toda la celda de flujo se coloca en un baño de ultrasonidos durante 1 hora. El contenido se drenaron y se recogieron antes de repetir este paso durante otros 15 minutos. desorbates proteínas recogidos después de cada lavado se reunieron y se determinó la concentración de proteína usando un kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences). Un volumen correspondiente a 20 g de proteína se sometió a 2DE. Brevemente, el desorbato se diluyó con tampón de rehidratación y se coloca en un casete de re-hinchazón con 18 cm pH 4-7 tiras IPG lineales (GE Healthcare Life Sciences) en la parte superior. La rehidratación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 horas bajo aceite de silicona. El isoelectroenfoque se llevó a cabo utilizando un Multiphor II (GE Healthcare Life Sciences) con agua de enfriamiento a 15 ° C suministrado por Pharmacia Multitemp II. El enfoque se inició a 150 V durante 1 hora y continuó a 300 V durante 3 horas, 600 V durante 3 horas, 1.200 V durante 12 horas y finalmente 3.500 V durante 20 horas. Después de enfocar, las tiras IPG fueron almacenadas a -80 ° C. Antes de ejecutar en la segunda dimensión, las tiras de IPG se equilibraron primero en tampón Tris 50 mM pH 6,8 que contiene 2% de SDS, 26% de glicerol y DTT 16 mM durante 15 minutos y después en 50 mM de tampón Tris pH 6,8 que contiene 2% de SDS, 26 % de glicerol, 250 mM yodoacetamida y 0,005% de azul de bromofenol otros 15 minutos. Las tiras IPG equilibradas fueron incorporados en la parte superior de 14% en geles de poliacrilamida (20 × 20 × 0,1 cm) usando 0,5% (w /v) de agarosa fundida. SDS-PAGE se realizó a una corriente constante de 15 mA en gel -1, 10 ° C, durante la noche en una celda xi Protean II (Bio-Rad) con patrones de masa molecular arco iris de alta gama (GE Healthcare Life Sciences) de ejecución en el lado ácido de las tiras IPG. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie o plata de acuerdo con los protocolos de GE Healthcare Life Sciences.
Identificación de proteínas en geles 2D por LC-MS /MS
puntos de interés fueron extirpados manualmente de azul brillante de Coomassie geles teñidos 2DE de toda la saliva y se sometieron a LC-MS /MS como se describe anteriormente [19]. Brevemente, las proteínas se redujeron con DTT (60 ° C, 20 minutos), se alquila con yodoacetamida (25 ° C, 10 minutos) y después se digirió con tripsina (37 ° C, 8 horas). Los péptidos trípticos se separaron y se sometieron a MS. picos de péptidos se deconvoluted de forma automática y listas de masas en la forma de la mascota de archivos genéricos utilizados como entrada para las búsquedas de la mascota de MS /MS iones de la base de datos de NCBInr utilizando el servidor Web Matrix Science (http:.. //www matrixscience com) .
Determinación de la cobertura de la superficie y la viabilidad
viabilidad de las células en suspensión en PBS o 25% saliva total se evaluó por tinción de una gota de la suspensión con el Bac Live /Dead
kit de tinción de luz (Life Technologies, Estocolmo , Suecia) al inicio del estudio (tiempo 0), después de 2 y 24 horas y la visualización con un confocal de barrido láser microscopio invertido (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corp.). El sistema de celda de flujo placa vertical, paralelo utilizado ha sido descrito previamente (14). En pocas palabras, S
. se pasaron oralis
células más de dos superficies de titanio (99,25 x 25,25 x 0,8 mm) separadas por un espaciador de goma 1.6 mm, que eran o sin recubrir, se había recubierto con la saliva durante la noche. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 37 ° C y un flujo laminar de 42 ml h -1 se usan para modelar el flujo diario de saliva sobre las superficies orales. Todas las soluciones se introducen a través de la entrada inferior y la salida se produjo a través de la válvula superior. Inicialmente, las superficies se lavaron con PBS durante 30 minutos. a continuación, se introdujo la misma suspensión bacteriana en dos células de flujo; uno que contiene dos superficies sin recubrir y las otras dos superficies de saliva recubiertos que contienen de 2 o de 24 horas a 37 ° C. Después de este tiempo, las células de flujo se lavaron con PBS (como anteriormente) durante 30 minutos para eliminar las bacterias poco adheridas de las superficies. la cobertura de la superficie y la viabilidad de las células asociadas a la superficie se evaluaron en una de las placas de titanio en cada celda de flujo utilizando Bac Live /Dead
tinción Luz. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces utilizando cultivos bacterianos independientes.
Determinación de la actividad metabólica
para investigar la actividad metabólica de las células planctónicas, una parte alícuota se separó de la misma suspensión bacteriana utilizada para las medidas de viabilidad, se coloca en un ibidi Flow cámara de la celda y las células incubadas con el Bac
Kit CTC Light vitalidad (Life Technologies, Estocolmo, Suecia) en una cámara húmeda a 37 ° C durante 2 horas. Las diapositivas fueron vistos usando un CSLM. Para investigar la actividad metabólica de células adheridas, la segunda placa de titanio en cada celda de flujo, se incubó con el Kit Vitalidad Bac
CTC Light como anteriormente y las células counterstained con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol ( DAPI, Life Technologies, Estocolmo, Suecia). Las células teñidas se visualizaron utilizando un CSLM.
análisis de imágenes y estadísticas Opiniones sobre muestras teñidas con el Bac Live /Dead
kit de tinción de luz, diez imágenes al azar, cada uno con una superficie de 127,3 m 2 fueron tomadas para análisis de imágenes. Las imágenes se analizaron usando el BioImage
_L
paquete de software para cuantificar la cobertura de la superficie media, así como la proporción de en vivo (verde) y las células muertas (rojas) [20]. Para las muestras teñidas con el Bac
Kit Vitalidad CTC luz Para evaluar la actividad metabólica, análisis de imágenes se realizó mediante la observación de al menos 1000 células y contando el número de células metabólicamente activas (rojo /rosa) y células no activas (sin teñir en el muestras de suspensión o azul counterstained en las superficies de titanio). Los resultados obtenidos fueron evaluados usando
-test de la t de Student para comparar los dos grupos o un ANOVA de una vía con el post-test de Bonferroni para comparar tres grupos. Un intervalo de confianza del 95% fue elegido y los valores de p inferiores a 0,05 se consideró significativo.
Resultados
La formación de biopelículas en el titanio en las células de flujo comentario El capacidad de formación de biofilm de S
. oralis
se investigó en un sistema de celda de flujo que contiene dos superficies de titanio sin revestir. Las colonias de bacterias dispersadas en PBS se introdujeron en células de flujo y se dejaron adherir durante 2 ó 24 horas. Después de 24 horas, la cobertura de la superficie media se redujo en un 60% con respecto al que después de 2 horas, lo que sugiere que algunas de las células que se adhirió inicialmente desprenden con el tiempo (Figura 1). En la suspensión celular inicial, el nivel de viabilidad fue alta según lo revelado por tinción con el kit Bac
vivo Luz /Muerto. Después de 2 y 24 horas, la viabilidad de las poblaciones adherentes no fue significativamente diferente a la de la suspensión original, lo que indica que la unión a titanio no afectó adversamente a las células. Desde las superficies de la cavidad oral están cubiertas con una película salival, se investigó el efecto de la saliva en la adhesión y la viabilidad de S
. oralis
. En las superficies recubiertas con 25% saliva, la cobertura de la superficie media después de 2 horas (178 ± 103 m 2) no fue significativamente diferente a la observada en las superficies no recubiertas (p = 0,67) (datos no mostrados). En cuanto a las superficies no recubiertas, después de 24 horas la cobertura de la superficie media en la capa de saliva había disminuido (24,6 ± 7,4 m 2), lo que demuestra que las células bacterianas también separadas de estas superficies con el tiempo. El nivel de viabilidad de las células en la superficie recubierta de saliva no fue significativamente diferente a la de la superficie no revestida en el mismo punto de tiempo. Figura 1 imágenes que muestran la formación de biofilm por S. oralis sobre superficies de titanio sin revestir. Las bacterias en suspensión en PBS se dejaron formar biopelículas en las superficies de titanio en un sistema de celda de flujo de placas paralelas para las 2 y 24 horas. La viabilidad de las células se evaluó mediante /Dead Bac
ligeras manchas en vivo y ver con CSLM. cobertura de la superficie de las placas de titanio se evaluó a partir de diez imágenes al azar utilizando el BioImage
_L
paquete de software. Las barras de escala representan 10 micras y los insertos muestran células en doble ampliación.
La actividad metabólica en relación al contacto con las superficies metálicas y recubiertas de saliva
La actividad metabólica de S
. oralis
células se evaluó utilizando el kit Bac
vitalidad CTC luz, donde las células metabólicamente activas reducen la sal de tetrazolio incolora a un producto formazán insoluble haciendo que aparezcan rojos (o rosa en presencia del contraste DAPI azul). Células extraídas de agar sangre a tiempo 0 y dispersas en PBS mostraron un bajo nivel de actividad metabólica endógena (6 ± 1,5%) (Figura 2). Continúa la incubación de las células en PBS no tuvo ningún efecto significativo en el nivel de la actividad metabólica después de 2 horas (4 ± 0,5%) o 24 horas (2 ± 0,1%). Sin embargo, después de 2 horas en el modelo de célula de flujo, la población adherente contenía una proporción significativamente mayor de glóbulos rojos que indican que la actividad metabólica fue estimulado por el contacto con una superficie. Después de 24 horas, el nivel de la actividad metabólica dentro de la población adherente había disminuido pero aún era significativamente mayor que en la suspensión PBS original (p & lt; 0,01). Figura 2 imágenes que muestran la actividad metabólica de S. oralis en suspensión y se adhiere a las superficies de titanio sin revestir. Las bacterias en suspensión en PBS se dejaron formar biopelículas en las superficies de titanio en un sistema de celda de flujo de placas paralelas para las 2 y 24 horas. La actividad metabólica de las células se evaluó mediante la Bac
Kit Vitalidad CTC Luz. Para las células adheridas, DAPI se utilizó como contratinción. Las células fueron vistos con células evaluó contando manualmente al menos 1000 células CSLM y la proporción de metabólicamente activa (rojo /rosa). Las barras de escala representan 10 micras y los insertos muestran células en doble ampliación.
Los efectos de revestimiento de la saliva en la actividad metabólica de bacterias adherentes luego fueron investigados. Esto reveló que los niveles fueron significativamente mayores para las células asociadas con la superficie recubierta de saliva después de 2 horas y 24 horas en comparación con los de la suspensión original PBS (p & lt; 0,001) (Figura 3). La incubación de las bacterias con 25% saliva en suspensión no causó ningún cambio significativo en la actividad metabólica de más de 2 horas (4 ± 0,5%) o 24 horas (3 ± 0,6%) lo que sugiere que el efecto era específico de las proteínas salivales adheridas a una superficie. Estos datos muestran que por lo tanto adsorben proteínas salivales tienen la capacidad de provocar una respuesta metabólica que no se ve cuando las proteínas están presentes en solución. Figura 3 Imágenes que muestran la actividad metabólica de S. oralis adheridas a las superficies de titanio recubiertos de saliva. Las bacterias en suspensión en PBS se dejaron formar biopelículas sobre superficies de titanio recubiertos de saliva en un sistema de celda de flujo de placas paralelas para las 2 y 24 horas. La actividad metabólica de las células se evaluó mediante la Bac
Kit Vitalidad CTC Light con DAPI como contratinción. Las células fueron vistos con células evaluó contando manualmente al menos 1000 células CSLM y la proporción de metabólicamente activa (rojo /rosa). Las barras de escala representan 10 micras y los insertos muestran células en doble ampliación.
Debido a que no se espera que las células no viables en las superficies para mostrar la actividad metabólica, para investigar el nivel de actividad metabólica como una función del número de células viables , una relación se calculó para cada punto de tiempo (Tabla 1). Esto reveló que para las células en suspensión en PBS o la saliva, mientras que la viabilidad se mantuvo, no hubo cambios significativos en la actividad metabólica con el tiempo. La adherencia a una superficie no revestida causó la proporción de las células viables que eran metabólicamente activo que aumente a 50% después de 2 horas, mientras que la unión a una película saliva aumentó significativamente este nivel a 98% de las células viables (p & lt; 0,001). Así, mientras que el contacto inicial con una superficie causó un aumento en la actividad metabólica dentro de la población, esto se mejoró en gran medida por la presencia de una película salival. Después de 24 horas, la proporción de células metabólicamente activas en la superficie de titanio sin revestir había disminuido a 25%, mientras que en la superficie recubierta de saliva el nivel se mantuvo en 96%. Esto sugiere que, además de mejorar la respuesta inicial a la superficie de contacto, la presencia de proteínas salivales sostenido el aumento de la actividad metabólica durante 24 hours.Table 1 Proporción de bacterias viables en la población que muestra la actividad metabólica en diferentes condiciones
Medio ambiente
% células vivas con actividad metabólica
0 h
2 h 24 h
Las células suspendidas en PBS
6 ± 1,5
4 ± 0,5
2 ± 0,03
células adheridas a las superficies metálicas en PBS
Perfil - 50 ± 4,5
25 ± 2,6
células suspendidas en un 25% la saliva
Perfil - 4 ± 0,8
3 ± 0,6
células adheridas a las superficies recubiertas con 25% de saliva
Perfil - 98 ± 4,3
96 ± 6,3
Caracterización de revestimiento de saliva en las superficies de titanio
identificar los principales componentes de las proteínas de la saliva en la preparación libre de bacterias, el material se sometió a 2DE y las proteínas se visualizaron por tinción con azul brillante de Coomassie (Figura 4a). Esto puso de manifiesto la presencia de más de 100 puntos, de los cuales se escogió a la mayoría (70), y 68 de ellos pudieron ser identificados mediante LC-MS /MS (Tabla 2). Casi todas las proteínas presentes mostraron ser de origen salival, con la IgA secretora, zinc-α 2-glicoproteína, los miembros de la familia de la cistatina, α-amilasa y proteínas prolactina inducida (PIP) como la especie dominante en el preparación. Además, se identificaron la calicreína, la proteína de unión a ácido graso y de la proteína de von Ebner. Figura 4 2DE geles de toda la saliva y la película salival desorbido de superficies de titanio. Agrupado saliva humana completa (A) y unas películas salivales desorbidos de superficies de titanio utilizando detergente (B) se sometieron a enfoque isoeléctrico en las tiras de pH 4-7 IPG seguido por SDS-PAGE en 14% de geles. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie (A) o de plata (B). Spots de interés se seleccionaron de la gel Coomassie, identificaron utilizando LC-MS /MS y detectar identidades transferidos a la gel de plata. Una explicación de las etiquetas se da en la Tabla 2. Tabla 2
Las identidades de las proteínas de la saliva total o unas películas salivales desorbidos de superficies de titanio con detergente obtuvieron utilizando LC-MS /MS de manchas de geles 2DE.
Identidad Proteína
nombre localización
% de cobertura de secuencia
detectado en la superficie
amilasa
amy
45- 55
Sí
Calgranulina
cal
49
Sin
cistatina
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
proteína de unión de ácidos grasos
fab
51
Sí
Inmunoglobulina A
cadena J
IgA /J
37-63
Sí
cadena pesada
IgA /h
18- 36
Sí
cadena pesada de la región C
IgA /c
21
Sin
secretora component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Inmunoglobulina
cadena ligera (kappa) guía empresas Ig /κ
38-59
Sí
calicreína
Kal
10
Sin
prolactina-proteína inducible
pip
63-67 proteína de la glándula
Sí
Von Ebners 's (lipocalina) guía empresas VEB
27
Sin
Zinc-α-2 glicoproteína
ZnGP
23-45
Sin
Para identificar las proteínas presentes en el película salival formado en titanio, las superficies se incubaron durante la noche con la saliva y, después del lavado, las proteínas adheridas se desorbe con detergente y se someten a 2DE (Figura 4b). La tinción con plata de los geles reveladas en torno a 50 puntos de los cuales todos fueron vistos en el gel teñido con Coomassie saliva. La IgA secretora, las proteínas de cistatina, α-amilasa y PIP estaban presentes, pero zinc-α 2-glicoproteína estaba ausente lo que indica que esta proteína no se adhirió a la superficie de titanio. La intensidad relativa de los puntos de PIP de la película fue mayor que en la preparación original de saliva lo que sugiere que esta proteína podría ser enriquecido en la superficie de titanio.
Discusión
primeros colonizadores tales como S
. oralis
iniciar la formación de biofilm por interactuar directamente con la película salival que está presente en las superficies orales. En este estudio, hemos utilizado unas películas de saliva preparado por centrifugación en gradiente de densidad en condiciones no desnaturalizantes. La ventaja de esta técnica es que las bacterias salivales, que se sedimentan, se pueden separar de macromoléculas grandes que permiten la preparación de libre de bacterias, saliva "nativo" en el que incluso las grandes proteínas salivales están presentes. Hemos identificado previamente los dos mucinas grandes salivales (MUC5B y MUC7), así como gp340, lisozima, lactoferrina, α-amilasa, secretora de IgA y estaterina en esta preparación utilizando ELISA [21]. En este estudio, se realizó 2DE en combinación con LC-MS /MS para identificar las proteínas salivales de peso molecular inferior (Figura 4a). La IgA secretora fue la proteína más abundante tal como se revela por la presencia de varios fragmentos (componente secretor, la cadena pesada, de cadena κ y de cadena J). De acuerdo con el análisis de la saliva humana por parte de otros grupos que utilizan la proteómica enfoques [7, 22] también hemos sido capaces de identificar α-amilasa, proteínas de la familia de cistatina, zinc-α 2-glicoproteína y PIP. Ácido graso unión a proteínas, la calicreína y la proteína de la glándula von Ebners (lipocalina) estaban presentes en cantidades menores. En este estudio hemos aplicado la metodología para examinar las unas películas salivales formadas en titanio. Esto demostró que sIgA y α-amilasa eran las proteínas más abundantes en la película, además de los miembros de la familia de proteínas de cistatina y PIP (Figura 4b). Estudios anteriores utilizando SDS-PAGE combinada con el análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos contra las proteínas salivales, han demostrado que la α-amilasa, y sIgA Prps unen a titanio [10, 11]. Zinc-α 2-glicoproteína estaba ausente de la desorbato película lo que sugiere que esta proteína no se adhiere al titanio mientras que la mayor abundancia relativa de PIP en el desorbato que en la preparación saliva originales indica que la proteína se enriquece en la superficie. Las bacterias orales tales como S
. salivarius
, S
. parasanguinis
y S
. oralis
puede interactuar con PIP [23, 24], lo que sugiere que esta proteína podría desempeñar un papel importante en la modulación de la colonización bacteriana de las superficies orales. Para nuestro conocimiento, este es la primera vez que el PIP se ha identificado como una proteína abundante en unas películas en titanio. Una proteína de 20 kDa correspondiente a PIP [25] ha sido previamente demostrado que se unen a la hidroxiapatita, pero no fue enriquecida de la misma manera encontrado aquí [26]. Una limitación de este estudio, sin embargo es que es actualmente desconocido si los resultados son aplicables a otras superficies de titanio con diferentes topografías de superficie o modificaciones de la superficie.
En el modelo de célula de flujo, S
. oralis
adhiere bien a las superficies recubiertas de saliva después de 2 horas - en consonancia con otros estudios sobre colonizadores primarios tales como Streptococcus Anginosus
, Streptococcus gordonii y Streptococcus sanguinis
[10] y Actinomyces Naeslundii
[11]. Como grupo, los estreptococos orales se sabe que expresan adhesinas que tienen afinidad por una serie de proteínas presentes en la saliva [27]. En un estudio anterior, hemos identificado una proteína ligada al LPXTG 1060-amino-ácido que contiene expresada en cepas de S
. oralis
que se unió así a unas películas salivales y
in silico análisis de la S
. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
