oral humana
Resumen Antecedentes
La placa dental formada sobre la superficie del diente es un ecosistema complejo compuesto por diversas bacterias orales y componentes salivales. La acumulación de placa dental es un factor de riesgo de caries dental y enfermedades periodontales. L-arginina se ha informado a disminuir el riesgo de caries dentales mediante la elevación de pH de la placa a través de la actividad de la arginina deiminasa en bacterias orales. Aquí se evaluó el potencial de L-arginina para eliminar biopelículas orales establecidas.
Métodos
se formaron biopelículas utilizando la saliva humana mezclada con caldo de infusión cerebro corazón suplementado con 1% de sacarosa en placas de múltiples pocillos o en discos de plástico. Después de lavar las biopelículas con solución salina, citrato (10 mM, pH 3,5), o L-arginina (0,5 M, pH 3,5), las biopelículas retenidas se analizaron por tinción con cristal violeta, microscopía electrónica de barrido, y basada en el Illumina 16S rDNA de secuenciación.
resultados
lavado con ácido L-arginina biofilms orales separadas de manera más eficiente que la solución salina y la masa biofilm reducido significativamente retenidos en placas de múltiples pocillos o en discos de plástico. análisis microbiota basado en Illumina mostró que el citrato (pH 3,5) preferentemente lavada Streptococcus
del biofilm oral, madura, mientras que ácido L-arginina preparó con 10 mM de tampón de citrato (pH 3,5) eliminó no específicamente componentes microbianos de la vía oral biofilm.
Conclusiones
Ácido L-arginina preparada con tampón citrato (pH 3,5) y se eliminan eficazmente desestabilizaron las biopelículas orales maduros. La solución ácida L-arginina se ha descrito aquí podría ser utilizado como un aditivo que mejora la eficacia de los enjuagues bucales utilizados en la higiene bucal.
Palabra clave
L-arginina Biofilm de enjuague bucal Oral microbioma material complementario saliva Electrónico
la línea versión de este artículo (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
Hay más pruebas de que el deterioro de la higiene bucal se asocia con la enfermedad periodontal [1], así como un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular [2, 3], síndrome metabólico [4, 5], y el nacimiento prematuro [6]. cuidado de la higiene oral también es reconocida como una medida crítica que reduce los riesgos para la neumonía asociada a cuidados sanitarios (HCAP). biofilms orales pueden actuar como reservorios de bacterias relacionadas con la neumonía, como lo sugiere la similitud entre la microbiota oral y muestras clínicas HCAP [7-9]. Muchos ensayos clínicos que investigaron la eficacia de los cuidados de higiene oral en la profilaxis de la HCAP, incluyendo la neumonía derivada de la ventilación mecánica, se han reportado. Estos ensayos encontraron: (i) las medidas de higiene oral mecánica y química reducen la tasa de colonización de patógenos respiratorios en la microbiota oral de [10, 11]; (Ii) el cuidado de higiene bucal, ya sea con un enjuague bucal de clorhexidina o gel se asoció con una reducción del 40% en la neumonía asociada a la ventilación en adultos en estado crítico [12]; y (iii) la limpieza mecánica por vía oral redujo significativamente el riesgo de muerte por neumonía [13].
cavidades orales contienen diversa microbiota que los números de cerca de 700 especies [14]. Este ecosistema incluye bacterias formadoras de biopelículas como el Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
, y Aggregatibacter Actinobacillus
. A pesar de que la microbiota varía entre los individuos, dentro de un individuo dado el microbioma oral es relativamente estable [15]. Sin embargo, la composición microbiana oral puede cambiar rápidamente bajo condiciones comprometidas que pueden ocurrir durante las hospitalizaciones [16]. Por lo tanto, cuidado de la higiene oral en pacientes críticamente enfermos es muy importante prevenir la colonización de bacterias resistentes a múltiples fármacos o sobrecrecimiento de patógenos respiratorios. la higiene oral inadecuada puede dar lugar a la formación de la placa dental madura en las superficies dentales o células epiteliales orales, y esta placa puede ser resistente a la limpieza de un enjuague con agua o incluso con un cepillado de dientes manual, lo que pone de relieve la necesidad de estrategias eficaces que suprimen biofilm oral, formación. Varios ensayos para poner a prueba la capacidad de los extractos de hierbas [17], desinfectantes [18, 19], los inhibidores de la producción de polisacáridos [20, 21], y los azúcares raros [22] para reducir la formación de biofilms orales se han realizado.
Recientemente , agentes generadores de alcalinos, tales como L-arginina y urea se predijo para inhibir el crecimiento de bacterias acidogénicas o acidúricas elevando el pH del medio oral [23]. El metabolismo de la L-arginina y urea por arginina deiminasa y ureasa, respectivamente, produce amoníaco. Muchas bacterias orales poseen un sistema de arginina deiminasa, que metaboliza L-arginina para producir ornitina y amoniaco que aumenta el pH de biofilms orales. Los ensayos clínicos que investigan los dentífricos o enjuagues bucales que contienen L-arginina-mostraron un efecto protector contra el desarrollo de la caries dental en los sujetos jóvenes [24, 25]. Además, la L-arginina y fluoruro suprimidos sinérgicamente el crecimiento y el biofilm de S. mutans
formación [26].
L-arginina es un aminoácido básico que contiene un grupo guanidina. Como el clorhidrato de guanidina, L-arginina puede aumentar la solubilidad de proteínas y suprimir la agregación de proteínas [27]. Aunque el mecanismo preciso para la inhibición de la L-arginina-mediada de las interacciones proteína-proteína aún no está claro, L-arginina puede cambiar las tensiones superficiales de las proteínas mediante la interacción con proteínas o el agua circundante sin la fijación apretada visto con otros agentes tales como el clorhidrato de guanidina [28]. Debido a esta interacción leve conserva funciones de la proteína, L-arginina se ha usado para la solubilización de las proteínas expresadas de forma exógena o anticuerpos para uso farmacéutico. Además, se informó recientemente de L-arginina para disminuir la infectividad de los virus de envoltura tales como virus del herpes simple y virus de la gripe, probablemente debido a la función comprometida de las proteínas en el sobre [29].
Biofilm oral es un ecosistema complejo que es compuesto por diversas bacterias, glucano insoluble, y glicoproteínas salivales. La eliminación de esta placa biológica sólido a partir de las superficies del diente por simple aclarado con agua o incluso con cepillado mecánico puede ser difícil. placa residual también sirve como una base para una mayor formación de biopelículas. Como se espera que la L-arginina para inhibir la formación de biopelículas oral y también desestabilizar agregados complejos en la placa dental, la inclusión de este aminoácido en un enjuague bucal podría facilitar la eliminación de biofilm oral. En este estudio, hemos evaluado el potencial de la L-arginina como un limpiador para eliminar las biopelículas orales ya establecidos.
Métodos
Matar ensayo para Streptococcus mutans
madre de glicerol de S. mutans
GS5 rayados en infusión cerebro corazón (BHI) placas de agar que a continuación se incubaron anaeróbicamente a 37 ° C durante 48 h. cultivo anaerobio se realizó utilizando un sistema de AnaeroPack (Mitsubishi Gas Co., Ltd.). Varios S. mutans
colonias GS5 se inocularon en caldo BHI y se cultivó a 37 ° C durante 48 h. Los cultivos se centrifugaron a 15.000 rpm durante 5 min y se resuspendieron en solución salina. Se añadieron suspensiones bacterianas (0,1 ml) a 0,9 ml de solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5), o 0,5 M de L-arginina en citrato 10 mM (pH 3,5). Después de incubar durante 5 min a 37 ° C, se prepararon diluciones de 10 veces en serie con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se extendió 0,1 ml de la dilución apropiada sobre placas de agar BHI. Después de una incubación anaeróbica 72 h a 37 ° C, se contó el número de colonias y se comparó con el número en el tratamiento de solución salina.
Biofilm ensayo de inhibición
Para evaluar el efecto inhibidor sobre S. mutans
GS5 biofilm formación, 0,1 ml de solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5), o 0,5 M pH3.5-7.0 L-arginina (ajustado por 10 mM de tampón de citrato) se mezclaron con un volumen igual de la suspensión bacteriana (1% v /v de 48 h de cultivo) en 2 x BHI que contenía un 2% de sacarosa. Las mezclas se añadieron a placas de 96 pocillos y se incubaron anaeróbicamente a 37 ° C. Después de un cultivo de 24 h, las biopelículas formadas en las partes inferiores así se cuantificaron por tinción con cristal violeta como se describe a continuación. COLECCIÓN de muestras salivales humanas
Después se obtuvo el consentimiento informado por escrito de nueve voluntarios sanos (21-27 años de edad , macho), que fueron solicitados para recoger la saliva excretada mientras que la goma de mascar de la cera durante 5 min. Los criterios de exclusión fueron menores de 20 años de edad o haber recibido tratamiento con antibióticos dentro de las 4 semanas anteriores.
efecto de limpieza de la L-arginina en el biofilm oral, formada en discos de plástico
se formaron biopelículas orales Humanos sobre discos de plástico estéril de 13,5 mm (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite, Co., Ltd., Tokio), establecido en placas de cultivo de 24 pocillos. Los discos se incubaron en 0,5 ml de BHI que contenía 1% de sacarosa y la saliva humana 20% recogidos de tres voluntarios sanos (# 1- # 3). Después de un cultivo anaeróbico 72 h, los discos se retiraron y se lavaron una vez con solución salina. Los biofilms en los discos se lavaron adicionalmente con 0,5 ml de citrato 10 mM (pH 3,5), 0,5 M de cada uno de L-arginina, L-alanina, L-glicina o L-lisina (todo ajustó el pH a 3,5 por 10 mM citrato) por agitación durante 30 min a 37 ° C. A continuación, los discos se lavaron de nuevo con 0,5 ml PBS (pH 7,4), se tiñeron con 0,5 ml 0,01% de cristal violeta durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los discos se lavaron entonces cuatro veces con 1,0 ml de solución salina y se seca al aire. Después de tomar la fotografía, el colorante restante se eluyó con ácido acético 0,5 ml 33% en agitación durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia de los eluyentes a 550 nm se midió a continuación.
Ensayo de limpieza en biofilm salival humana usando micropocillos
saliva humana recogidos de cuatro voluntarios sanos (# 7 4- #) se añadieron a BHI que contenía 1% de sacarosa a 20 % (v /v). biofilms orales humanos modificados también se prepararon mediante la adición de 48 h de S. mutans
culturas GS5 (1% de volumen final) para simular biofilm cariogénico. Cada mezcla (0,1 ml) se añadió después a placas de 96 pocillos y se incubaron anaeróbicamente a 37 ° C. Después de 72 h, se eliminaron los cultivos, y la biopelícula formada en el fondo de las placas se lavaron una vez con 0,2 ml de solución salina. Cada pocillo se lavó con 0,1 ml de solución salina (control), citrato 10 mM (pH 3,5, disolvente para L-arginina en este estudio), o 0.5 M L-arginina (pH 3,5) mediante agitación durante 30 min a 37 ° DO. Los reactivos de la prueba se decantaron y cada pocillo se lavó tres veces con 0,2 ml de solución salina. El biofilm restante se tiñó con 0,1 ml 0,01% de cristal violeta durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, los pocillos se lavaron cuatro veces con 0,2 ml de solución salina, y el colorante restante se eluyó con ácido acético 0,2 ml 33% en agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Después se midió la absorbancia de los eluyentes a 550 nm. Seis pozos se utilizaron para cada muestra en un solo ensayo. Los ensayos se repitieron tres veces de forma independiente. Microscopía electrónica de barrido
biofilms oral humana se formaron en discos de plástico estériles 13,5 mm utilizando las muestras de # 4 a # 7. Los discos se incubaron en 0,5 ml de BHI que contenía 1% de sacarosa y la saliva humana 20%. Después de un cultivo anaeróbico 72 h, los discos se retiraron y se lavaron una vez con solución salina. Los biofilms en los discos se lavaron adicionalmente con 0,5 ml de solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5), o 0.5 M L-arginina (pH 3,5) mediante agitación durante 30 min a 37 ° C. A continuación, los discos se lavaron de nuevo con 0,5 ml PBS (pH 7,4), y las biopelículas en los discos se fijaron con glutaraldehído al 2% en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,2). Después de la fijación, las biopelículas se deshidrataron en una serie de etanol y se secaron en un aparato de secado de punto crítico Hitachi PCP-2. Los discos se revistieron con platino /paladio en un Hitachi E-102 revestidor de bombardeo iónico y se examinaron con un microscopio electrónico de barrido JEOL JCM-6000. El área de biopelículas retenido después de lavar con cada reactivo de ensayo se midió utilizando la herramienta de selección automática del color en Photoshop CS6. Las relaciones de valor de píxel del área de biofilm a la superficie total de observación se calcularon a partir de cinco campos seleccionados al azar a 100 aumentos.
Análisis de la composición microbiana de la secuenciación del 16S rDNA Francia El microbioma salivar de los seis voluntarios sanos (# 4- # 9 ) se caracterizó por análisis de secuenciación de Illumina Miseq 16S rDNA de ADN extraído de 3 ml de saliva. Para identificar los grupos microbianos que eran sensibles a citrato o L-arginina enjuague, biofilms saliva humanos derivados formados en discos de plástico de 13,5 mm se lavaron con los reactivos de ensayo descritos anteriormente. Los reactivos de ensayo se recuperan a continuación, y las bacterias de los lavados se recogieron por centrifugación (fracción de lavado-out). Los discos se lavaron tres veces con 0,5 ml de solución salina, cortado en trozos con tijeras estériles, y después se transfirieron a 0,5 ml de solución salina para la sonicación con un Bioruptor (CosmoBio, 3 x 1 min con un intervalo de 1-min, ajuste de salida H). Los biofilms separados se recogieron por centrifugación (fracción sostenida). ADN de ambas fracciones también se purificó y la composición microbiana determinada por análisis de secuenciación de 16S rDNA.
Extracción de ADN se realizó de acuerdo con el método descrito por Morita et al. [30]. bibliotecas de secuenciación se prepararon mediante la amplificación de la región V3-V4 del 16S rDNA utilizando los cebadores descritos por Klindworth et al. [31]. Después de la amplificación inicial, una segunda PCR se llevó a cabo para unir adaptadores Illumina, así como códigos de barras que permitieron la multiplexación. Las amplificaciones se realizaron en 25 reacciones l que contenía 2,5 l plantilla diluidos, 12,5 l 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix y 2,5 l de cada cebador. El ciclo térmico consistió en una etapa inicial de desnaturalización (3 min a 95 ° C), seguido de 25 ciclos de desnaturalización (30 s a 95 ° C), hibridación (30 s a 55 ° C) y 30 s de extensión a 72 ° C. El paso de extensión final consistió en 5 min a 72 ° C. Amplicones fueron purificados usando perlas AMPure XP (Beckman Coulter). La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina MiSeq (MiSeq Reactivo Kit ver. 3, 600 ciclos) de acuerdo con las especificaciones del fabricante para generar de extremo emparejado lee de 300 bases en cada dirección. Un total de 10.381.210 2 x 300 pares de bases se lee con un promedio de 432 550 lee por se obtuvo la muestra. Primer secuencias fueron recortados, y la gama emparejado lee fusionaron utilizando FASTQ-join [32] con los parámetros por defecto y procesados con el QIIME 1.8.0 tubería [33]. Después de un cheque por la quimera Usearch, 20.000 Illumina lecturas por muestra (puntuación media de calidad por encima de 20) fueron seleccionados al azar para su posterior análisis. Uso de la UCLUST [34] algoritmo incorporado en la tubería QIIME, las secuencias se agruparon en & gt; 97% de identidad en la base de datos de referencia Greengenes, produciendo 635 unidades taxonómicas operacionales (Otus). El uso de la tubería QIIME, UniFrac distancias no ponderados fueron producidos y utilizados para investigar la diversidad beta mediante el trazado de PCA coordenadas
seqeunce de nucleótidos
Los datos de secuencia se han depositado en la base de datos DDBJ (número de acceso: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441).. estadísticas
el análisis estadístico de los datos se realizó con StatFlex ver. 6.0 (Artech Co., Ltd., Tokio) mediante análisis de la varianza (ANOVA) para comparar las medias de todos los grupos y seguido por el test de Tukey para comparar las medias de cada uno de los dos grupos. Los datos se consideraron significativamente diferentes si se.
Menos de 0,05 consentimiento Ética y permisos
La saliva humana se recogieron el valor p
de 2 colas de nueve voluntarios sanos después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. La aprobación ética se obtuvo del Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kagawa (número de referencia, 27-074).
consentimiento para publicar un comentario El autores obtuvieron el consentimiento de todos los participantes para publicar los datos del análisis bajo enlazable de anonimato.
resultados
efecto inhibidor de L-arginina en S. mutans
la formación de biopelículas GS5
se realizaron ensayos de biofilm para determinar el efecto de L-arginina en S. mutans
GS5 biopelícula formación en condiciones de pH que varían de ácido a neutro (pH3.5-7.0). En primer lugar, S. mutans
cultura GS5 se añadió a 2 x BHI que contiene 2% de sacarosa en 2% (v /v). La suspensión bacteriana (0,1 ml) y luego se mezcló con solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5) o 0,5 M de cada uno de solución de L-arginina ajustó su pH (3,5 a 7,0) y se aplicaron a los pocillos. Después del cultivo anaeróbico 24-h, S. mutans
biofilm se cuantificó mediante tinción con cristal violeta. Como se muestra en la Fig. 1, las soluciones de L-arginina (concentración final, 0,25 M) que se ajustaron a pH 3,5, inhibió S. mutans
biofilm después de 24 h de cultivo en comparación con solución salina o tampón de control (citrato 5 mM, pH 3,5) . El efecto de la L-arginina era dependiente del pH, en el que sólo las soluciones de L-arginina ajustaron a pH 3,5 la formación de biopelículas, inhibió. Además, esta inhibición era poco probable que sea debido a un efecto bactericida, ya que 10 mM de tampón de citrato (pH 3,5) y L-arginina se ajustó a pH 3,5 redujeron S. mutans
número GS5 sólo 0,61 ± 0,30 y 0,49 ± 0,22 log
10 CFU /ml durante un contacto 5-min, respectivamente, y la densidad óptica de los S. mutans
de cultivo después de 24 h de incubación no fue diferente entre las muestras con y sin solución de L-arginina 0,25 M (pH 3,5). Estos resultados sugieren que ácido L-arginina desestabilizó estructura del biofilm y /o se reduce la producción de glucano insoluble de S. mutans
. Basándose en estos resultados, las soluciones de L-arginina ácidas, ajustada a pH 3,5 se utilizaron para análisis posteriores. Higo. 1 la inhibición dependiente del pH de S. mutans
la formación de biopelículas GS5 por L-arginina. S. mutans diluidas
culturas GS5 y reactivos de ensayo se mezclaron a 1: 1. Después las mezclas se cultivaron anaeróbicamente a 37 ° C durante 24 h, S. mutans
biofilms que se habían formado en el fondo de los pocillos se cuantificaron por tinción con violeta cristal. Saline (S), 10 mM pH 3,5 de citrato (CA3.5) o solución de L-arginina 0,5 M ajustado con tampón citrato 10 mM a un pH entre 3,5 y 7,0 (indicado como LA3.5-LA7.0) se utilizaron como reactivos de ensayo. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * Significativamente diferente de la solución salina (p
& lt; 0,05), ** Significativamente diferente de citrato 10 mM (pH 3,5) (p
& lt; 0,05)
efecto de limpieza de solución de ácido L-amino en orales biopelícula
biopelícula saliva derivado se preparó en discos de plástico usando las muestras de saliva de adultos sanos (# 1, # 2 y # 3). Después de que el biofilm se lavó con citrato 10 mM (pH 3,5), 0,5 M de cada uno de L-arginina, L-glicina, L-lisina o soluciones de L-alanina, que se ajustó el pH a 3,5. Como se muestra en la Fig. 2a, las manchas de cristal violeta en los discos se lavaron con L-arginina eran menores que los lavados con tampón de citrato o los otros tres los L-aminoácidos ensayados. Los colorantes violeta de cristal se eluyeron con ácido acético, y la absorbancia a 550 nm de la elución se midió para cuantificar los biofilms de retención en los discos. Como se muestra en la Fig. 2b, L-arginina reduce biofilm salival humana más eficaz que otros los L-aminoácidos, aunque no se observó diferencia significativa. Higo. 2 efecto de limpieza de L-arginina en el biofilm salival formada en discos de plástico. una coloración violeta cristal de la biopelícula de retención sobre los discos después del lavado. La biopelícula formada en el disco de plástico se lavó durante 30 min con tampón de 10 mM de citrato (pH 3,5; Cit), 0.5 M cada uno de L-arginina (Arg), L-glicina (Gly), L-lisina (Lys) o L-alanina (Ala), que se ajustó el pH a 3,5 con 10 mM de tampón de citrato. b La cuantificación de la retención salival biofilm sobre los discos. El violeta cristal se eluyó de los discos mostrados en el panel A con ácido acético y su absorbancia a 550 nm se midió. Los valores relativos a la muestra de citrato se muestran
efecto desestabilizador de ácido L-arginina en las biopelículas orales
A fin de evaluar el efecto de desestabilización de ácido L-arginina (pH 3,5) en el biofilm oral humana, las muestras de saliva se recogieron de cuatro voluntarios sanos (# 4, # 5, # 6, y # 7). análisis de secuenciación del 16S rDNA basado en Illumina mostró que estas muestras contenían el microbioma consistentes con varios informes anteriores sobre la saliva humana [35, 36]: Streptococcus gratis (, 23,2-44,5% tasa de abundancia más predominante en este estudio), Prevotella
, Neisseria
, veillonellas
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella, España y Actinomyces
se detecta comúnmente tan abundantes géneros (ver archivos adicionales 1, 2 y 3 para un resumen detallado de las tasas de abundancia).
se añadieron las muestras de saliva a los pocillos que contienen BHI y sacarosa al 1% (v /v 20%), y se formaron biopelículas siguiente incubación anaerobia durante 72 h. Curiosamente, las características de biopelícula diferían entre las muestras, en el que los biofilms salivales de dos individuos (# 5 y # 6) firmemente unidos a los pocillos (definidos como biofilms sólidas), mientras que los otros dos (# 4 y # 7) eran fácilmente adosadas por lavado con solución salina (definido como biofilms frágiles) (Fig. 3a). Lavar los pocillos con ácido L-arginina más biofilms separados de # 5 y # 6 que la solución salina hicieron (p
& lt; 0,05), mientras que el citrato 10 mM (pH 3,5) por sí sola fue similar a la de la solución salina. Higo. 3 La desestabilización de las biopelículas orales de ácido L-arginina. La limpieza de efecto de la solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5) o L-arginina en citrato 10 mM (pH 3,5) en biofilms establecidos utilizando la saliva humana solo (a) o saliva humana mezclada con S. mutans
GS5 (1 se examinó% v /v) (b). Los biofilms saliva humanos derivados se prepararon de micropocillos. Después de lavar con los reactivos de prueba, las biopelículas sostenidos se tiñeron con cristal violeta. Los números indican los identificadores de los voluntarios. Solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5) y ácido L-arginina (pH 3,5) se indican con columnas de color azul, rojo y verde, respectivamente. Los datos se expresan como media ± desviación estándar, y el análisis estadístico se realizó por ANOVA seguido por el test de Tukey. El p-valores
inferior a 0,05 se consideró significativo
Para simular el biofilm cariogénico, S. mutans
GS5 se añadió a 1% del volumen final por pocillo. La adición de S. mutans
GS5 cambió la estructura del biofilm y aumentó el apego a los pocillos, especialmente en muestras de saliva que se formaron biopelículas frágiles (Fig. 3 y la archivo adicional 4). Al igual que en el ensayo de biofilm limpieza sin S. mutans
GS5, ácido L-arginina individual significativamente más biofilm derivado de la saliva de # 5 y # 6 (Fig. 3a). Por el contrario, biofilm que contiene la cepa GS5 se hizo sensible a lavado con citrato 10 mM (pH 3,5) (Fig. 3b). Mientras tanto, ácido L-arginina (pH 3,5) y citrato 10 mM (pH 3,5) también tendían a reducir las biopelículas formadas por frágiles muestras de saliva de formación de biofilm (# 4 y # 6) y S. mutans
GS5, pero no se observaron diferencias significativas.
estructura del biofilm después de lavar con ácido L-arginina
para comparar además la saliva humana (# 4 a # 7) -derivado del biofilm después del lavado con solución salina, citrato (pH 3,5), o se realizó ácido L-arginina (pH 3,5), microscopía electrónica de barrido (SEM). Biofilm se preparó sobre un disco de plástico utilizando cada una de las muestras de saliva y se lavó con los tres soluciones de ensayo (solución salina, 10 mM pH 3,5 citrato, o 0,5 M pH 3,5 L-arginina). La zona de la biopelícula de retención después del lavado se cuantificó en cinco campos de SEM seleccionados al azar por el software Photoshop CS6. Como se muestra en la Fig. 4, la masa de biopelículas se redujo en el mayor grado por ácido L-arginina (pH 3,5). Para las muestras lavadas con solución salina y citrato 10 mM (pH 3,5), de espesor objetos, estera-como se retuvieron después del lavado, mientras que ácido L-arginina elimina la mayoría de estas estructuras (archivo adicional 5). Higo. 4 La cuantificación de biofilm oral, sostenida después de la limpieza. biofilms orales se forman en discos de plástico de cultivo anaeróbico en caldo BHI que contienen sacarosa (1%) y la saliva humana (10%). Después de un cultivo de 72 h a 37 ° C, los discos se lavaron con 1 ml de PBS (pH 7,4). Los discos se lavaron adicionalmente con 1 ml de solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5) o 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) durante 30 min antes de la fijación con glutaraldehído al 2% en tampón cacodilato 0,2 M para la microscopía electrónica de barrido. áreas Biofilm se midieron utilizando una herramienta de selección automática basada en el color en Photoshop CS6, y se calcularon las proporciones en relación con el campo de observación total. Se examinaron al menos cinco campos seleccionados al azar. Los datos se expresan como media ± desviación estándar, y el análisis estadístico se realizó por ANOVA seguido por el test de Tukey. El p-valores
inferior a 0,05 se consideraron significativos
grupos de bacterias orales susceptibles a enjuagar con ácido L-arginina
análisis de secuenciación del 16S rDNA basado en la iluminación se realizó para identificar los grupos de bacterias que eran sensibles a las enjuague con ácido L-arginina. Hemos probado biopelícula salival a partir de muestras # 4 y # 5 para representar las biopelículas sólidos y frágiles, respectivamente. biofilms salivales se prepararon en el disco de plástico y se lavaron con solución salina, citrato 10 mM (pH 3,5) o 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) durante 30 min. Los biofilms unifamiliares en las soluciones de ensayo se recogieron por centrifugación (fracción de lavado-out). Las biopelículas de retención en los discos se separaron por tratamiento con ultrasonidos y se recogieron por centrifugación (fracción de retención). Los ADN fueron purificados de ambas facciones. Como se muestra en la Fig. 5, Streptococcus y Lactobacillus
compartida 86,8-98,3% de las poblaciones de biopelícula en tanto retenidas y fracciones descoloridas. biopelícula sólido (# 5) contenía más Lactobacillus
de biopelícula frágil (# 4). Curiosamente, el Streptococcus
proporción en la fracción de lavado de salida con tampón de citrato (10 mM, pH 3,5) fue mayor que en aquellos con solución salina o 0.5 M L-arginina (pH 3,5). Por otro lado, Lactobacillus
tendía a retener sobre los discos después de lavar con citrato (pH 3,5). Estos resultados indican que el citrato (pH 3,5) preferentemente lavada Streptococcus
de ambos tipos de biopelículas. Por otra parte, el perfil microbiano de las fracciones de lavado tratados con ácido L-arginina era similar a la observada para la solución salina, lo que indica que ácido L-arginina (pH 3,5) Independiente de forma no específica las bacterias de las biopelículas formadas en discos de plástico. Higo. 5 El análisis comparativo de la microbiota fracciones sostenidas y desteñidos con ácido L-arginina. Frágil (de # 4) y biofilms sólidos (# 5) se forma sobre discos de plástico, que luego se lavaron con solución salina (S), 10 mM de citrato de pH 3,5 tampón (CA), o ácido L-arginina (LA). La composición microbiana de la fracción restante de los discos y la fracción descolorida se compararon mediante análisis de secuenciación del 16S rDNA basado en Illumina
Discusión
arginina deiminasa en las bacterias orales metaboliza L-arginina que a su vez eleva el pH de la ambiente oral, que puede suprimir la formación de caries dentales. Por lo tanto, la L-arginina se ha explorado como un suplemento potencial de higiene oral [37]. Además, se ha informado de altas concentraciones de L-arginina (5,0 a 10,0%) para inhibir la formación de biopelículas de S. mutans cariogénicos
[26]. En este estudio, hemos explorado el efecto de limpieza de la L-arginina en las biopelículas orales para demostrar los beneficios de este aminoácido básico para el cuidado de la higiene oral. inhibición L-arginina de S. mutans
la formación de biopelículas era de hecho dependiente del pH (Fig. 1), porque entre el rango de valores de pH ensayados (3,5 a 7,0), reducciones significativas en la formación de biopelículas se observados solo a pH 3,5 . Por lo tanto, hemos probado concentraciones relativamente altas (0,5 M) de ácido L-arginina (pH 3,5) en este estudio, y demostramos la eficacia de esta solución en la eliminación de biofilms orales ya establecidas. Debido a que la L-arginina mejora la solubilidad de la proteína al afectar las interacciones proteína-proteína y este efecto es evidente en condiciones ácidas [38, 39], el efecto de limpieza en los biofilms orales de ácido L-arginina que se observó aquí está probablemente derivado de una desestabilización de las bacterias agregación.
Durante el transcurso de este estudio, Kolderman et al. informaron el efecto desestabilizador de la L-arginina en biopelículas formadas por la saliva agrupado de seis voluntarios sanos [40]. Este estudio informó que el pH neutro L-arginina (0,1 a 0,5 M) desestabilizó efectivamente biofilm oral. En este documento, hemos demostrado que la L-arginina pH ácido no sólo desestabilizó biofilm oral humana, sino también inhibe la formación de biopelículas por S. mutans
, aunque es difícil comparar los resultados de ambos estudios debido a diferencias en el sistema de ensayo utilizado biofilm: la Kolderman et al. estudiar filtrada, saliva libre de células se usa como un nutriente, mientras que aquí se utilizó BHI que contenía 1% de sacarosa como medio de apoyo para la formación de biopelículas. La sacarosa es un azúcar cariogénicos que mejora el volumen y la solidez de biofilm oral. El efecto de la sacarosa en la formación de biofilm oral en vitro se observó claramente en este estudio, en el que la sacarosa añadido aparentemente altera la masa biofilm y su composición con un marcado aumento en el número de bacterias en forma de varilla (archivo adicional 4). Teniendo en cuenta que Streptococcus y Lactobacillus
fueron los componentes predominantes de los biofilms orales prueba en este estudio (Fig. 5), estas bacterias en forma de barra era probable lactobaclli. Los resultados de estos biofilms sólidas formadas en medios ricos pueden ser difíciles de eliminar por neutral L-arginina, y de las condiciones ácidas pueden facilitar la desestabilización de los agregados por la L-arginina. De hecho, Ikeda et al. reveló que el efecto antiviral de 0,7 M de L-arginina en el tipo de virus de la gripe A fue más evidente cuando el pH estaba por debajo de pH 5,0 [41].
Seleccionamos tampón de citrato para ajustar el pH de la solución de L-arginina porque este ácido tiene actividad quelante. El efecto inhibidor de los agentes quelantes en la biopelícula microbiana es bien conocido, como lo demuestra el uso frecuente de EDTA o citrato en soluciones de bloqueo del catéter. Co-agregación de S. mutans y Lactobacillus
ha sido informado de que dependiente de calcio [42], mientras que los vínculos apretados dentro de S. mutans
bacterias en Streptococcus
biofilms mediadas por las lectinas de unión a glucano son
