Abstract
Antecedentes
proteína morfogenética ósea recombinante dos (rhBMP2) se ha utilizado para una variedad de aplicaciones clínicas en cirugía ortopédica y procedimientos dentales . A pesar de su uso generalizado, se han planteado preocupaciones con respecto a su vida media corta y transitoria bioactividad in vivo. reciente investigación dirigido a desarrollar rhBMP2 sintetizado a partir de una cadena de polipéptido más corto (108 aminoácidos) se ha llevado a cabo.
Métodos México La osteopromotive propiedades de BMP2 fueron investigados en el comportamiento celular. Cinco concentraciones de rhBMP2_108 incluyendo 10, 50, 100, 200 y 500 ng /ml se compararon con un rhBMP2 disponible comercialmente (100 ng /ml). Cada una de las concentraciones de trabajo de rhBMP2_108 se investigaron sobre los osteoblastos MC3T3-E1 por su capacidad para inducir el reclutamiento de osteoblastos, la proliferación y la diferenciación según la evaluación de la fosfatasa tinción alcalina (ALP), tinción con rojo de alizarina, y PCR en tiempo real para los genes que codifican ALP, osteocalcina (OCN), colágeno-1 (Col-1) y Runx2.
resultados
Los resultados demuestran que todas las concentraciones de rhBMP2_108 mejoraron significativamente el reclutamiento de células y la proliferación de osteoblastos a los 5 días después de la siembra. Por otra parte, rhBMP2_108 tenía los efectos más pronunciados sobre la diferenciación de los osteoblastos. Se encontró que rhBMP2_108 tenía más de un aumento significativo de cuatro veces en la actividad de ALP a los siete y 14 días post-siembra y las concentraciones que varían de 50 a 200 ng /ml demostró los efectos más pronunciados. El análisis de PCR en tiempo real para los genes que codifican ALP, OCN, COL-1 y Runx2 aumentos dependientes de la dosis confirmados aún más a los 14 días después de la siembra. Por otra parte, la alizarina tinción con rojo demostró un aumento dependiente de la concentración en la tinción a los 14 días.
Conclusión
Los resultados del presente estudio demuestran que esta cadena de polipéptido más corto de rhBMP2_108 es igual de bioactivo como disponibles comercialmente rhBMP2 para el reclutamiento de células progenitoras células de facilitar su diferenciación hacia el linaje de osteoblastos. Futuro en el estudio in vivo son necesarios para investigar su bioactividad.
Palabras clave
BMP2 osteoinductivo osteoinducción osteoblastos diferenciación regeneración guiada del hueso Antecedentes Francia El uso de factores de crecimiento y biomateriales con propiedades inductoras de hueso ha jugado un papel fundamental en las opciones de tratamiento para pacientes que sufren de una variedad de defectos óseos causados por cualquiera de fractura o enfermedad [1-3]. La osteoporosis, una enfermedad caracterizada por una baja densidad mineral y la posterior fragilidad [4] ha llegado ahora a un estimado de 200 millones de personas en todo el mundo, con el 80% son mujeres post-menopáusicas [5-7]. El aumento significativo de las enfermedades metabólicas del hueso en combinación con lesiones traumáticas causadas por accidentes deportivos, accidentes automovilísticos y otras fracturas óseas relacionadas requiere agentes capaces de inducir la aceleración de la regeneración ósea a menudo en situaciones comprometidas como fracturas relacionadas con osteoporosis [8-11].
Un factor de crecimiento que ha sido ampliamente utilizado con aprobación de la FDA es la de las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP) [12-14]. BMPs se extrajeron inicialmente a partir de la matriz ósea desmineralizada y se reveló que estas proteínas de bajo peso molecular demostraron la capacidad para formar hueso ectópico en sitios extra-esquelético en animales [15, 16]. Desde entonces, BMPs han sido capaces de regenerar una multitud de defectos óseos y se han demostrado mejorar el reclutamiento de células, la proliferación y diferenciación de las células mesenquimales, y la aceleración de su diferenciación hacia la formación de hueso osteoblastos [17]. A pesar de las ventajas clínicas de proteínas recombinantes, han surgido preocupaciones con respecto a sus bioactividad transitoria, inestabilidad de la proteína, las tasas de disolución rápida y vidas medias cortas [18]. Por estas razones, el uso de rhBMPs se administra típicamente en dosis altas suprafisiológicas que llevan el riesgo de posibles efectos secundarios asociados con su uso [19]. Además, otros factores que podrían conducir a una reducida bioactividad in vivo incluyen el papel de los antagonistas y su especificidad para diferentes BMPs (noggin, chordin, dan), el papel del organismo huésped para la expresión (E. coli vs. CHO) y la las diferencias en los patrones de glicosilación asociados que podrían conducir a diferencias en la biodisponibilidad y la estabilidad [20-22].
recientemente el desarrollo de una proteína recombinante novedoso fabricado a partir de una cadena de polipéptido más corto de BMP2 se ha realizado con el objetivo de mejorar la estabilidad de proteínas en vivo. Esta cadena de proteína más corta es la hipótesis de facilitar el plegamiento de proteínas, aumentando de esa forma la bioactividad de rhBMP2 mediante el aumento de la vida media de la proteína [23]. Sin embargo, antes de la prueba animal, una caracterización completa de esta secuencia de aminoácidos más corta se investigó en el comportamiento de células in vitro. MC3T3-E1 pre-osteoblastos se investigaron por su respuesta a cinco concentraciones diferentes de rhBMP2_108 incluyendo 10, 50, 100, 200 y 500 ng /ml y comparación con el control disponible comercialmente rhBMP2 a una concentración de 100 ng /ml (amp I +; D systems ). rhBMP2_108 se ensayó para determinar su capacidad para inducir el reclutamiento de células, la proliferación celular, la actividad de la fosfatasa alcalina, la alizarina tinción roja, así como los niveles de mRNA de los genes que codifican la fosfatasa alcalina, osteocalcina, colágeno uno y Runx2 según la evaluación de PCR en tiempo real.
Métodos
rhBMP2_108 secuencia de aminoácidos
rhBMP2_108 fue proporcionado amablemente por la compañía biotecnológica Jiuyuan (Hangzhou, china). La secuencia de aminoácidos acortada se fabricó como sigue: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR para una cadena de proteína de 108 aminoácidos. El BMP2 disponible comercialmente se adquirió de amp I +;. D Systems (Minneapolis, USA)
Preparación de BMP2
De acuerdo con la secuencia de aminoácidos, la expresión intracelular de rhBMP2_108 en E. coli se construyó para la producción a granel de rhBMP2_108 como anteriormente se describe [24]. Brevemente, la secuencia de BMP2 fue diseñado de acuerdo con su secuencia de aminoácidos, y después se transcribió de forma inversa con transcriptasa inversa (Gibco BRL, NY, EE.UU.) como se describe anteriormente [24]. reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para amplificar el ADNc que codifica la proteína rhBMP2_108 secuencia de aminoácidos más corta. Después, este ADNc rhBMP2_108 se subclonó usando un vector pRSET (A) (Invitrogen, Reino Unido) para producir el pRSET (A) /vector de expresión rhBMP2_108. Entonces, pRSET (A) /rhBMP2_108 se utilizó además para transformar la cepa E. coli BL21 (DE3). A continuación, se utilizó un biorreactor para producir el cultivo de alta densidad celular de E. coli. Brevemente, E. coli transformada se cultivó en un fermentador de 5 L, con 3 L de medio definido (cultivo por lotes; extracto de levadura 1 g /L, peptona 2 g /L) se inoculó con el precultivo (10% del lote volumen de cultivo). El cultivo se realizó con agitación a 250 rpm durante 48 horas a 30 ° C, incluyendo la adición de un medio nutriente (glucosa 33,3 g /L, peptona 10 g /L, extracto de levadura 5 g /L, MgSO
41 g /L, FeSO 48,0 g /L, CaCl 20.048 g /L, ZnSO 40.0176 g /L, CuSO 40.008 g /L). Francia El biomasa cultivada se recoge después por la trituración dos veces las células en una prensa francesa y después se centrifugó. El sedimento se resuspendió en 25 mg de peso húmedo /ml en un tampón de suspensión (20 mMTris-HCl [pH 8,5], 0,5 mMEDTA, 2% [v /v] Triton X-100). Los cuerpos de inclusión (pellets) se resuspendieron en un tampón de solubilización (6Mguanidine-HCl, 0,1 M Tris-HCl [pH 8,5], 0,1 M DTT, 1 mM EDTA) y a partir de entonces se incubaron con agitación constante a temperatura ambiente durante la noche. partículas insolubles se retiraron a continuación de la suspensión por centrifugación.
Después se usó una columna de 6 Fast Flow Heparin Sepharose para purificar el rhBMP2_108 activo (dímero). Un gradiente de NaCl continua (0,1 a 1,5 M) para eluir la proteína unida. Después, se utilizó un gradiente de NaCl escalonado (0,15 M, 0,3 M y 0,5 M) para eluir y separar la proteína rhBMP2_108 activo. A partir de entonces rhBMP2_108 polvo se congeló a -20 ° C. Cuando se usa, el ácido acético al 0,1% se utilizó para disolver el polvo BMP2. Control de rhBMP2 fue adquirido de R & amp; D Systems (Minneapolis, EE.UU.) derivadas de células CHO.
ensayo de migración bidimensional
línea de células pre-osteoblastos MC3T3-E1 se utilizó para este estudio. No hay muestras humanas o animales fueron utilizados y por lo tanto no se requería el consentimiento ético. El ensayo de migración de células se realizó con una cámara Transwell usando una placa de 24 pocillos y de policarbonato Transwell filtros (Costar, Corning, Acton, MA) con un tamaño de poros de 8 micras tal como se describe anteriormente [25]. 10 4 células MC3T3-E1 en 50 l de DMEM se sembraron en el compartimiento superior. rhBMP2_108 a concentraciones de 0, 10, 50, 100, 200 y 500 ml rhBMP2 y control /ng a 100 ng /ml se sembraron en el compartimiento inferior. Las células se dejaron migrar durante 24 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 atmósfera. El filtro fue luego eliminado, las células fueron fijadas en 4% de formaldehído durante 20 min y se lavó en PBS, después de lavados, los filtros se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con Methylrosanilnium solución de cloruro de (Wuhan Google biotecnología limitado G1014 de la empresa), a continuación, los filtros se se lavó con PBS durante 10 min. Las muestras fueron examinadas por microscopía. Las células no migradas en la parte superior se eliminaron por lavado del filtro con PBS frío y raspando con una goma de limpiaparabrisas. Las células migradas restantes en el lado inferior del filtro se contaron en nueve campos al azar por filtro (× 100 aumentos). Todas las muestras se realizaron por triplicado con 3 experimentos independientes realizados.
Ensayo de proliferación
Para investigar el efecto de rhBMP2_108 sobre la proliferación de MC3T3-E1, CCK-8 de ensayo para cada grupo se realizó tal como se describe anteriormente [26]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 10 3 células /pocillo. En los puntos de tiempo 1, 3 y 5 días, el ensayo de CCK-8 se llevó a cabo mediante la adición de 10 l de la solución de CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Japón) a cada pocillo e incubando durante 1,5 h según el protocolo del fabricante. La absorbancia se midió a λ = 450 nm en un lector de placas. Los resultados se demostraron como la absorbancia de cada pocillo experimental menos el valor de la densidad óptica de los pocillos del blanco. Todas las muestras se repitieron por triplicado con tres experimentos independientes.
Actividad de fosfatasa alcalina
se analizó la actividad de fosfatasa alcalina colorimétricamente utilizando el kit de ensayo de fosfatasa alcalina (Nanjing Jiancheng Bioingeniería Insitute) utilizando una densidad de siembra inicial de 50'000 células por 24 así plato como se describe anteriormente [27, 28]. En el punto de siete y 14 días de tiempo, las células se lavaron tres veces con PBS y se solubilizaron en 0.1% de Triton X-100 (tamponar en 0,1 mol /L de PBS, pH 7,3) a 4 ° C durante 1 h. Después de la sonicación y la centrifugación, se determinó la actividad de ALP en el sobrenadante colorimétricamente usando lecturas OD405 /OD562. La proteína total se cuantificó mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific Inc.). La actividad de la ALP se normalizó a la proteína total. Las muestras se analizaron por triplicado con tres experimentos independientes realizados.
PCR en tiempo real
células MC3T3-E1 se sembraron a una densidad de 2 × 10 5 y se cultivaron durante 14 días como se describe anteriormente [26, 28 , 29]. Los efectos de rhBMP2_108 a diversas concentraciones se investigaron en cuatro expresión de genes relacionados osteogénica, incluyendo la fosfatasa alcalina (ALP), colágeno I (COL I), relacionados con runt-factor de transcripción de dos (Runx 2) y la osteocalcina (OCN). ARN total fue extraído a partir de células MC3T3-E1 de reactivo Trizol (TriPure Aislamiento de reactivos, Roche Applied Science, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración y la calidad de las muestras de ARN total se analizó por Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.). El ADN complementario se sintetizó a partir de 2 g de ARN total usando RevertAidTm Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) siguiendo el protocolo del fabricante. RT-qPCR se realizó en reacciones de 20 l que contenía 10 l SYBR Green Master Mix (Roche Applied Science, Alemania), 0,6 l (10 mM) de cada avance y retroceso de cebadores para cada gen de interés, 2 l de molde de ADNc y 6,8 l agua. Las secuencias de los cebadores (que se muestran en la Tabla 1) se han diseñado específicamente según la referencia. Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH), un gen de referencia, se utilizó como control. La reacción se analizó usando un sistema ABI Prism 7000 de detección de secuencias (Applied Biosystems), y la amplificación de ejecución PCR durante 40 ciclos. Para validar la amplificación del amplicón específico sin contaminación de ADN genómico, se realizó análisis de la curva de fusión y el single ápice apareció alrededor de la temperatura de recocido. los niveles de expresión relativa de cada gen deseado se normalizaron contra el valor Ct de GAPDH y se determinó mediante el método de Ct delta. Todas las muestras se determinaron por triplicado para tres studies.Table 1 Primer secuencias independientes para marcadores de diferenciación de osteoblastos
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
RUNX2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
RUNX2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
alizarina cuantificación rojo de alizarina
tinción con rojo se realizó para determinar la presencia de mineralización de la matriz extracelular después de 14 días. células MC3T3-E1 se sembraron a una densidad de 50.000 células por placa de cultivo de 24 pocillo que contiene las diversas concentraciones de rhBMP2_108. Después de 14 días, las células se fijaron en 96% de etanol durante 15 min y se tiñeron con una solución de 2% de rojo de alizarina en agua (pH 4,2) a temperatura ambiente durante 1 h y se visualizaron bajo microscopio de luz. A partir de entonces, la cuantificación rojo de alizarina se disolvió con 200 l de cloruro de cetilpiridinio al 1% (disuelto con agua destilada dos veces) a temperatura ambiente durante 4 h. A continuación, una solución de 100 l se transfirió a placas de 96 pocillos a texto Análisis estadístico OD 560.
Todos los análisis de los datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism6.0. La distribución normal de los datos de la muestra se supuso para el estudio actual, por lo que se analizó la prueba paramétrica mediante ANOVA de una vía y estadísticamente significativos los valores de p fueron adoptados como Hotel & lt; 0.05. La media y se analizaron error estándar (SE) usando ANOVA de una vía con una prueba post hoc con el análisis de Tukey.
Resultados
Efecto de rhBMP2_108 en el reclutamiento de células
Con el fin de investigar los efectos de rhBMP2_108 en el reclutamiento de células , una cámara transwell se utilizó a cinco concentraciones diferentes de rhBMP2_108 (Fig. 1). Se encontró que después de un período de 24 h, todas las concentraciones de rhBMP2_108 y rhBMP2 de control eran capaces de aumentar significativamente el reclutamiento de células de las células MC3T3-E1, en comparación con muestras de control. Se observó poca variabilidad entre las muestras demostrando un fuerte potencial para todas las concentraciones de rhBMP2_108 para inducir el reclutamiento de células (Fig. 1). Higo. 1 ensayo de reclutamiento de células demostró que todas las concentraciones de rhBMP2_108 fueron significativamente capaz de mejorar el reclutamiento de células MC3T3-E1, en comparación con muestras de control sin rhBMP2 (Escala bar = 100 m). Todos los experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos independientes (n = 9
). Los datos representan medias +/- SEM. ** Denota todas las muestras significativamente más altos que las muestras de control, p
& lt; 0,01)
Efecto de rhBMP2 sobre la proliferación celular El efecto de
rhBMP2_108 se investigó a cinco concentraciones y controlar rhBMP2 por su capacidad para estimular la proliferación celular in vitro (Fig. 2). Se encontró que las células MC3T3-E1 demostraron muy similar el número de células 1 día después de la siembra con independencia de la concentración de medios de cultivo de células de rhBMP2_108 (Fig. 2). Se observó un ligero aumento en el número de células a los 3 días, sin embargo, no hubo diferencia significativa se observó entre las diversas modalidades de tratamiento (Fig. 2). Por 5 días después de la siembra, se observó un aumento significativo en el número de células para las células MC3T3-E1 con todas las concentraciones de rhBMP2_108 utilizados en este estudio (Fig. 2). Curiosamente, no hay ventajas se pueden encontrar para las concentraciones más altas de rhBMP2_108 en comparación con sus homólogos inferiores (Fig. 2). Higo. 2 El número de células tal como se calcula mediante un ensayo de CCK-8 para las células MC3T3-E1 sembradas a diversas concentraciones de rhBMP2_108 en comparación con el control de plástico de cultivo tisular (Todos los experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos independientes (n = 9
). Datos representa medios +/- SEM # indica muestras de control significativamente más bajos que el resto de modalidades de tratamiento, p
. & lt; 0,05)
Efecto de rhBMP2 sobre la diferenciación celular
RhBMP2_108 se evaluó entonces por su capacidad para acelerar los osteoblastos diferenciación a diversas concentraciones (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). En primer lugar se encontró que rhBMP2_108 fue capaz de aumentar significativamente la actividad de ALP a los siete y 14 días después de la siembra para todas las concentraciones de rhBMP2_108 (Fig. 3). Curiosamente, se observó a los 7 días que la actividad ALP fue significativamente mayor a concentraciones rhBMP2_108 de 50, 100 y 200 ng /ml en comparación con las muestras de control (Fig. 3). A los 14 días, todas las modalidades de tratamiento que recibieron rhBMP2_108 a diversas concentraciones demostraron un aumento de 16 veces marcado en la actividad de ALP en comparación con muestras de control de vacío de rhBMP2_108 (Fig. 3). Higo. actividad ALP 3 fue significativamente mayor a los siete y 14 días después de la siembra para las muestras sembradas con rhBMP2_108 en comparación con el control de plástico de cultivo de tejidos solo (Todos los experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos independientes (n =
9). Los datos representan medias ± . /- SEM * indica diferencia significativa entre 500 ng /ml y 10 ng /ml rhBMP2, p
& lt; 0,05; ** denota significativamente más alta que todas las otras modalidades, p
& lt; 0,05, # indica muestras de control significativamente más bajo que el resto de modalidades de tratamiento, p Restaurant & lt; 0,05) guía Fig. 4 niveles de ARNm de (a) ALP, (b) OCN, (c) COL-1 y (d) Runx2 para las células MC3T3-E1 sembradas a diversas concentraciones de rhBMP2_108 (Todos los experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos independientes (n < . br> = 9) los datos representan medias +/- SEM * indica p
. & lt; 0,05; ** denota significativamente más alta que todas las otras modalidades, p
& lt; 0,05, # indica muestras de control significativamente más bajos que todos otras modalidades de tratamiento, p Restaurant & lt; 0,05)
Fig. 5 Análisis cualitativo de tinción con rojo de alizarina demostró un aumento en la mineralización de las células MC3T3-E1 en concentraciones crecientes de rhBMP2_108 a los 14 días después de la siembra
Fig. 6 Análisis cuantitativo de la tinción con rojo de alizarina. rhBMP2_108 demuestran un aumento dependiente de la concentración en tinción con rojo de alizarina (Todos los experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos independientes (n =
9). Los datos representan medias +/- SEM. * indica diferencias significativas entre los dos grupos, p
& lt; 0,05; ** denota significativamente más alta que todas las otras modalidades, p Restaurant & lt; 0,05, # indica muestras de control significativamente más baja que el resto de modalidades de tratamiento, p Hotel & lt; 0,05)
Luego, las células MC3T3-E1 se evaluaron para los niveles de mRNA por PCR en tiempo real para los genes que codifican ALP, OCN, COL-1 y Runx2 en varias concentraciones de rhBMP2_108 (Fig. 4). Para gen que codifica Runx2, hasta un aumento de pliegue cinco se observó a una concentración de 500 ng /ml en comparación con las muestras de control con un aumento significativo a 100 y 200 ng /ml en comparación con las concentraciones más bajas (Fig. 4a). aumento dependiente de la concentración mismo modo, COL-1 demostró también en la expresión de genes (Fig. 4b). Aquí, sin embargo, sólo hasta un incremento de dos veces se observó en relación con muestras de control (Fig. 4b). Se observó que los niveles de mRNA de ALP fueron más de cinco veces mayor a los 14 días a concentraciones de diez y 50 ng /ml rhBMP2_108 mientras que a una concentración de 100 y 200 ng /ml 20 veces de incremento en la actividad de ALP (Fig. 4c). La mayor concentración de 500 ng /ml demostró un aumento 40 veces en la actividad de ALP en comparación con los medios de cultivo sin rhBMP2 (Fig. 4c). Se observó el cambio más grande veces en los niveles OCN donde un aumento de hasta 300 veces se observó en comparación con su respectivo control sin rhBMP2 (Fig. 4d).
Por último, se utilizó tinción con rojo de alizarina para visualizar la mineralización in vitro (Fig. 5). Se observó que sin rhBMP2, MC3T3-E1 pre-osteoblastos no fueron capaces de generar cualquier mineralización visual según lo observado por tinción con rojo de alizarina (Fig. 5). Los efectos de rhBMP2_108 demostraron un aumento dependiente de la concentración significativa en la tinción con rojo de alizarina a los 14 días después de la siembra (Fig. 6).
Discusión Francia El objetivo del presente estudio fue investigar la bioactividad de un BMP2 recombinante más corto (rhBMP2_108 ) secuencia en el comportamiento de los osteoblastos. El uso de rhBMP2 para tratamientos ortopédicos y dentales se ha utilizado para un número de procedimientos incluyendo fracturas abiertas, cirugías reconstructivas cadera, así como los procedimientos de regeneración ósea guiada en odontología [30-33]. A pesar de la demostración prometedor en vivo los resultados, el uso de factores de crecimiento ha tenido una mezcla de éxito cuando se utilizan para el uso clínico. Algunas de las principales preocupaciones planteadas con respecto a la utilización de los factores de crecimiento es su bioactividad transitoria que se ha sugerido que pudo para estar en el orden de minutos a horas [18].
Hay tres áreas principales de investigación dirigidos a mejorar la bioactividad de factores de crecimiento; 1) la utilización de la terapia génica, 2) mejorar la estabilidad de la proteína o 3) la mejora del sistema de entrega factor de crecimiento. Un método que ha mostrado una promesa temprana para la entrega del factor de crecimiento es el de la terapia génica en el que el uso de vectores virales tales como adenovirus pueden eludir muchas de las limitaciones de la administración de proteínas por exhibir una alta eficiencia de la transducción in vivo con un periodo de expresión relativamente corto [34 -38]. Su principal ventaja es la proteína sobreexpresada se construye dentro de la célula principal organismos y por lo tanto tiene acceso a una multitud de plegado de proteínas capaces de envases con precisión y la entrega de factores de crecimiento a sus tejidos circundantes [25, 39, 40]. A pesar de los avances realizados en este campo de investigación, el uso de la terapia génica está siendo prohibido por la FDA por lo que su futuro uso clínico en el momento en que un enfoque optimista con el futuro hay un calendario conocido por su uso eventual. Por otra parte, las recientes estrategias que utilizan péptidos sintéticos que imitan PNM2 cortos han demostrado que facilita la regeneración ósea [41-44], sin embargo la falta de informes clínicos que utilizan este tipo de estrategias que aún falta.
Por lo tanto, se convierte en vital para encontrar métodos alternativos que pueden se considerará adecuado para mejoras en el factor de crecimiento bioactividad. En el presente estudio, una versión recombinante novela de BMP2 (rhBMP2_108) con una secuencia de aminoácidos más corta. Antes de las pruebas con animales, sin embargo, las pruebas in vitro se llevó a cabo sobre la actividad celular. Fue encontrado en el presente estudio que r rhBMP2_108 era capaz de dirigirse en primer lugar, el reclutamiento de células progenitoras, favoreciendo temprano y rápido reclutamiento de las células dentro de las 24 h (Fig. 1). El homing de las células progenitoras y células madre es una de las etapas iniciales clave en la aparición temprana de la reparación de fracturas y es un componente necesario de la cicatrización de heridas de óseas-defectos. Como tal, la capacidad para rhBMP2_108 para acelerar la velocidad y el número de células progenitoras a los sitios de defectos es crucial para la reparación ósea.
Aunque los efectos como se ve en el presente estudio demostraron que rhBMP2_108 fue significativamente capaz de inducir la proliferación de células, se no se observó de una manera dependiente de la concentración. Esto puede ser debido al hecho de que las células sometidas a diferenciación de las células no son propensos a proliferar de forma simultánea. Si bien se encontraron observaciones dependientes no mucho de concentración para el reclutamiento o la proliferación celular, no se encontraron diferencias significativas para la diferenciación de los osteoblastos en respuesta a rhBMP2_108. Se observó que durante un período de cuatro veces de incremento en la actividad de ALP se detectaron con rhBMP2_108 y aumentos dependientes de la concentración adicional de tinción con rojo de alizarina validados nuestra hipótesis de que rhBMP2_108 actúa principalmente mediante la estimulación de la diferenciación de osteoblastos. También se observó que no se observó un aumento significativo en los niveles de mRNA de ALP de una manera dependiente de la concentración. Curiosamente OCN, un marcador de diferenciación tarde para osteoblastos se upregulated aproximadamente 300 veces en comparación con las muestras de control (Fig. 4b). Este hallazgo probable significa que los pre-osteoblastos MC3T3-E1 sembraron en pocillos de control sin rhBMP2 probable permaneció células progenitoras y no diferenció hacia el linaje de osteoblastos a lo largo de estos experimentos. Esto es aún más evidente por el hecho de que las muestras sin rhBMP2 no mostraron potencial de mineralización en los experimentos de rojo de alizarina (Fig. 5).
Aunque los resultados de este estudio confirman los efectos de esta secuencia de aminoácidos más corta de rhBMP2_108 en la célula actividad, sigue siendo necesaria mucha investigación con el fin de validar estos resultados en un modelo animal antes de la prueba clínica. Queda prácticamente desconocido si la actividad de la proteína se verá afectada en vivo por la secuencia de aminoácidos acortada y mucho la investigación futura investigar esta relación tanto con respecto a la proteína de duración media-vida, así como sus posteriores efectos sobre la formación de hueso deben ser cuidadosamente evaluados. Además, su comparación con líder rhBMP2 actualmente disponibles en el mercado con la aprobación de la FDA también es necesario para proporcionar una mejor comprensión de los efectos de la longitud aminoácidos de la proteína sobre la bioactividad de las proteínas recombinantes.
Conclusión
Los resultados del presente estudio demostrar que una secuencia de aminoácidos más corta de BMP2 recombinante (rhBMP2_108) retiene propiedades bioactivas de BMP2 en comparación con disponible comercialmente rhBMP2 in vitro. Se demostró que rhBMP2_108 fue capaz de estimular el reclutamiento de células rápida de MC3T3-E1 pre-osteoblastos y apoyar su diferenciación hacia el linaje de osteoblastos de una manera dependiente de la concentración. Futuras investigaciones en vivo analizar el uso de esta secuencia de aminoácidos de rhBMP2_108 es ahora necesario en los defectos óseos de tamaño crítico. Por otra parte, la investigación en el sistema de administración óptima este factor de crecimiento son necesarias para mejorar potencialmente aún más su bioactividad para uso clínico
abreviaciones
rhBMP2:. Proteína morfogenética ósea recombinante
2
rhBMP2_108: cadena polypetitde
corta de 108 aminoácidos de las proteínas morfogenéticas óseas recombinante dos
ALP:
fosfatasa alcalina
OCN:
osteocalcina
COL-1: 1
colágeno
Runx2:
runt- relacionados con el factor de transcripción de dos
GAPDH:
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
FDA: buena comida y la administración del fármaco
CHO:
ovario de hámster chino
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PBS :
solución tamponada de fosfato
HCl: ácido clorhídrico
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
NaCl:
cloruro de sodio
DMEM:
medio eagle modificado por Dulbecco
BCA:
ácido bicinconınico
OD:
pptical densidad
SE:
error estándar
Declaraciones
Agradecimientos
Este proyecto fue apoyado por el Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (NCET-11-0414), excelente Fundación Juvenil de Hubei y los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81271108). Artículo
abierto AccessThis se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento 4.0 Licencia Internacional (http:. //creativecommons org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre y cuando se dé crédito apropiado al autor (s) original y la fuente, proporcionan un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http:. //Creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
de la competencia.
