abstracto de fondo sobre West Virginia tiene la peor salud oral en los Estados Unidos, pero las razones de esto no están claras . Este estudio piloto exploró la etiología de esta disparidad mediante análisis independientes de cultivos para identificar las especies bacterianas asociadas con la enfermedad oral.
Métodos
Las bacterias en muestras de placa subgingival de doce participantes en dos estudios independientes dentales relacionados Virginia Occidental se caracterizaron utilizando la secuencia 16S rRNA genes y el análisis humano Oral Microbio identificación de microarrays (HOMIM). Se utilizó el análisis UniFrac para caracterizar las diferencias filogenéticas entre las comunidades bacterianas obtenidas a partir de la placa de participantes con enfermedad oral de baja o alta, que se evaluó mediante la agrupación y análisis de coordenadas principales.
: Resultados de la Estadísticamente diferentes firmas bacterianas (P
& lt; 0,001) fueron identificados en la placa subgingival de los individuos con enfermedad oral de baja o alta en Virginia Occidental basado en la secuenciación del gen 16S rRNA. enfermedad de bajo contenía una alta frecuencia de veillonellas
y Streptococcus
, con un número moderado de Capnocytophaga
. Alta enfermedad exhibió aumentó considerablemente la diversidad bacteriana e incluyó una gran proporción de bacterias en racimo Clostridiales (Selenomonas
, Eubacterium, Dialister
). árboles filogenéticos construidos mediante secuenciación del gen 16S rRNA revelaron que Clostridiales Se repitieron los colonizadores de la placa asociada con la enfermedad oral alta, proporcionando evidencia de que el medio oral es de alguna manera influye en la firma bacteriana relacionada con la enfermedad.
Conclusiones
análisis independiente del cultivo identificados una firma bacteriana atípica asociada con una alta enfermedad oral en West Virginia y proporcionó evidencia de que el ambiente oral influenciado esta firma. Ambos hallazgos proporcionan información sobre la etiología de la disparidad oral en Virginia Occidental
material complementario Electrónico
La versión en línea de este artículo. (Doi:. 10 1186 /1472-6831-11-7) contiene material complementario , que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes sobre West Virginia tienen la peor salud bucal en la nación, con casi el doble de la media nacional (48,2%) de los adultos de 65 años o más después de haber extraído todos los dientes naturales [1 ]. Estas estadísticas se vuelven más alarmante saber que las infecciones de la cavidad oral se han asociado con enfermedades crónicas, como diabetes, enfermedad cardiovascular y la aterosclerosis [2-4]. Ni el origen de la mala salud oral en Virginia Occidental ni su relación con la enfermedad sistémica se entiende. Central a este problema es una determinación de las poblaciones microbianas responsables de las infecciones orales. Históricamente esto ha sido difícil debido a la complejidad del microbioma dentro de biofilms orales, y dificultades en el cultivo de bacterias obtenidas a partir del medio ambiente oral.
Biofilms pueden jugar ya sea una función protectora (probiótico) o patógena en la salud oral, dependiendo de su composición microbiana . biofilms orales se iniciaron por la colonización de cocos grampositivos probiótico, principalmente estreptococos, la adhesión a la superficie del diente, junto con coaggregating Actinomyces
y Veillonella
[5]. Coaggregation es una característica común en el desarrollo de placa y bacterias colonizadoras tempranas se puentean a través de bacterias, como fusobacterias, a finales de los colonizadores. La sucesión ecológica de las poblaciones microbianas de la colonización temprana cocos Gram-positivos a finales colonizadoras anaerobios Gram-negativos de diversos morfotipos conduce a un cambio en la composición del biofilm que se correlaciona con la aparición de la gingivitis y la periodontitis [6]. organismos específicos de que se han relacionado con enfermedades orales. La caries dental se produce como resultado de un cambio en la comunidad de biopelículas hacia acidogenic bacteria ácido-tolerantes y, específicamente Streptococcus mutans y lactobacilos
[7]. En la placa subgingival, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia Opiniones y Actinobacillus Aggregatibacter
han sido fuertemente asociada con la enfermedad periodontal [8, 9]. Hasta hace poco, las asociaciones de microbios con las enfermedades orales se han basado en el cultivo in vitro. Ya que ahora se reconoce que sólo el 60% de las especies en las biopelículas son orales [10], el uso de los análisis independientes de cultivos ha llevado a un nuevo nivel de comprensión de los microbios asociados orales [11]. Los análisis moleculares
cultivables de la microflora periodontal no habían sido previamente utilizado para examinar el perfil de bacterias de la placa subgingival de West Virginia. El objetivo de este estudio fue utilizar 16S rRNA gen análisis para comprender mejor la etiología de la disparidad de la salud oral observado en esta población. En este estudio preliminar hemos sido capaces de identificar significativamente diferentes 16S rRNA firmas filogenética de bacterias en la placa de las personas que tienen la enfermedad oral alta o baja, y la firma de alta enfermedad fue evidente en dos poblaciones independientes que abarcan una amplia gama de grupos de edad. En general, se encontró que las comunidades ricas en veillonellas
y estreptococos desplazan a las comunidades ricas en Selenomonas
y otros Clostridiales en asociación con una disminución en la salud oral, lo que podría vincular una firma bacteriana atípica con la enfermedad oral en West Virginia. El hallazgo de que una firma bacteriana atípica puede estar vinculado a las disparidades de salud oral observados en Virginia Occidental pone de manifiesto la necesidad de profundizar el análisis de las especies bacterianas asociadas con la enfermedad oral alta y baja en esta población con el fin de comprender el origen de esta disparidad.
métodos
poblaciones sometidas
muestras de placa subgingival utilizados en este estudio se obtuvieron en conjunto con dos proyectos de investigación llevados a cabo en West Virginia. La placa se obtuvo a partir de una población de 23 años de edad al 48 a través del Centro para la Investigación de la Salud Oral en los Apalaches (estudio COHRA), una asociación entre la West Virginia University y University of Pittsburgh examen genético, epidemiológico, microbiológico, y factores de comportamiento que contribuyen a la salud bucal. La placa se obtuvo a partir de una población de más edad a través de las disparidades en la salud bucal entre ancianos con y sin deterioro cognitivo (Cognitive estudio), realizado en colaboración con la Escuela Universitaria de Odontología Virginia Occidental y el Centro de Envejecimiento. Se optó por incluir temas de dos piscinas independientes West Virginia población (mediana de 23-48 años de edad o de edad & gt; 70) en nuestro estudio para ayudar a extender la comprensión de la relevancia de nuestros hallazgos a una amplia muestra de la población de Virginia Occidental. Siendo financiado como proyecto piloto, son relativamente pocos los sujetos de cada grupo fueron capaces de ser analizados. Todos los procedimientos se realizaron con la Junta de Revisión Institucional aprobado protocolos.
Evaluaciones Asunto
Criterios para la evaluación de la salud oral, métodos de recolección de la placa de los participantes, y la calibración de los investigadores en el proyecto COHRA se han descrito anteriormente [12]. Nuestro estudio examinó la placa subgingival de siete participantes COHRA, que se obtuvo a partir de cuatro primeros molares (# 3, 14, 19 y 30). Estos mismos sitios fueron evaluados para la profundidad de sondaje (PD), la recesión y el sangrado al sondaje (BOP), que se resumen en la Tabla 1. Evaluación de caries se basó en las superficies de los dientes de la corona, y los dientes fueron clasificados como de sonido, cariados, obturados o desaparecidos. Porcentaje de los dientes de sonido para cada participante se presentan en la Tabla 1. El estado oral de los sujetos de estudio COHRA se determinó sobre la base de exámenes periodontales (bordeado por líneas de trazos en la Tabla 1): baja la enfermedad se define como & lt; 3,5 mm PD, 0-25% BOP sitios; alta de la enfermedad se define como & gt; 4,5 mm PD, 100% sitios de balanza de pagos. placa subgingival se tomaron muestras con una cureta, suspendido en 100 a 500 l TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) que contiene 20% de glicerol y se almacenaron a -70 ° C hasta su procesamiento. Múltiples muestras de participantes individuales se agruparon para las evaluaciones clínicas del estudio analyses.Table 1 COHRA
código del paciente
DB
DC
DF
DL
DG
DI DA
Edad
30 y
23 y 32 años
32 y 48 años
40 y 35
y
Sex
F
F
M
F
M
M
F
Race
White
Afr/Am
White
White
Mixed
White
White
Smoker
No
No
Sometimes
No
Yes
Yes
Sometimes
Periodontal 1
|
|
|
|
|
|
(medido en 4 sitios: 3,14,19,30) guía empresas |
|
|
|
|
|
|
profundidad de sondaje (media mm /sitio)
& lt; 3.5
& lt; 3.5
4,5
4,5
5.2
5.2
5.2
recesión (% positive/site)
0
0
0
25
0
75
100
Bleeding al sondaje (% de sites)
25
0
100
100
100
100
100
Gingivitis - localized
0
0
0
0
0
0
0
generalized
0
Yes
Yes
0
0
0
0
hyperplasia
0
0
0
Yes
Yes
Yes
Yes
Caries
|
|
|
|
|
|
| <
br> dentaduras (inferior /superior) guía empresas 0 0
0 0
0 0
0
sonido dientes (28% de los dientes) guía empresas 64,3 78,6
92,9
53,6 78,6
67,9
50
1 las líneas discontinuas frontera parámetros clínicos utilizados para determinar el estado oral de los participantes del estudio COHRA.
participantes en el estudio fueron seleccionados cognitivos basan en: 1) la edad de 70 años en adelante 2) residente de Virginia Occidental, 3) comunidad-sala de estar, y 4) dentado (que tiene por lo menos cuatro dientes naturales),. Las evaluaciones orales se llevaron a cabo por investigadores calibrado usando guías y protocolos de la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición (NHANES IV) [13]. Las muestras de placa subgingival fueron obtenidos mediante curetas periodontales estériles de seis sitios de la siguiente manera: la cara vestibular del molar más anterior en cada cuadrante, y la superficie bucal de # 11 y # 31. Las muestras de placa se almacenaron y se agruparon para el análisis que el anterior. Criterios para la evaluación periodontal en el estudio cognitivo incluyen PD, la gingivitis y sarro. Evaluación de caries incluido tipo de prótesis dentales y sonido por ciento, perdidos y obturados, los dientes cariados o coronadas. Ambas evaluaciones se presentan en la Tabla 2. Se determinó el estado oral de los sujetos de estudio cognitivo basado en exámenes de caries (bordeado por líneas de puntos en la Tabla 2): baja enfermedades definidas como & gt; 60% de sonido /dientes obturados presente; alta de la enfermedad se define como & gt; 40% dientes perdidos o decayed.Table 2 evaluaciones clínicas del estudio cognitivo
Paciente code
DT
DQ
DV
DAA
DZ
Age
74
93
77
91 y
77 y
Sex
F
F
M
F
F
Race
Afr/Am
White
White
White
White
Smoker
No
No
No
Yes
No
Periodontal
|
|
|
|
| gratis (Número de dientes sondeó)
22
26
22
nd1
10
profundidad de sondaje (media
|
|
|
|
|
mm /sitio)
3,01 ± 0,53
1,98 ± 0,71 2,45 ±
0,55
ND | 1,66 ± 0,41
Gingivitis (% sitios positivos)
68,2
4,5
9.1
ND | 80
Cálculo (% sitios positivos)
0 0
4,5
ND | 30
caries
|
|
|
|
|
dentaduras (inferior)
0
parcial
0 0
0
dentaduras (superior)
0 0
parcial
parcial
completa
índice de dientes (32% de los dientes) guía empresas |
|
|
|
|
Sound
59.4
31.3
40.6
37.2
21.9
Missing
31.3
15.6
31.3
40.6
65.6
Filled
6.25
40.6
18.8
15.6
9.4
Decayed
3.1
0
0
6.3
3.1
Crown
0
12.5
9.4
0
0
1No datos examen periodontal fue adquirida para DAA.
Líneas 2Dashed frontera parámetros clínicos utilizados para determinar el estado oral de los participantes del estudio cognitivo.
Extracción de ADN y análisis de secuencia del gen 16S rRNA
ADN se extrajo y purificó a partir de la placa subgingival utilizando el kit de aislamiento de ADN del suelo UltraClean (MO Bio Labs, Carlsbad, CA). El gen 16S rRNA se amplificó por PCR utilizando los cebadores 16S rRNA (universales adelante, 5'-GAGTTTGATYMTGGCTCAG, revés, 5'-GAAGGAGGTGWTCCADCC [14]). Cada reacción de PCR contenía 1 l de ADN purificado, 0,4 M universales adelante y atrás primers, tampón de PCR 5 l 10 veces platino, MgSO 1,5 mM 4, dNTPs 0,2 mM y 0,5 l Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen, Life Technologies Corp , Carlsbad, CA). Las condiciones de PCR fueron: 94 ° C durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 45 segundos, 60 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, con una extensión final a 72 ° C durante 15 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y las reacciones que dan productos de ~ 1500 pb se clonaron usando el kit de clonación TOPO TA para la secuenciación (Invitrogen). Los productos de ligación se sometieron a electroporación en Escherichia coli TOP10 (
células químicamente competentes, Invitrogen), y los transformantes se incubaron en 250 l medio SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 10 mM < sub> 2, MgSO 10 mM 4, glucosa 20 mM) durante 1 hora a 37 ° C, antes de la siembra en agar LB que contiene 50 mg /ml de kanamicina y una superposición de 25 l de 2% X-gal. Después de la incubación durante la noche, ~ 100 colonias que contienen insertos (colonias blancas) se aislaron de cada muestra y se cultivó a 37 ° C durante la noche en placas de 96 pocillos que contenían caldo LB con 50 mg /ml de kanamicina. Un volumen de 2 l de cultivo bacteriano de cada pocillo se amplificó por PCR usando los cebadores M13 (adelante, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT, revertir 5'-CAGGAAACAGCTATGAC). Las reacciones contenían 0,2 M de cada cebador, 5 l de tampón 10X PCR Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), dNTPs 0,2 mM y 0,2 l de ADN polimerasa Taq (Qiagen). Las condiciones de PCR fueron: 94 ° C durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 45 segundos, 52 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, con una extensión final a 72 ° C durante 15 minutos. Los productos PCR de cada pocillo se examinaron por electroforesis, y los productos del tamaño apropiado se secuenciaron mediante una instalación comercial (SeqWright, Houston, TX).
análisis de la secuencia del gen 16S rRNA
cada secuencia de ADN se analizan en busca de un solo segmento de la secuencia del cebador original (ATCAAACT) entre pb 440 y 520 para identificar el gen 16S rRNA y para ayudar a excluir quimeras. Se retiró la parte inicial de cada secuencia que contiene bases no exigido (N), la parte distal (secuencia de vector) se recortó en el cebador, y la secuencia se invirtió a la orientación estándar. Las secuencias de nucleótidos generados en este estudio han sido depositados en GenBank, números de acceso HQ894465 -. HQ895588
Las secuencias se clasifican por análisis BLASTN tanto contra una base de datos local y la base de datos GenBank no redundante (nr). La base de datos local fue montado en un proceso interative: si una nueva secuencia experimental no coincide con & gt; 98% de identidad, una nueva base de datos se ensambló añadiendo secuencias de tipo juego obtenidos de GenBank y el Proyecto de base de datos ribosomal (RDP) [15]. La base de datos local actual contiene 375 secuencias organizadas en 122 grupos ''. Cada grupo contiene secuencias estrechamente relacionadas y se ha validado para ser no superposición por análisis BLAST de los grupos individuales contra la base de datos. Este enfoque proporciona un nivel de detalle que era informativo para la clasificación de secuencias bacterianas. Software utilizado en secuencia de análisis incluyeron: 1) BLAST, utilizando el servidor NCBI [16] con los resultados con formato de XML; 2) UniFrac, mediante su servidor [17, 18]; 3) la construcción del árbol filogenético, usando el servidor RDP; 4) BLAST local, utilizando el "legado" blastall ejecutable a partir de NCBI [19]. Otro software se ejecutan localmente incluye: R [20] y el análisis de Filogenia y Evolución (APE) paquete para la construcción y el trazado de los árboles filogenéticos y el trazado del análisis de coordenadas principales (PCoA); ClustalW2 [21] y el músculo [22] para la alineación de secuencias múltiples; y Python [23] para automatizar los pasos de análisis y producir los mapas de calor (generada usando matplotlib).
Humano Oral Microbio identificación de microarrays (HOMIM) Análisis
Para el análisis HOMIM 16S rRNA gen de microarrays, el ADN purificado a partir de muestras de placa subgingival se enviado al Fondo para el HOMIM Core en el Instituto Forsyth (Boston, MA). Este servicio ofrece análisis de alto rendimiento de ~ 300 de las especies de bacterias orales más prevalentes y proporciona un informe exhaustivo de los perfiles de bacterias dentro de las muestras de ADN [24].
Resultados y Discusión
identificación de las poblaciones de bacterias en la placa subgingival que diferencian a los individuos con la enfermedad de alta o baja oral en West Virginia
estudios previos encontraron especies bacterianas en el "complejo rojo 'estar fuertemente relacionado con la enfermedad periodontal [25]. Para examinar si estas mismas bacterias se asocian con la enfermedad oral en Virginia Occidental, se utilizó la secuenciación del gen 16S rRNA para caracterizar bacterias de la placa subgingival de participantes COHRA con diagnóstico de enfermedad oral de baja o alta en base a exámenes periodontales (Tabla 1, bordeada por líneas discontinuas ). Los análisis se realizaron en formato de placa de 96 pocillos, y debido al costo relativamente alto de la secuenciación del ADN, nuestro objetivo era práctico para secuenciar 96 clones por muestra, dando cuenta de que no sería capaz de detectar los tipos de bacterias presentes en baja frecuencia. En la actualidad el número de clones secuenciados por muestra oscilaba entre un 55 133, con números bajos relativos a las dificultades para obtener secuencias de alta calidad para algunas muestras. Las secuencias obtenidas fueron analizadas por BLAST contra la base de datos GenBank, que incluye todos los conocidos 16S rRNA secuencias de genes, y en contra de una base de datos local que facilitó la clasificación de los "tipos" de bacterias basados en ≥95% de identidad de secuencia. La evaluación posterior de los datos de la secuencia utilizando la base de datos del microbioma oral humana (HOMD) servidor de BLAST [26] dio resultados casi idénticos, a excepción de algunos cambios causados por la reclasificación de cepas de tipo Clostridiales, que afectaron a algunas asignaciones a Eubacterium Opiniones y Lachnospiraceae.
La fase inicial de secuenciación examinó 2 baja (DB y DC) y 5 de enfermedades de alto (DF, DL, DG, DI, DA) COHRA participantes. Una muestra adicional bajo la enfermedad (DM), evaluada sobre la base de criterios periodontales, se obtuvo a través de la Clínica Dental de la Universidad de Virginia Occidental y sirvió como control bajo las enfermedades no COHRA. El porcentaje de un tipo de bacterias en cada muestra en relación con el número total de clones secuenciados (indicados en la parte inferior de cada columna) se muestra en el mapa de calor en la Figura 1. Como se informó anteriormente [6], el aumento de la diversidad bacteriana era evidente en la placa de los individuos diagnosticados con la enfermedad oral alta. Sin embargo, inesperadamente un gran número de enfermedades de alto tipos de bacterias se clasificaron en el grupo de Clostridiales (Selenomonas
, Eubacterium
, Dialister
), que eran completamente ausentes de la placa bajo la enfermedad. También es notable en alta enfermedad fue la baja frecuencia de los tipos bacterianos tradicionalmente vinculadas a la periodontitis (Porphyromonas
, Tannerella
, Treponema
y Aggregatibacter
). Placa de la enfermedad de bajo exhibió una población bacteriana claramente diferentes, incluyendo principalmente Streptococcus Opiniones y veillonellas
con un número moderado de Capnocytophaga
. La diversidad de bacterias en muestras de enfermedades de baja COHRA era altamente consistente con un estudio reciente, que identificó Streptococcus
, veillonellas Opiniones y Capnocytophaga
en el 100% de las muestras de placa obtenidas de individuos sanos con cavidades orales [27]. Por lo tanto, mientras que las bacterias asociadas con la salud oral en West Virginia fue altamente reflectante de otras regiones en los Estados Unidos, una firma filogenético patógenos atípicos que incluye Selenomonas
y otras bacterias racimo Clostridiales parece estar asociado con el deterioro de la salud oral en West Virginia. Figura 1 Identificación de las poblaciones de bacterias en la placa subgingival de West Virginia. composición bacteriana en muestras de placa se determinó mediante la secuenciación del 16S rRNA gen en 2 baja y 5 participantes COHRA enfermedades orales altas clasificados basa en los exámenes periodontales, y 5 participantes en el estudio cognitivos, clasificado en función del índice de caries. DM es una muestra de control de la enfermedad periodontal baja obtenida a través de la Clínica Dental de la Universidad de Virginia Occidental. Cada caja de numeración indica el porcentaje de clones de la específica de tipo bacteriana 16S rRNA genes en relación con el número total de clones secuenciados, que se indica en la parte inferior de cada columna. El color de la caja refleja recuentos observados.
Participantes en el estudio COHRA tenían edades comprendidas entre 23 de a 48, y los participantes del estudio cognitivos (edades 73 a 93) proporcionan un medio para evaluar cómo los tipos bacteriana relacionada con el estado de los dientes más adelante en la vida. La salud periodontal de los 5 participantes en el estudio cognitivos incluidos en este estudio fue excepcionalmente buena, como es evidente en las profundidades de sondaje de 3 mm o menos, que se muestran en la Tabla 2. Sin embargo, como se esperaba para esta edad, se observó una variación considerable en la salud de caries (Tabla 2, bordeado por líneas de puntos), con DT que tiene el mayor porcentaje de dientes sanos, y DAA y DZ que tiene el mayor porcentaje de los dientes que faltan /cariados. El examen de los tipos de bacterias en la placa subgingival de DT reveló principalmente veillonellas
, Streptococcus Opiniones y Capnocytophaga gratis (Figura 1), como se observa para los participantes COHRA baja de enfermedad. En comparación, la DAA y DZ tenían patrones bacterianos que incluían el aumento de la diversidad y la riqueza de especies de Selenomonas
, Eubacterium Opiniones y Dialister
, además de muchas de las otras especies bacterianas observadas en los participantes COHRA enfermedades orales altas. analiza estos datos son consistentes con la firma bacteriana de edad de Virginia Occidental con la pérdida de dientes es similar a la de jóvenes de Virginia Occidental con enfermedad periodontal.
estadístico de tipos bacterianos identificados en la placa subgingival
análisis UniFrac [17], que toma en cuenta las distancias filogenéticas, se ha convertido en el método de elección para el análisis de las diferencias entre las comunidades microbianas y fue utilizado en nuestros estudios para proporcionar validación estadística de las diferencias en los entornos de la placa de bajo y alto de la enfermedad. El método requiere un árbol filogenético arraigado como entrada, y que utiliza el servidor de RDP para generar el árbol, que es especialmente adecuado para alineaciones de ARNr ya que emplea Infernal [28] que se guía por la estructura secundaria predicha. El árbol fue construido por el método de vecino a participar en [29], el uso de APE en R. Se arraiga incluyendo Thermotoga maritima
SL7 como afuera. El algoritmo UniFrac se utilizó para calcular la fracción única de longitud de la rama para cada muestra. Estos resultados (que son las distancias filogenéticas que separan las muestras individuales) se analizaron mediante análisis de conglomerados (UPGMA) y PCoA y secuencias duplicadas ignorados. Como se muestra en la Figura 2A, PCoA separó enfermedad de bajo a partir de muestras enfermas en dos grupos a lo largo de la primera vector propio. El análisis de conglomerados también se dividió bajo la enfermedad y las muestras enfermas en diferentes clados, con el DT de la muestra (con la etiqueta T en la Figura 2), la muestra enferma menos basado en el resultado de caries en el estudio cognitivo, fraccionamiento al clado baja enfermedad. Soporte para los grupos se evaluó mediante pruebas jackknife (1000 repeticiones; Figura 2B). Cuando los análisis se realizaron de nuevo con todas las secuencias relabeled como enferma o sana, el análisis UniFrac encontraron los dos entornos que sean estadísticamente diferentes (P Hotel & lt; 0,001), ya sea o no duplicados se consideran secuencias. Figura 2 Los análisis estadísticos de las poblaciones bacterianas en la placa baja y alta de la enfermedad. A) Coordinar la directora análisis de las comunidades bacterianas de la placa subgingival de West Virginia con una baja enfermedad oral (azul) en comparación con la placa de West Virginia con distintos grados de enfermedad oral (rojo). B) El algoritmo UniFrac se utilizó para calcular la longitud de la rama única para una sub-muestra dada. El análisis de división Cluster baja (azul) y las muestras enfermas (rojo) en diferentes clados. El apoyo a los grupos se evaluó mediante pruebas navaja de bolsillo (1000 repeticiones). T era la muestra menos enferma en el estudio cognitivo, según la clasificación en la Tabla 2. La "D" ha sido retirado de las notaciones de la muestra en estas figuras para mayor claridad.
Análisis de las poblaciones de bacterias en la placa mediante análisis de HOMIM
Desde rRNA gen secuenciación reveló una firma bacteriana inesperada en la placa de West Virginia con enfermedad oral alta, nos preguntamos si este patrón se pudo detectar el uso de un método alternativo de análisis del gen 16S rRNA, HOMIM. En HOMIM, múltiples cebadores se usan para amplificar inicialmente 16S rRNA genes dentro de una muestra de ADN, que luego se sometieron a ensayo para la presencia de 16S rRNA genes específicos utilizando sondas diseñadas para optimizar la detección de 272 especies diferentes de bacterias [30]. A diferencia de la secuenciación de ARNr 16S, que permite la cuantificación de la frecuencia de clones bacterianos, La lectura para HOMIM es una intensidad relativa de la señal para cada secuencia 16S rRNA detectado en una escala de 0 a 5. En nuestros estudios HOMIM resultados se presentan como la suma de las señales de todos los grupos taxonómicos oral dentro de cada género. Las comparaciones de secuencia de ADN HOMIM y análisis de muestras de placa de 4 bajo la enfermedad (DB, DC, DM, DT) y los 5 más alta de la enfermedad (DA, DI, DG, DZ, DAA) participantes en nuestro estudio se muestran en la Figura 3. HOMIM los análisis de la placa de la enfermedad de bajo detectó una alta frecuencia de veillonellas
, Streptococcus Opiniones y Capnocytophaga
, en paralelo estrechamente resultados de la secuenciación del 16S rRNA (Figura 3A). tipos de bacterias menos prevalentes detectadas en la secuenciación del 16S rRNA, como Gemella
, Fusobacterium
, Actinomyces
, Granulicatella
, Neisseria y Haemophilus
, fueron confirmados por HOMIM. tipos bacterianos adicionales, presumiblemente a una frecuencia demasiado baja para detectar mediante secuenciación, se detectaron también en la enfermedad de baja por HOMIM, el más evidente de los cuales fueron Campylobacter
, Prevotella
, Leptotrichia
, Lautropia Opiniones y Aggregatibacter
. Estos resultados ponen de manifiesto las diferencias que se pueden observar entre secuenciación de ADN y HOMIM debido a metodologías empleadas en HOMIM que puede aumentar la sensibilidad de la detección de especies bacterianas específicas por 10 veces. Figura 3 Comparación del gen 16S rRNA análisis utilizando la secuenciación y HOMIM. La frecuencia de los tipos de bacterias (en porcentaje), determinada por la secuenciación del ARNr 16S, de 4 muestras de placa de la enfermedad de bajo y 5 muestras de placa de alta enfermedad de West Virginia, clasifican en base a criterios definidos en Materiales y Métodos, se compara con la intensidad de la señal de microarrays obtenido a partir de las mismas muestras en HOMIM análisis. tipos de bacterias por encima de la línea roja fueron más frecuentes en la enfermedad baja. Hoteles en la placa de los individuos con enfermedad de alto, HOMIM análisis confirmaron la presencia de los géneros del orden Clostridiales, incluyendo Selenomonas
, Eubacterium Opiniones y Dialister
(Figura 3B). Cabe destacar que, al igual que con los datos de secuenciación, las bacterias en el "complejo rojo 'o estaban ausentes o presentes en niveles bajos en los análisis HOMIM. Al igual que con la enfermedad bajo la placa, las señales desproporcionadamente más altos de ciertas bacterias, específicamente Campylobacter
, Prevotella Opiniones y Leptotrichia
, fueron observados en el análisis HOMIM en comparación con la secuenciación, otra vez explica por el aumento de la sensibilidad de las metodologías de detección de microarrays. Es importante destacar que las conclusiones de HOMIM análisis confirmaron los de secuenciación de ARNr 16S, e identificaron una mayor riqueza de género y las señales de alta intensidad para Selenomonas
, Eubacterium Opiniones y Dialister Hoteles en asociación con un deterioro de la salud oral.
Origen de tipos de bacteria en la placa de alta enfermedad
árboles filogenéticos de los tipos de bacterias desarrolladas utilizando la secuenciación del 16S rRNA también proporcionado información sobre el origen de las firmas bacterianas asociadas con la enfermedad oral alta. Por ejemplo, las comparaciones de secuencias de genes 16S rRNA revelaron que diversos Selenomonas
spp. eran en realidad repetida colonizadores del medio bucal alta enfermedad. El árbol de 16S rRNA representado en la Figura 4 muestra la amplia diversidad de Selenomonas
filotipos recuperados en una sola muestra de placa de un sujeto alta enfermedad (DA). Por el contrario, el mismo clado en una muestra de un sujeto bajo la enfermedad (DB) sólo contenía una baja diversidad de veillonellas
filotipos. El orden Clostridiales tiene su asignación filogenético en los Firmicutes (típicamente Gram-positivas), pero incluye una familia grande, el Veillonellaceae, que son anaerobios obligados que manchan Gram-negativo debido a una membrana porosa pseudo-exterior. Bajo la enfermedad veillonellas
tienen secuencias casi idénticas típicos de una sola especie (& gt; 97% de identidad de secuencia 16S rRNA gen), tal como se representa en la figura 4. En nuestros estudios, hemos encontrado el apretado grupo de veillonellas
observa en baja la enfermedad fue reemplazado en la placa de alta enfermedad por una amplia expansión de otros miembros de la familia, tales como Veillonellaceae Selenomonas Opiniones y Dialister
. Al mismo tiempo en la escuela de la enfermedad se produjo una expansión de los microorganismos gram-positivos del orden Clostridiales, sobre todo en las familias y Eubacteriaceae Lachnospiraceae. La amplitud de este grupo de bacterias es grande (mínimo ~ 85% de identidad), y esto nos permitió reconocer que Clostridiales se repitieron colonizadores en la placa de individuos que tienen la enfermedad oral alta, como se representa por la diversidad filogenética de Selenomonas
en la Figura 4 . Este hallazgo es importante porque pone de relieve el papel de la cavidad oral (a diferencia de en la evolución in situ debido a la transferencia horizontal de genes) en la generación de firmas bacterianas asociadas con la enfermedad oral alta en Virginia Occidental. Figura 4 árboles filogenéticos de Selenomonas y Veillonella aisladas de muestras de placa individuales. secuencias del gen 16S rRNA de una sola muestra de morbilidad elevada placa (DA, texto rojo) y una sola muestra bajo la placa de la enfermedad (DB, texto azul) se utilizaron para generar árboles filogenéticos de Selenomonas Opiniones y veillonellas
, respectivamente. El eje x indica la diferencia porcentual en la secuencia del gen 16S rRNA. Los grupos separados de Selenomonas
muestran que esta población descendiente de la colonización de bacterias filogenéticamente independiente, pero relacionado. Veillonellas En venta DB exhibe la diversidad limitada.
Conclusiones México La etiología de la mala salud oral que conduce a las estadísticas de pérdida de dientes alta en Virginia Occidental es desconocida. El objetivo de este estudio fue comprender mejor este problema utilizando 16S rRNA gen análisis para caracterizar las especies de bacterias en la placa subgingival de West Virginia que tiene la enfermedad oral alta. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
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