Resumen Antecedentes
Francia El tejido blando alrededor de los implantes dentales forma una barrera entre el medio bucal y el hueso alrededor del implante y una factor crucial para el éxito a largo plazo de la terapia es el desarrollo de un buen sello pilar /tejido blando. Sol-gel nanoporoso derivado TiO
2 revestimientos se han mostrado para mejorar de fijación de los tejidos blandos, pero su efecto sobre la adhesión y la formación de biopelículas por las bacterias orales es desconocida.
Métodos
hemos investigado cómo las propiedades de las superficies que puede ser utilizado en pilares: convertido titanio, nanoporoso sol-gel de TiO 2 superficies recubiertas y anodizado Ca 2 + superficies modificadas, afectar a la formación de biopelículas por dos primeros colonizadores de la cavidad oral: Streptococcus sanguinis
y Actinomyces naeslundii
. Las bacterias se detectaron utilizando 16S ARNr de fluorescencia de hibridación in situ
junto con microscopía confocal de barrido láser.
Resultados
Interferometría y microscopía de fuerza atómica revelaron todas las superficies a ser suave (S a ≤ 0,22 micras) . La incubación con un consorcio de S. sanguinis
y A. Naeslundii
no mostró diferencias en la adhesión entre las superficies de más de 2 horas. Después de 14 horas, el nivel de crecimiento de biopelícula era baja y otra vez, no se observaron diferencias entre las superficies. La presencia de la saliva aumento de la biovolumen biofilm de S. sanguinis
y A. Naeslundii
de diez veces en comparación con la saliva cuando estaba ausente y esto se debió al aumento de la adhesión en lugar de la formación de biopelículas.
Conclusiones
modificación Nano-topográfica de superficies de titanio lisas no tuvo ningún efecto sobre la adhesión o formación de biopelículas temprana por S. sanguinis
y A. naeslundii
en comparación con superficies torneadas o los tratados con la oxidación anódica en presencia de Ca 2+. La presencia de saliva llevó a una significativamente mayor biovolumen biofilm pero no se observaron diferencias significativas entre las superficies de prueba. Por tanto, estos datos sugieren que la modificación con sol-gel nanoporoso derivado TiO 2, que se ha demostrado que mejora la osteointegración y la curación de los tejidos blandos en vivo
, no causa una mayor formación de biopelículas por las dos especies comensales orales ensayadas de . las otras superficies
material complementario Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-11-8) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
. antecedentes
los implantes de titanio se utilizan comúnmente para reemplazar los dientes perdidos y mucho trabajo se ha centrado en la optimización de las propiedades mecánicas de los materiales de implante físico-químicas y mejorar su integración con el hueso huésped y tejidos blandos. La barrera de tejido blando alrededor de los implantes dentales sirve como un sello protector entre el medio bucal y el hueso de los subyacentes peri-implante y un factor propuso ser de importancia para el éxito terapéutico a largo plazo del tratamiento con implantes es el desarrollo de un buen pilar /suave sello -tissue [1]. Diversas modificaciones de la superficie de los implantes, incluyendo alteraciones micro-topográfica y de la superficie química, han sido investigados por sus efectos sobre la curación de los tejidos y, recientemente, el interés se ha recurrido a modificaciones en el nivel de nanómetros de resolución [2]. superficies Nanofeatured son considerados como aquellos con estructuras más pequeñas que 100 nm en al menos una dimensión, y nanofeatures se han caracterizado en al menos cuatro implantes disponibles comercialmente [3]. Sol-gel nanoporoso derivado TiO 2 revestimientos se han mostrado para mejorar de fijación de los tejidos blandos en modelos de ratas y perros [4-6] y un estudio experimental en humanos indicaron que una proporción significativamente mayor de la mucosa oral estaba en contacto con una nanoporoso TiO 2 de superficie que con un superficies no modificadas [7].
superficies de la cavidad oral están cubiertas rápidamente con una película de proteínas y glicoproteínas derivado de la saliva y de fluido crevicular gingival, así como productos microbianos secretadas [8] . La composición, así como la configuración y la densidad de las proteínas de la película, depende en gran medida de la naturaleza física y química de la superficie subyacente y por lo tanto las propiedades de la adhesión bacteriana influencia superficie cuando la película. Numerosos microorganismos en la fase planctónica serán transportados a la superficie pero son las propiedades de la película acondicionado junto con las propiedades de adherencia de las bacterias que determinan qué organismos se unen e inician la formación de biopelículas. La formación de biopelículas en las superficies dentales se inicia por la adhesión de colonizadores tempranos, tales como S. sanguinis
y A. naeslundii
[9]. Los colonizadores iniciales promueven la adhesión de colonizadores secundarios por interacciones co-agregación y microbianos que conducen a la maduración de la biopelícula [10]. La microbiota de los implantes sanos se piensa que es similar a la observada en las superficies dentales [11, 12] y Streptococcus spp
. y Actinomyces Naeslundii
han sido identificados como los primeros colonizadores en una variedad de superficies de materiales de implante in vivo
[13]. Como es el caso de la placa dental, la capacidad para el crecimiento y el metabolismo son los determinantes ecológicos de la supervivencia y la persistencia de las bacterias orales sobre superficies de implantes dentales. La multiplicación y el metabolismo de adherirse microorganismos en última instancia se traduce en el desarrollo de una comunidad microbiana estructuralmente organizado que está en un estado de equilibrio con la acogida [14]. enfermedad oral puede ocurrir cuando los factores ambientales locales en el biofilm dirigen la selección y enriquecimiento de patógenos putativos que pertenecen a la microbiota residente iniciando así una respuesta inflamatoria que induce la resorción progresiva del hueso en implantes dentales [15].
superficies de tope de titanio rugosa se ha demostrado para aumentar la formación de placas in vivo
[16]. Sin embargo, en comparación, superficies de apoyo lisas con valores de rugosidad de superficie de & lt; 0,3 μ m no promueven la formación de biopelículas en vivo
en la misma medida [17]. Suave, se volvió de titanio (TU), nanoporoso TiO 2 recubierto (SG) y anodizado Ca 2 + modificada (OC) superficies, han demostrado ser adecuados para la osteointegración, así como la curación de los tejidos blandos [7, 18, 19]. En este estudio, mostramos que no existen diferencias significativas en los principios de la formación de biopelículas de S. sanguinis
y A. Naeslundii
, en estas tres superficies lisas. Sin embargo, la presencia de saliva llevó al desarrollo de una significativa mayor biofilm biovolumen por estos dos colonizadores en todas las superficies que cuando la saliva no estaba presente.
Métodos
Preparación de superficies de titanio
discos de titanio comercialmente puro convertido (grado 4), con un diámetro de 8 mm y un orificio central, se dividieron en cuatro grupos. Los discos convertido originales sirvieron como controles (TU) y los otros grupos fueron cada modificados en una de tres formas diferentes: el tratamiento sol-gel para crear un nanoporoso TiO 2 capa (SG), de una manera similar a la tratada térmicamente los discos tratados sol-gel (HT), o oxidado anódicamente y se tratan de calcio (OC)
Para el tratamiento sol-gel (SG), los discos se limpiaron en una solución básica de peróxido de hidrógeno (H 2O;. 30 % H 2O 2, y 25% NH 4OH en la relación de 5: 1: 1) a 85 ° C durante cinco minutos. Después de un extenso lavado en agua destilada, los discos se secaron en una corriente de N 2. El sol fue preparado por solución de 1 [10,22 g tetraisopropylorthotitanate, (Merck, Hohenbrunn, Alemania) disuelto en 15 ml de etanol] mezclando con una solución de 2 [15 ml de etanol, 170 l H 2O y 840 l HNO 3 ]. Después de mezclar durante una hora, se añadieron 100 l de PEG 400 (Merck, Hohenbrunn, Alemania) y la solución se agitó vigorosamente. El sol claro se mantuvo a temperatura ambiente durante el envejecimiento y el proceso de recubrimiento por inmersión. Dip-recubrimiento se realizó con el uso de una etapa de motor paso a paso controlado por ordenador con una velocidad de inmersión de 30 mm /min, y los discos se sinterizaron en un horno a 500 ° C (aire) durante 30 minutos. Después de calentar los discos se limpiaron por ultrasonidos en etanol durante cuatro minutos y finalmente se seca en corriente de N 2. Las superficies tratadas con calor (HT) que sirvieron como controles para las superficies SG se sinterizaron a 500 ° C (aire) como se describe anteriormente. El anódicamente oxidados y calcio incorporado (OC) superficies se prepararon por oxidación anódica con un electrolito que consta de hidrato de glicerofosfato de sodio (C 3 H 6 (OH) 2 PO 4Na 2 × H 2O) y acetato de calcio (Ca (CH 3COO) 2) [20, 21].
Caracterización de superficies de titanio
para investigar rugosidad de la superficie en el nivel micrométrico, tres discos de cada superficie se investigaron a los diez sitios usando un interferómetro óptico (MicroXamTM, phaseshift, Tucson, EE.UU.). Cada medición se llevó a cabo sobre un área micras 200 × 260. Un filtro gaussiano de paso alto (50 × 50 micras) se utilizó para la rugosidad separado de errores de forma y de ondulación [22]. La evaluación se realizó con el software Surfascan y las imágenes fueron producidas bajo el SPIP ™ (Barrido por Sonda procesador de imagen, Imagen Metrología, Dinamarca). Tres parámetros tridimensionales diferentes se utilizaron para caracterizar la superficie: desviación media altura [S a (m)], un parámetro espacial - densidad de cumbres [S ds (1 /m 2)] y un parámetro híbrido que incluye la variación en la altura y la dirección espacial [S dr (%)].
La topografía de superficies modelo de sílice, recubierto por inmersión como para las superficies de SG, se caracterizó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM 3100 , Nanoscope III, Instrumentos digital). Para caracterizar la topografía en el nivel nanométrico de la resolución, el parámetro de superficie de dos dimensiones, la desviación media altura [R a (nm)], se aplicó. Espesor del revestimiento se midió con SG elipsometrıa nula a λ = 632 nm (Auto-El-III, Rudolph Research, EE.UU.). El índice de refracción supuesta de TiO 2 en la estructura cristalina Anastase fue n = 2,49.
Cepas bacterianas y la cultura
Para los ensayos de biofilm oral de la cepa de tipo Streptococcus sanguinis
ATCC 10556 y Actinomyces Naeslundii
aislado de la placa dental [23] se utilizaron. Todas las cepas se mantuvieron rutinariamente en agar sangre o en caldo Todd-Hewitt (TH) a 37 ° C en 5% de CO 2
. Ensayo para la adhesión y la formación de biopelículas principios de
Inmediatamente antes de la inoculación bacteriana, discos se limpiaron en un baño de ultrasonidos con Extran MA01 ® (Merck, Darmstadt, Alemania) diluida 1:40 en agua destilada, se trató con etanol, y se coloca en poliestireno de 6 pocillos placas de titulación (de fondo plano) (de múltiples pocillos ™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). caldos de cultivo durante la noche se diluyeron 1:50 en caldo de Todd Hewitt fresco previamente calentada a 37 ° C en 5% de CO 2 y cultivadas hasta la fase de crecimiento exponencial media (OD 600 nm≈0.6). Los cultivos se diluyeron a continuación para dar una concentración final de aproximadamente 1 × 10 8 células /ml para S. sanguinis
y 1 × 10 7 células /ml para A. Naeslundii
. 1,5 ml de S. sanguinis Opiniones y 4,5 ml de A. Naeslundii
suspensiones se inocularon en los pocillos. La placa de microtitulación se cerró herméticamente con cinta de parafina y se incubó a 37 ° C en un agitador rotatorio a 300 rpm en 5% de CO 2. Después de la incubación durante 2 y 14 h, las superficies se lavaron tres veces con tampón de fosfato de potasio 10 mM, pH 7,5 (PBS) para eliminar las células débilmente unida. Las bacterias adherentes se fijaron en 4% de paraformaldehído para 16S rRNA hibridación. Todos los experimentos de biopelícula se llevaron a cabo utilizando cultivos bacterianos independientes tres veces para cada tipo de superficie.
Para los experimentos de saliva, la saliva no estimulada entero se recogió de un voluntario sano con una buena salud oral, se centrifugó durante 10 minutos para sedimentar las mucinas y bacterias, y el filtro esterilizado sobrenadante (tamaño de poro 0,22 micras). Alícuotas de las suspensiones bacterianas (1,5 ml de S. sanguinis
y 4,5 ml de A. naeslundii
) se centrifugaron y el sedimento se resuspendió en 6 ml de la saliva estéril. suspensiones bacterianas (que contiene 10 7 de colonias de unidades de formación por ml como se muestra por cultivo) y luego se añadieron a los pocillos. Las placas se agitaron suavemente durante 14 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Después de este tiempo, las superficies se enjuagaron tres veces con 3 ml de PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incubaron durante la noche a 4 ° C.
16S FISH y microscopía confocal de barrido láser rRNA
bacterias fijadas en los discos se lavaron con frío , PBS estéril y se sometió a la permeabilización de la membrana celular con 100 l de lisozima (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) [(70 U l -1) en 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 (Sigma, St Louis, MO , EE.UU.) que contiene EDTA 5 mM (Merck, Damstadt, Alemania)] durante 9 minutos a 37 ° C. Después de enjuagar con agua ultra-pura, las bacterias se deshidrataron a través de una serie de lavados con etanol. tampón de hibridación [0,9 M NaCl, tampón 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, con 0,01% de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 25% de formamida] que contiene 20 ng de sonda de oligonucleótido marcada ml -1 se pipeteó en los discos de titanio . El cóctel de sonda consistía en la STR493 sonda estreptocócica (5'-GTTAGCCGTCCCTTTCTGG-3 ') [24], marcado con fluorescencia verde con ATTO-488 para evaluar la cantidad de S. sanguinis
, y una sonda marcada-rojo ATTO-565 EUB338 (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 ') [25] para evaluar el volumen total de biopelículas. La hibridación se llevó a cabo a 47 ° C en una cámara húmeda durante 90 minutos. Las superficies se lavaron tres veces con 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) que contiene EDTA 5 mM y 0,01% de dodecil sulfato de sodio, y dos veces con NaCl mM 159, durante 30 y 15 minutos, a 47 ° C bajo agitación suave. Finalmente, las superficies de titanio se lavaron con agua ultra-pura enfriada con hielo, montados y pegados en portaobjetos de vidrio para el análisis mediante microscopía de barrido confocal invertido láser (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corporation, Tokio, Japón). fluorescencia verde fue proporcionada por un láser Ar (excitación láser de 488 nm) y la fluorescencia roja fue dada por un láser de He-Ne-G (543 nm de excitación láser). CLSM imágenes fueron adquiridas con un objetivo de inmersión en aceite (× 60). Cada pila tenía una cobertura de área del campo de sustrato de 215 × 215 m, y el z-paso fue 2 micras. Las imágenes se obtuvieron a partir de los 15 sitios seleccionados al azar por disco. Análisis Imagen editorial
Las pilas de imágenes se convirtieron en formato TIFF y analizados utilizando el software bioImage_L [26] para el cálculo de los parámetros estructurales de la biopelícula. S. sanguinis
ocupa tanto de la EUB338 universal de sonda (rojo) (Figura 1a) y la sonda específica Streptococcus STR493 (verde) (Figura 1b) y en las imágenes presentan estas células aparecen de color amarillo debido a la co-localización de las sondas (Figura 1c). A. Naeslundii
, que ocupa sólo la sonda EUB338, aparece de color rojo (Figura 1c). Puesto que el software utilizado no pudo identificar las células de color amarillo, el biovolumen de S. sanguinis
se cuantificó usando el número de células verdes. El biovolumen biofilm de A. naeslundii
continuación se calculó indirectamente restando el S. sanguinis biovolumen
(verde) biofilm del total. Figura 1 16S rRNA fluorescencia en imágenes de hibridación in situ de S. sanguinis y A. naeslundii en biofilms mono- y de especies dobles. CSLM imágenes que muestran las biopelículas de doble especies de S. sanguinis
y A. Naeslundii gratis (a) manchadas con la sonda roja EUB338 16S rRNA FISH, (b) teñidas con la sonda FISH STR493 16S rRNA verde o (c) teñido con ambas sondas. La barra muestra 4 micras
El análisis estadístico se utilizó
la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para analizar las diferencias en biovolumen biopelícula entre las superficies de prueba y de control y valores de p & lt.; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados y Discusión
Caracterización de las superficies de titanio
Caracterización de orientación de la superficie por interferometría reveló que la (SG) superficie nanoporoso, así como el tratamiento térmico (HT) y anódica oxidan Ca 2 + incorporados (OC) superficies eran isotrópico, mientras que la superficie torneada (TU) fue anisotrópico (con topografía de la superficie orientada) (Figura 2, columna izquierda). Las mediciones de parámetros de la superficie (Figura 2, columna derecha), reveló que la superficie nanoporoso (SG) tenía una desviación media altura de la superficie (S a) de 0,16 ± 0,04 micras mientras que el área de la superficie desarrollada [27] y la densidad de cumbre ( S ds) eran 3 ± 1% y 0,13 ± 0,005 cumbres /m 2, respectivamente. Esta topografía era similar a la del control tratada térmicamente (HT) (S a 0,16 ± 0,02 m, S dr 3 ± 1%, S ds 0,12 ± 0,007 cumbres /m 2) y la vuelta (TU) (S a 0,18 ± 0,02 m, S dr 4 ± 1%, el S ds 0,13 ± 0,022 cumbres /m 2) las superficies. El anódica Ca 2 + incorporado (OC) superficie oxidada sin embargo, tuvo los valores más altos para la desviación del promedio (0,22 ± 0,01 micras), proporción de área de superficie desarrollada (15 ± 2%), y la densidad de la cumbre (0,23 ± 0,003 cumbres /m 2). Por lo tanto, la superficie OC tenía algo mayores estructuras microtopográficas que las otras superficies investigado y tenía un área de superficie mayor potencial de interacciones bacterianas. Sin embargo, a pesar de las diferencias en el nivel de microescala de rugosidad entre la TU, SG y HT, por un lado y la superficie de OC en el otro, todos fueron categorizados como suave (es decir
S a. & Lt; 0,5 μ m) [28]. Figura 2 imágenes de Interferometría y superficiales características de las superficies de titanio lisas. Las imágenes de interferometría se produjeron con SPIP ™. La desviación media altura (Sa), la densidad de las cumbres (SDS) y la ampliación de la superficie (SDR) se muestran para las diferentes superficies; SG (sol-gel derivado de TiO2 recubierto nanoporoso), HT (tratamiento térmico), TU (volvió) y OC (anódicamente oxidado Ca2 + incorporado) las superficies.
Imágenes superficie Microscopía de fuerza atómica de nanoporoso derivado de sol-gel de TiO 2 superficies mostraron que las partículas estaban bien distribuidos y organizados (Figura 3). El revestimiento condujo a la formación de nanoestructuras de unos pocos nanómetros hasta 100 nm con R a 1,58 nm. El espesor de la nanoporoso TiO 2 de recubrimiento, era de 90 nm ± 10 nm, medido por elipsometría. Figura 3 Caracterización de la superficie recubierta nanoporoso TiO 2 mediante microscopía de fuerza atómica. Una imagen AFM representante de la superficie recubierta de TiO2 nanoporoso. Tenga en cuenta el nanofeatures homogéneos y uniformemente distribuidos.
Propiedades de las superficies lisas no influyen en la adherencia y la formación de biopelículas temprana por S. sanguinis y A. Naeslundii Francia El principal objetivo del presente estudio fue investigar la adhesión microbiana a nanoporoso TiO < sub> 2 (SG) superficies y comparar esto con otras superficies lisas de titanio utilizados para pilares de implantes. El modelo utilizado es compatible con CLSM ya que los discos se pueden montar en vidrio-diapositivas y ver directamente en el microscopio. Se consideró que la cantidad de bacterias en las superficies después de 2 horas de incubación para representar el nivel de la adhesión bacteriana a la superficie. Después de 2 horas, A.
Naeslundii y S. sanguinis
estuvieron presentes en todas las superficies como grupos de células escasamente distribuidas (Figura 3b - panel superior). El biovolumen biofilm en la superficie SG fue similar a la del control HT y la superficie TU. Sin embargo, la superficie de OC, mostró un nivel ligeramente más alto de adhesión pero esto no fue-significativamente diferente de la de las otras superficies (p = 0,05) (Figura 4a). Así, parece que el nivel más alto de rugosidad a microescala visto para la superficie OC no era suficiente para proteger a las bacterias de las fuerzas de expulsión. Se obtuvieron resultados similares en un estudio in vivo
en donde las superficies con un S a = 0,21 micras mostró algo mayores niveles de adhesión microorganismos que aquellos con un S a en el intervalo de 0,05 a 0,13 m [29] y una rugosidad media en altura (R a) de 0,2 micras se ha propuesto como un umbral para la adhesión bacteriana significativa [17]. La proporción de A. naeslundii
era mayor que la de S. sanguinis
en todas las superficies (aproximadamente 85% de la biovolumen biofilm) lo que sugiere que, en estas condiciones, A. naeslundii
era mejor capaz de adherirse de S. sanguinis
. Figura 4 La formación de biopelículas de S. sanguinis y A. Naeslundii más de 2 y 14 horas en las superficies lisas de titanio. (A) Los gráficos que muestran la media ± desviación estándar del volumen de biopelículas generada a partir de tres conjuntos independientes de experimentos. SG (sol-gel derivado de TiO2 recubierto nanoporoso), HT (tratado térmicamente), TU (volvió) y OC (anódicamente oxidado y Ca2 + incorporado). No se observaron diferencias significativas entre las superficies en cada momento. (B) Imágenes representativas de CSLM de 2 y 14 horas biopelículas visualizados con 16S rRNA FISH utilizando sondas de oligonucleótidos dirigidos S. sanguinis gratis (STR493 - verde) y todas las bacterias (EUB338 - rojo). Dado que tanto el EUB338 rojo y verde STR493 la sonda fueron tomadas por S. sanguinis
, las células aparecen de color amarillo, mientras que A. Naeslundii
única que incorpora la sonda EUB338 aparece de color rojo. Las barras de escala representan 10 micras.
Después de 14 horas en presencia de medio de crecimiento TH, las bacterias adheridas han empezado a dividirse y crecer y los niveles de cobertura microbiana son por lo tanto considera que reflejan las etapas iniciales de la formación de biopelículas. Sin embargo, los niveles de crecimiento visto aquí entre dos y 14 horas eran bajos y esto puede reflejar el hecho de que en contacto con una superficie, las bacterias planctónicas se someten a una transición de crecimiento exponencial a una tasa de crecimiento mucho más lenta [30]. No hubo diferencias en los niveles de cobertura entre las diferentes superficies pueden ser observados (Figura 4b, panel inferior). De acuerdo con estas observaciones, no se detectaron diferencias en la biovolumen general biofilm entre las cuatro superficies. La proporción relativa de S. sanguinis
había aumentado a 31%, aunque los niveles eran aún inferiores a los de A. naeslundii
(69%). Por lo tanto, si bien los niveles iniciales de adherencia fueron ligeramente superiores en la superficie OC, posiblemente debido a la mayor área de superficie, esto no fue sostenido como el biofilm comenzó a desarrollarse.
Saliva aumenta la adherencia de S. sanguinis y A. Naeslundii en biopelículas de especies dobles
para investigar si la saliva adhesión a la superficie afectada, S. sanguinis
y A. naeslundii
se suspendieron en la saliva estéril antes de la exposición a las superficies. Este aumento de la adherencia de ambas especies a todas las superficies después de 2 horas (Figura 5B, panel superior). Las bacterias estaban presentes como grupos, probablemente debido a la agregación de las células cubiertas de proteínas salivales. El aumento fue de hasta 11 veces (Figura 5a) en comparación con en ausencia de saliva (Figura 4a) lo que sugiere que la saliva promueve la adhesión de estas dos especies. En contraste, en estudios previos se demostró pre-recubrimiento de superficies de titanio con unas películas salivales experimentales no afectar a la adherencia de A. naeslundii
[31]. Esta diferencia puede atribuirse al hecho de que en el estudio de Lima et al
. 2008, las bacterias se suspendieron en caldo nutriente en lugar de saliva. Figura 5 La formación de biopelículas de S. sanguinis y A. naeslundii en presencia de saliva durante 2 y 14 horas en las superficies de titanio lisas. (A) Los gráficos que muestran la media ± desviación estándar del volumen de biopelículas generada a partir de tres conjuntos independientes de experimentos. SG (sol-gel derivado de TiO2 recubierto nanoporoso), HT (tratado térmicamente), TU (volvió) y OC (anódicamente oxidado y Ca2 + incorporado). No se observaron diferencias significativas entre las superficies en cada momento. (B) Imágenes representativas de CSLM de biopelículas de dos y 14 horas visualizados con 16S rRNA FISH utilizando sondas de oligonucleótidos dirigidos Streptococcus sanguinis gratis (STR493 - verde) y todas las bacterias (EUB338 - rojo). Dado que tanto el EUB338 rojo y verde STR493 la sonda fueron tomadas por S. sanguinis
, las células aparecen de color amarillo, mientras que A. Naeslundii
única que incorpora la sonda EUB338 aparece de color rojo. Las barras de escala representan 25 micras.
Después de 14 horas sin cambio importante se observó en la biopelícula biovolumen indicando que no se había producido un crecimiento en presencia de saliva. Sin embargo, es probable que subestimar la formación de biopelículas y el crecimiento in vivo
ya que en biopelículas sobre implantes dentales superficies contratación de una gama de otras especies bacterianas que permitiría una acción concertada para degradar las glicoproteínas salivales y por lo tanto proporcionan nutrientes para el crecimiento de estos datos [32] . Las diferentes superficies no mostraron diferencias en biovolumen total de biofilm (p & lt; 0,05). Y la proporción de la especie bacteriana fue similar tanto a las 2 y 14 horas, con A. naeslundii
que constituyen aproximadamente el 80% de la biovolumen
el modelo usado aquí activar las diferentes superficies a ensayar en presencia de saliva. El uso de 16S rRNA FISH permite la detección de las variaciones interespecies en la adhesión y el crecimiento, así como las relaciones espaciales entre las bacterias sobre diversas superficies. Además, la extensa enjuague durante el procedimiento FISH 16S rRNA asegura que las bacterias sólo es verdaderamente adheridas están presentes en la superficie durante la cuantificación. Un inconveniente de este modelo es que la agitando suavemente utilizado aquí puede no reflejar con precisión las fuerzas de cizallamiento presentes en una superficie expuesta en la cavidad oral. Sin embargo, esto podría ser superado mediante el uso de un modelo de flujo de la cámara de [33].
Conclusiones
modificación Nano-topográfica de superficies de titanio lisas no causó significativamente mayor adhesión y la formación de biopelículas de S. sanguinis
y A. naeslundii in vitro
de lo que se encuentra en superficies torneadas o los tratados con Ca 2 + incorporación durante la oxidación anódica. En presencia de saliva, la adhesión se aumentó más de diez veces en comparación con en ausencia de saliva y no se observaron diferencias entre las superficies. Estos datos sugieren que la modificación con nanoporoso derivado de sol-gel de TiO 2, que se ha demostrado para mejorar la cicatrización de los tejidos blandos en vivo
, no conduce a una mayor adhesión y formación inicial de biopelículas por las dos especies comensales probadas de las otras superficies. Sin embargo, no se puede excluir que durante un período de tiempo más largo en la presencia de otras especies bacterianas, mayores diferencias en la formación de biopelículas sobre las diferentes superficies pueden ser vistos
Lista de abreviaturas
CLSM:.
confocal de barrido láser micrscopy
PBS:
tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 7,5
FISH:
de fluorescencia in situ
hibridación
TU:
volvió superficies
OC:
anódicamente oxidados Ca 2 + incorporado superficies
SG:
sol-gel nanoporoso derivada TiO 2 superficies recubiertas
HT: Las superficies tratadas con calor
.
Declaraciones
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Sociedad sueca dental, la Fundación de Investigación Hjalmar Svensson, el Consejo Sueco de Investigación (AW), y la Fundación conocimiento, Suecia.
autores de archivos presentados originales para imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12903_2010_176_MOESM2_ESM.jpeg autores 12903_2010_176_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original para la figura 2 12903_2010_176_MOESM3_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 3 12903_2010_176_MOESM4_ESM.jpeg autores archivo original para el archivo original de la figura 4 12903_2010_176_MOESM5_ESM.jpeg los autores de la figura 5 Conflicto de intereses
los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores
VF participaron en la planificación del estudio, realizado la mayor parte del trabajo de laboratorio, y participó en el análisis de datos y redacción del manuscrito. PL prepara las superficies derivadas de sol-gel y participó en la redacción del manuscrito. AW participó en la planificación del estudio y la redacción del manuscrito. LCP participó en el diseño experimental y redacción del manuscrito. GS participado en el diseño del estudio, análisis de datos y redacción del manuscrito. JRD participó en el análisis de datos y redacción del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
