Resumen Antecedentes
Porphyromonas gingivalis
ha sido implicado como un patógeno importante en el desarrollo y progresión de la periodontitis crónica. P. gingivalis
la formación de biopelículas en la grieta subgingival juega un papel importante en la capacidad de la bacteria para tolerar las señales de estrés fuera de la membrana citoplásmica. Algunas bacterias utilizan una subfamilia distinta de factores sigma para regular sus funciones extracytoplasmic (la subfamilia ECF). El objetivo de este estudio fue determinar si la P. gingivalis
factores sigma ECF afectan P. gingivalis
la formación de biopelículas.
Métodos
Para dilucidar el papel de los factores sigma ECF en P. gingivalis
, se construyeron mutantes cromosómicos que llevan una interrupción de cada gen del factor codifica sigma ECF. curvas de crecimiento de bacterias se midió mediante la determinación de la turbidez de cultivos bacterianos. La cantidad de biofilm que crecen en placas se evaluó por tinción con cristal violeta.
Resultados
La comparación de las curvas de crecimiento de tipo salvaje P. gingivalis
cepa 33277 y los mutantes ECF indicó que la tasa de crecimiento de los mutantes fue ligeramente más baja que la de la cepa de tipo salvaje. Los mutantes PGN_0274- y PGN_1740-defectuosos habían aumentado la formación de biopelículas en comparación con la de tipo salvaje (p
& lt; 0,001); Sin embargo, los otros mutantes del factor sigma ECF o los complementa las cepas no mejoraron la formación de biopelículas.
Conclusión
Estos resultados sugieren que PGN_0274 y PGN_1740 juegan un papel clave en la formación de biopelículas de P. gingivalis
.
Palabras clave
extracitoplásmico factor de la función sigma gingivalis Biofilm Porphyromonas
material complementario enfermedad periodontal Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-15-4) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes México la bacteria anaeróbica Porphyromonas gingivalis Gram-negativas
es considerado uno de los agentes etiológicos importantes de la enfermedad periodontal [1]. Para colonizar y sobrevivir en la grieta gingival, P. gingivalis
deben ser capaces de detectar y responder a las condiciones ambientales imperantes, tales como las variaciones de temperatura, tensión de oxígeno, el pH, la disponibilidad de nutrientes y la presencia de otras células bacterianas. P. gingivalis
posea reguladores transcripcionales que han sido implicados en la protección contra el estrés de choque térmico o de estrés oxidativo, tales como RprY [2, 3] y OxyR [4]. Además, esta bacteria y otras bacterias forman biofilms para proteger contra el estrés ambiental [5]. La placa dental, una biopelícula de especies múltiples, se organiza sobre la superficie de los dientes y los tejidos periodontales de la cavidad oral humana [6]. Las bacterias orales en las biopelículas sobrevivir en el surco gingival durante un largo periodo de tiempo, lo que lleva a la gingivitis que con el tiempo, puede evolucionar hacia la periodontitis. La comprensión de cómo las bacterias escapar del estrés ambiental es muy importante para la prevención de la enfermedad periodontal.
Factores sigma función extracitoplásmico (ECF) sirven como reguladores de la transcripción bacteriana en la respuesta a varios tipos de estrés. Los de tipo salvaje P. gingivalis 33277
genoma codifica seis factores sigma ECF (PGN_0274, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970, PGN_1108 y PGN_1740; GenBank: AP009380) [7]. (Número W83 ORF: PG1318) PGN_1108 juega un papel en la regulación de la frecuencia de mutación en la bacteria [8]. (Número W83 ORF: PG0162) PGN_0274 y (número W83 ORF: PG1660) PGN_0450 puede estar implicada en la regulación post-transcripcional de gingipain [9], y (número W83 ORF: PG1827) PGN_1740 es necesaria para la supervivencia de la bacteria en el presencia de oxígeno y el estrés oxidativo, la captación de hemina y la virulencia [9, 10].
en este estudio, para analizar el papel de los factores sigma ECF en P. gingivalis
la formación de biopelículas, la alteración de los factores sigma ECF, excepto PGN_1108, se realizó. El mutante PGN_1108-defectuoso puede tener un fenotipo mutador, y por lo tanto excluido de nuestros experimentos en este estudio [8]. El PGN_0274 y mutantes defectuosos PGN_1740-exhibieron mejoran la formación de biopelículas, pero las complementa las cepas no lo hicieron. Estos resultados sugieren que los factores sigma PGN_0274 y PGN_1740 ECF están involucrados en la regulación de la formación de biopelículas en la bacteria.
Métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo celular
Todas las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en el presente estudio son enumeran en la Tabla 1. P. gingivalis
Las células se cultivaron en condiciones anaerobias (10% de CO
2, 10% H 2 y 80% N 2) en infusión de cerebro y corazón enriquecido (BHI) y el tríptico de soja enriquecida (TS) de agar [11]. Para placas de agar sangre, se añadió sangre de oveja desfibrinada barnizada de agar enriquecido TS al 5%. Para la selección y mantenimiento de P. gingivalis resistentes a los antibióticos
cepas, se añadieron los siguientes antibióticos al medio: 15 g /ml de eritromicina (Em), y 0,7 g /ml de tetraciclina (Tc) .Tabla 1 Cepas bacterianas y plásmidos utilizado en este estudio
cepa o plásmido
Descripción
de referencia o fuente de
E. coli cepa
DH5a
de uso común cepa huésped para la clonación de Invitrogen
P. gingivalis cepa
33277
tipo salvaje ATCC
KDP314
PGN_0274 :: ERMF ermAM, España emr
Este estudio
KDP315
PGN_0319 :: ERMF ermAM, España emr
Este estudio
KDP316
PGN_0450 :: ERMF ermAM, España Emr
Este estudio
KDP317
PGN_0970 :: ERMF ermAM,
Emr
Este estudio
KDP319
PGN_1740 :: ERMF ermAM, España Emr
Este estudio
KDP314C
KDP314 /pKD828, España Emr Tcr
Este estudio
KDP319C
KDP319 /pKD829,
Emr Tcr
Este estudio
E. coli
plásmido
pGEM-T Easy
abr, vector de plásmido de clonación TA
Promega
pKD355 mundo abr, España contiene la ERMF ermAM
casete de ADN entre Eco
RI y Bam HI de pUC18
12
pKD814 mundo abr, contiene el 1,0 kb fragmento amplificado por PCR (región PGN_0450) en pGEM T Easy
Este estudio
pKD817 mundo abr, contiene el fragmento de 1,5 kb amplificado por PCR (región PGN_0274) en pGEM-T Easy
Este estudio
pKD818 mundo abr, contiene el 2,0 kb fragmento amplificado por PCR (región PGN_0319) en pGEM-T Easy
Este estudio
pKD819 mundo abr, contiene el 2,0 kb fragmento amplificado por PCR (región PGN_0970) en pGEM-T Easy
Este estudio
pKD821 mundo abr, contiene el 2,0 kb fragmento amplificado por PCR (región PGN_1740) en pGEM-T Easy
Este estudio
pKD822
el mundo Abr emr, contiene el ERMF ermAM
casete de ADN en el sitio Bam HI
dentro de PGN_0274 pKD817
Este estudio
pKD823
Emr abril, contiene el ERMF ermAM
casete de ADN en el sitio Bam HI
dentro de PGN_0319 pKD818
Este estudio
pKD824 mundo Abr emr, contiene el ERMF ermAM
casete de ADN en el sitio Bam HI
dentro de PGN_0450 pKD814
Este estudio
pKD825 mundo Abr emr, contiene el ERMF ermAM
casete de ADN en el sitio Bgl II dentro
PGN_0970 de pKD819
Este estudio
pKD827 mundo Abr emr, contiene el ERMF ermAM
casete de ADN en el sitio Bam HI
dentro de PGN_1740 pKD821
Este estudio
P. gingivalis
plásmido
pT-VACA mundo Abr Tcr, E. coli-P. gingivalis
plásmido lanzadera
14
pKD828 mundo Abr Tcr, PGN_0274 PT-vaca-+
Este estudio
pKD829 mundo Abr Tcr, PGN_1740 pT-vaca-+
Este estudio
Construcción de mutantes sigma factor ECF y cepas mutantes complementados
a perturbar los genes del factor sigma ECF, PGN_0274-, PGN_0319-, PGN_0450-, PGN_0970- y PGN_1740 codificación de los genes fueron PCR-amplificación de ADN cromosómico de P. gingivalis 33277
utilizando Takara Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Japón) y los cebadores específicos de genes que figuran en la Tabla 2. las áreas amplificados fueron un fragmento de ADN que contiene parte del extremo 5 'de cada gen del factor sigma ECF y la región aguas arriba del codón de iniciación ATG, y un fragmento de ADN que contiene el extremo 3 'de cada gen del factor sigma y la región aguas abajo de su codón de terminación. Ambos fragmentos se ligan a continuación en el sitio de clonación múltiple del vector T (pGEM-T Easy Vector, Promega, Tokio, Japón). Un Bam HI-Sac
fragmento (Bgl II-Sac
fragmento de PGN_0970) que contiene el extremo 3 'de cada gen del factor sigma se extrajo a partir del plásmido resultante y se ligó en el Bam
HI-Sac
sitio I (Bgl II-Sac
fragmento de PGN_0970) del plásmido que contiene el extremo 5 'del gen correspondiente ECF. El ERMF
-ermAM
casete de pKD355 [12] se insertó en el sitio Bam HI
dentro de PGN_0274 pKD817, PGN_0319 de pKD818, PGN_0450 de pKD814 y PGN_1740 de pKD821, o el Bgl II
sitio dentro de PGN_0970 pKD819 para dar pKD822, pKD823, pKD824, pKD827 y pKD825, respectivamente. Estos plásmidos fueron linealizados por Not
I digestión y se introducen en P. gingivalis
33277 células por electroporación como se describe anteriormente [13], lo que resulta en KDP314 (PGN_0274 :: ERMF ermAM
), KDP315 (PGN_0319 :: ERMF ermAM
), KDP316 (PGN_0450 :: ERMF ermAM
), KDP317 (PGN_0970 :: ERMF ermAM
) y KDP319 (PGN_1740 :: ERMF ermAM
). sustitución génica correcta de estas cepas, que habían sido generados por eventos de recombinación de doble entrecruzamiento, se verificó mediante PCR y análisis de transferencia Southern (datos no mostrados) .table 2 Cebadores usados en este estudio
secuencia de nucleótidos Nombre
(5′-3′)
PGN0274-U-F
TCGACAGTTGATTGCCGAT
PGN0274-U-R-Bam
HI
GGGATCCCCATCGAAAGACTGCAATCTGG
PGN0274-D-F-Bam
HI
GGGATCCCATGACGACGCCGCTCCTGTCGAAA
PGN0274-D-R
TGTGCAAAAAAGGAAACAGC
PGN0319-U-F
GCTGCCGCTCCTTCTTCAT
PGN0319-U-R-Bam
HI
GGGATCCCAAAGGCAGATCGTCCGGTA
PGN0319-D-F-Bam
HI
GGGATCCCCTCCGATCATGCCCCTA
PGN0319-D-R
TCAGGCTCTTGTACAGATGGA
PGN0450-U-F
GGGATGTGGAGAAAAAGGAA
PGN0450-D-R
ATGACCACGGACAGGAAGAT
PGN0970-U-F
ACCGGGAAATAATTCTCAAGC
PGN0970-U-R-Bgl
II
AAGATCTTCCAAAGAGGTCGGATAAGGA
PGN0970-D-F- Bgl
II
AAGATCTTAGGCTGCCGAGGTACAGGA
PGN0970-D-R
ACACAAGCTACAGCCCCGTA
PGN1740-U-F
GAGGATCTCCCTGCCAATAAT
PGN1740-U-R-Bam
HI
GGGATCCCACCCAGCCTTTGAAGTTGACA
PGN1740-D-F-Bam
HI
GGGATCCCGCTCACTGTCATGCGAAAT
PGN1740-D-R
CCAACGGCTATTTAGCATCC
PGN0274-COMP-U-F-Pst
I
CCTGCAGGCTGCTACTGTCTCGGACGTG
PGN0274-COMP-D-R-Bam
HI
GGGATCCCGTTTGTGTTTGAGGCTGCAT
PGN1740-COMP-U-F-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTGCGATATCGGGAATCAG
PGN1740-COMP-D-R-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTTGATACGGCTGCTATGC
Los sitios de restricción incorporados en los oligonucleótidos para la subclonación están en negrita.
para la complementación de PGN_0274 y PGN_1740, toda la región del gen del factor sigma ECF con sus regiones aguas arriba y aguas abajo de acompañamiento (0,5 kb) fue amplificado por PCR a partir del ADN cromosómico utilizando Takara Ex Taq con los cebadores superior e inferior (Tabla 2). Los fragmentos de ADN amplificados se ligaron en el sitio de clonación múltiple de pGEM T-fácil vector. El Sph
I-Bam HI de
fragmento PGN_0274 o Bam HI
fragmento de PGN_1740 se extrajeron a partir del plásmido resultante y se ligó en el Sph
I-Bam HI
o Bam
HI sitio de pT-VACA [14], que fue proporcionado amablemente por el profesor NB Zapatero (Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, EE.UU.). Los plásmidos resultantes, pKD828 y pKD829, se introdujeron en KDP314 o KDP319 por electroporación, resultando en KDP314C y KDP319C, respectivamente, después de 7 días de incubación en agar TS enriquecido que contiene 0,7 mg /ml de tetraciclina. La presencia de plásmido derivado de pT-COW se verificó mediante PCR y la restauración del mRNA del gen mutado fue establecido por RT-PCR (datos no mostrados).
Evaluación de la capacidad de formación de biofilm
La formación de biopelículas fue examinado por el protocolo modificado de Saito [15]. En breve, P. gingivalis
células se inocularon en caldo BHI, y precultivaron anaeróbicamente a 37 ° C durante 2 d. culturas completamente crecido de los P. gingivalis
cepas habían turbidez ajustado a OD 660 = 0,1 con medio fresco, y luego partes alícuotas de 1,5 ml se inocularon en colágeno de tipo I-recubierto de 12 pocillos de fondo plano de microplacas ( Iwaki Glass Co., Funabashi, Japón) y se cultivaron en condiciones anaerobias a 37 ° C durante 2 d. El medio de cultivo se retiró de cada pocillo y se añadieron 0,5 ml de solución de cristal violeta 0,1%. Después de 15 min, los pocillos se lavaron tres veces con PBS y se seca al aire. El violeta cristal que queda en el biofilm se solubilizó con 0,5 ml de 1% SDS y la absorbancia se midió a A 600 usando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). masa biofilm se determinó mediante tinción con cristal violeta y se ajustó para el crecimiento (A 600 unidades por valor de DO 660 unidades).
El análisis estadístico Francia El unidireccional Prueba Comparativa múltiple ANOVA prueba /de Dunnett se utilizó para comparar las diferencias entre 33277 y mutantes ECF utilizando GraphPad Prism versión 6.0 para Windows (GraphPad Software, Inc., la Jolla, CA, EE.UU.). Los datos se consideraron significativas si p Hotel & lt; 0.05.
Resultados
el crecimiento y la formación de biopelículas capacidad de los P. gingivalis
ECF sigma factor mutantes
Los cinco mutantes ECF crecieron más lentamente que la cepa de tipo salvaje en fase exponencial, y los rendimientos finales de los mutantes ECF fueron menos que la de los de tipo salvaje después de una 48 h de incubación en condiciones anaeróbicas (Figura 1). El mutante PGN_1740 mostró notablemente el crecimiento lento en comparación con la de tipo salvaje y otros mutantes ECF. Para evaluar la relación entre la actividad de la formación de biopelículas y factores sigma ECF, la formación de biopelículas se examinó para la de tipo salvaje y cinco mutantes ECF. Después de la tinción de cristal violeta de la biopelícula, se solubiliza primero con etanol. El cristal violeta que queda en la de tipo salvaje, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 y PGN_1740 biopelícula mutante se solubiliza y se extrae, pero en el mutante PGN_0274, solubilización y extracción no fuera completa (véase la disposición 1). Por lo tanto, la masa de biopelículas de todas las cepas ensayadas se disolvió con SDS y se mide. Entre los mutantes ECF, la masa de biofilm de los mutantes PGN_0274 y PGN_1740 fue mayor que la de tipo salvaje (Figura 2). Para confirmar el colágeno de tipo I influye en la formación de biopelículas, se determinó la formación de biopelículas utilizando una placa no recubierta. Los resultados fueron casi los mismos (véase la disposición 2), ya que el mutante PGN_0274 produjo más de biopelículas que la de tipo salvaje. Sin embargo, la cepa de tipo salvaje y el mutante PGN_1740 no fueron estadísticamente diferentes. Este resultado sugiere la formación de biopelículas por el mutante PGN_1740 fue influenciado por la situación del medio ambiente, tales como la presencia de colágeno tipo I. Figura 1 El crecimiento de P. gingivalis 33277 y ECF del factor sigma mutantes. Curvas de crecimiento de P. gingivalis
33277 (de tipo salvaje; círculo), mutantes PGN_0274 (KDP314; rectángulo abierto), mutantes PGN_0319 (KDP315; rectángulo cerrado), mutantes PGN_0450 (KDP316; diamante), mutantes PGN_0970 (KDP317; triángulo ), PGN_1740 mutante (KDP319; cruz) en caldo BHI enriquecido. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Figura 2 La formación de biopelículas por homotipica P. gingivalis 33277 o ECF sigma factor mutantes. Las cepas se cultivaron en caldo BHI enriquecido anaeróbicamente a 37 ° C en el colágeno de tipo I recubiertas de 12 pocillos de fondo plano de microplacas. Después de 48 h de cultivo, la masa del biofilm organizada se evaluó mediante tinción con cristal violeta. (A) Las fotografías son una muestra representativa de cada cepa experimental. (B) La formación de biopelículas determinada por tinción con violeta cristal y ajustado para el crecimiento (unidades A600 por unidad de DO660). Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos. ***, P Hotel & lt; 0.001, mediante la prueba de comparación múltiple de un ANOVA de una vía de prueba /de Dunnett
. Complementación de los mutantes PGN_0274- y PGN_1740-defectuosos
Para determinar si la masa del biofilm mejorada fue causado por la supresión de PGN_0274 y PGN_1740, se construyó cepas donde se restauraron la PGN_0274 y PGN_1740. El PGN_0274 y PGN_1740 complementan cepas fueron construidas por la introducción de la PT-COW que contiene el PGN_0274 de tipo salvaje y PGN_1740 en cada uno de los mutantes. Esta complementación restauró la capacidad de formación de biopelículas a los niveles de tipo salvaje (Figura 3). Estos resultados apoyan el concepto de que PGN_0274 y PGN_1740 juegan un papel importante en el control de P. gingivalis
la formación de biopelículas. Figura 3 La formación de biopelículas por homotipica P. gingivalis 33277, ECF factor sigma mutante y complementa la cepa mutante. Las cepas se cultivaron en caldo BHI enriquecido anaeróbicamente a 37 ° C en el colágeno de tipo I recubiertas de 12 pocillos de fondo plano de microplacas. Después de 48 h de cultivo, la masa del biofilm organizada se evaluó mediante tinción con cristal violeta. (A) La formación de biopelículas de 33277, se compararon PGN_0274 mutante y la cepa mutante complementado. (B) La formación de biopelículas de 33277, se compararon PGN_1740 mutante y la cepa mutante complementado. La formación de biopelículas determinada por tinción con violeta cristal y ajustado para el crecimiento (unidades A600 por unidad de DO660). Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos. *, P Hotel & lt; 0,05 y ***, p Hotel & lt; 0.001, por una sola vía prueba de comparación múltiple ANOVA prueba /de Dunnett.
Discusión
bacterias veces encuentran un ambiente desfavorable para su supervivencia. La microbiota oral humana también es a menudo influenciado por varios tipos de estrés; por lo tanto, debe poseer la capacidad de defenderse. Dos principales mecanismos de regulación interactúan con las regiones citoplásmicas y extracytoplasmic a través de factores sigma alternativos ECF y reguladores de respuesta dependientes de la fosforilación (sistemas de dos componentes, TCSS) [16, 17]. factores sigma ECF han demostrado que regulan procesos celulares relacionados del sobre-(que implican el mantenimiento de la arquitectura de membrana /periplásmico), tales como la secreción, la síntesis de exopolisacáridos, la exportación de hierro y la síntesis de flujo de salida de las proteasas extracelulares [18]. Bacterial RNA núcleo de la polimerasa (compuesta por dos subunidades, la subunidad β y la subunidad β ') se une factores sigma. Múltiples factores sigma son los factores de iniciación de la transcripción bacterianas que permiten la unión específica de la ARN polimerasa a los promotores de genes. Por el contrario, TCSs típicamente consisten en una histidina quinasa unida a la membrana que detecta un estímulo ambiental específico y un regulador de respuesta correspondiente que media la respuesta celular, principalmente a través de la expresión diferencial de los genes diana [19]. Curiosamente, un regulador transcripcional en Methylobacterium extorquens
, PhyR, se ha identificado y determinado para combinar los dominios de ambos sistemas [20]. Tomados en conjunto, ECF factores sigma y TCS son factores esenciales que protegen las bacterias de estrés ambiental.
Varios gingivalis P.
factores sigma ECF se han descrito anteriormente. Sin embargo, no hay información sobre los factores sigma ECF que pueden operar en esta bacteria en respuesta a la formación de biopelículas. En Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa
, factores sigma ECF están involucrados en la regulación del desarrollo de biopelículas [21, 22]. En este estudio, se investigó si la formación de biopelículas de P. gingivalis
está regulada por factores sigma ECF. Este estudio demostró que PGN_0274 y PGN_1740 mutantes produjeron la formación de biopelículas mayor que el obtenido con el de tipo salvaje o el otro factor sigma mutantes ECF. La inactivación de PGN_1740 también aumentó la expresión de los FIM
en el nivel transcripcional [9]. Fimbrias y menores fimbrias monoespecíficos influencia biopelículas [23]. El nivel de la transcripción de los FIM
se examinó mediante RT-PCR, que mostraban los FIM
expresión se downregulated (véase la disposición 3). Los resultados mostraron FIM no pueden estar implicados en el control de la formación de biopelículas. Es necesario seguir trabajando para aclarar este punto. México La biopelícula ensayo reveló que el etanol no se disolvió por completo la masa del biofilm y extraer la mancha de cristal violeta durante la biopelícula PGN_0274 mutante (véase la disposición 1). Por lo tanto, disolvió la masa de biopelículas con SDS y se midió el violeta cristal resultante presente en la muestra. La necesidad de un disolvente más riguroso sugiere que la matriz de la biopelícula alrededor de la mutante se compone en parte de un componente de proteína. Las sustancias extracelulares biofilm poliméricos (EPS), compuestos de exopolisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, juegan un papel como una estructura de defensa, la protección de las bacterias desde el sistema inmune del huésped y la terapia antimicrobiana [24]. La proteína es un componente importante de la EPS [25]. Como las vías metabólicas de la mutante PGN_0274 se cambian por la pérdida del factor sigma PGN_0274 ECF, los rendimientos de proteína en el mutante PGN_0274 son más abundantes que las de la de tipo salvaje y los otros mutantes. Por lo tanto, se analizó el perfil de proteínas de los mutantes sigma ECF en comparación con la de tipo salvaje (véase la disposición 4). La degradación de 75-k-250-k proteínas Da se demostraron en los de tipo salvaje, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 y PGN_1740 mutantes, pero no en el mutante PGN_0274. Esta alteración no se observó en la presencia del TLCK inhibidores de proteinasa y leupeptina. Los perfiles de proteínas de la de tipo salvaje y mutantes sigma ECF fueron casi idénticos. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que esta diferencia aparente en la solubilidad se podría explicar por la disminución de la actividad Kgp y Rgp en el mutante PGN_0274 [9]. Kgp suprime la formación de biofilm y Rgp controla la morfología microcolonias [26]. La SINR
ortholog PGN_0088, un regulador transcripcional, actúa como un regulador negativo de la acumulación de exopolisacáridos de tipo salvaje P. gingivalis
[27]. PGN_0274 puede controlar diferentes vías metabólicas que PGN_0088 y actuar como un regulador negativo de la acumulación de la proteína.
En conclusión, hemos identificado que PGN_0274 y PGN_1740 juegan un papel clave en la P. gingivalis
la formación de biopelículas. Estos resultados muestran por primera vez que P. gingivalis
factores sigma ECF están involucrados en la formación de biopelículas. PGN_0274 está implicado en la regulación post-transcripcional de gingipains [8]. Gingipain es un factor de virulencia muy importante en P. gingivalis
, porque gingipains destruir tejidos periodontales, inmunoglobulinas y factores del complemento [28, 29]. Como PGN_1740 juega un papel importante en las respuestas de estrés oxidativo en la bacteria [8, 9], la supervivencia del mutante PGN_1740 se redujo en presencia de células huésped [9]. También se observó esto en las células Ca9-22 (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que los factores de ECF sigma PGN_0274 y PGN_1740 están implicados en la virulencia de P. gingivalis
. Otros estudios sobre el papel de los P. gingivalis
factores sigma ECF, PGN_0274 y PGN_1740, nos ayudarán a comprender la capacidad de P. gingivalis
para colonizar y sobrevivir en el surco gingival, y por tanto actuar como patógeno humano Conclusiones.
México la masa de la biopelícula de los mutantes PGN_0274 y PGN_1740 fue mayor que la de los de tipo silvestre, lo que sugiere P. gingivalis
función extracitoplásmico sigma factores PGN_0274 y PGN_1740 están implicados en la formación de biopelículas.
abreviaciones
ECF:
función extracitoplásmico
BHI:
infusión de corazón y cerebro
TS:
de soja tríptico
Em: eritromicina
Tc:
tetraciclina
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
ANOVA:
Análisis de varianza
TCS:
dos sistemas de componentes
SDS: dodecilsulfato sódico
EPS:.
sustancias poliméricas extracelulares
Declaraciones
Agradecimientos
agradecemos a los miembros del Departamento de Microbiología Oral, Matsumoto Dental University, y Microbiología, Tokyo Dental College, útil para el debate. Este estudio fue apoyado por una subvención-en-Ayudas (24792372) para la investigación científica del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes, Cultura y Tecnología, Japón, y esta investigación también fue apoyada por Oral hrc8 Health Science Center Beca de Tokyo Dental College y por un Proyecto de Universidades privadas:. búsqueda de la subvención del fondo de MEXT (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología) del Japón, 2010-2012
material complementario Electrónico
12903_2014_492_MOESM1_ESM.pptx archivo adicional 1: Las comparaciones de biopelícula tratados con etanol o SDS (PPTX 456 KB) 12903_2014_492_MOESM2_ESM.pptx archivo adicional 2:.. la formación de biopelículas por homotipica P. gingivalis 33277 o ECF sigma factor mutantes utilizando microplaca no recubierto (PPTX 80 KB) 12903_2014_492_MOESM3_ESM.pptx la disposición 3:. La expresión del ARN de los FIM en P. gingivalis 33277, PGN_1740 mutante y complementa cepa mutante (PPTX 101 KB) 12903_2014_492_MOESM4_ESM.pptx archivo adicional 4:. perfil de proteínas en un gel de SDS-PAGE (PPTX 343 KB) Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores
SO y YK contribuyeron igualmente a este trabajo. SO y YK previsto el estudio, realizado los experimentos y análisis de datos, y escribió el manuscrito. Koji Nakayama, NO y KI participaron en la planificación y el diseño del estudio, así como en el análisis de datos. MN y TI realizó el estudio de supervivencia en las células huésped y ayudó a redactar el manuscrito. KS, EK y YS ayudaron con los estudios de microbiología. Keisuke Nakano, los conocimientos tradicionales y HH ayudó con los estudios de microbiología y supervisados redacción del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
