dental
Resumen Antecedentes
La caries dental es la enfermedad más común que afecta microbiana humanidad. métodos de evaluación del riesgo de caries, la identificación de biomarcadores y estrategias de desarrollo de vacunas se enfatizan para controlar la incidencia de la enfermedad en gran medida prevenibles. Los receptores de reconocimiento de patrones, tales como el número de víctimas como receptores (TLR) han sido implicados como moduladores de la interacción huésped-microbiana. Soluble TLR-2 y su co-receptor, CD14 identificado en la saliva se pueden unir los componentes de la pared celular de las bacterias cariogénicas y modular el proceso de la enfermedad. El objetivo de este estudio es determinar el potencial de la saliva STLR-2 y sCD14 como biomarcadores de la actividad de la caries y las medidas indirectas de la carga bacteriana cariogénica.
Métodos
se recogió la saliva total, sin estímulo de veinte libres de caries y la caries veinte niños activos entre las edades de 5 y 13 años. La concentración de sCD14 y STLR-2 junto con el de la citoquina IL-8 informado de que se aumentó en la caries dental se evaluó por la enzima ensayo inmunoenzimático.
Resultados
Si bien el nivel de sCD14 y la de IL- 8 fue equívoca entre los dos grupos, la concentración STLR-2 en la saliva de caries activa fue significativamente más alta que en la saliva de caries libre.
Conclusiones Francia el STLR-2 en la saliva podría servir como un biomarcador potencial para la actividad de la caries. Palabras clave
peaje saliva Soluble like receptor 2 La caries dental biomarcador Electrónico material complementario
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) contiene material complementario, el cual está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes
la caries dental es una enfermedad infecciosa multifactorial causada por interacciones complejas entre las bacterias productoras de ácido, hidratos de carbono fermentables y de los factores del huésped. A pesar de ser en gran medida prevenibles, se mantiene como la enfermedad crónica más frecuente en todo el mundo [1]. análisis sistemáticos recientes sugieren que la incidencia de la caries exhibe una tendencia creciente en los niños de 2-4 años en los Estados Unidos [2]. Hay evidencia de una mayor prevalencia en adultos de más bajo nivel socioeconómico en los países europeos. En las naciones en desarrollo la prevalencia está aumentando en niños y adultos [3].
La detección temprana de lesiones de mancha blanca, la detención de desmineralización y remineralización la promoción son algunos de los métodos clínicos preventivos se utilizan actualmente en la gestión de la caries dental [4]. Además se hace especial hincapié en el desarrollo de estrategias de evaluación del riesgo de caries eficientes para determinar la probabilidad de que un individuo desarrolle nueva lesión de caries y /o para determinar el estado del proceso de la caries en las superficies dentales individuales [4, 5]. Como la enfermedad de los tejidos mineralizados de los dientes, la patogénesis de la caries implica la desmineralización del esmalte por bacterias productoras de ácido y la destrucción de la sustancia orgánica resultante en cavitación [1, 4].
Saliva es reconocido como una fuente rica de factores del huésped capaces de modular el proceso de caries [6, 7]. Los avances tecnológicos han ayudado en la caracterización de la proteómica salivales y peptidómica con la identificación de 1444 proteínas y péptidos 11893 respectivamente [8]. Estas proteínas /péptidos pertenecen a diferentes clases funcionales tales como los que participan en la respuesta a los estímulos /estrés, funciones antioxidantes, funciones catalíticas y los reguladores de la enzima [8, 9]. Varios componentes salivales se han evaluado para una asociación con la caries dental. Mientras que algunos exhiben asociación débil, otros fueron equívocos entre lo normal y la caries activa la saliva [9-12]. Evaluación de las glicoproteínas salivales con oligosacáridos específicos mostró que los niveles más altos de seleccione oligosacárido que facilitan la colonización bacteriana en la superficie de los dientes se correlacionan con la incidencia de caries en los adultos jóvenes [13]. los niveles salivales de agentes antimicrobianos, tales como defensinas alfa, estaterina y cistatina S se han sugerido como posibles factores de riesgo para el desarrollo de caries [10, 14].
receptores tipo Toll (TLR) están germinal receptores que reconocen patrones microbianos conservados típicamente codificado compartida por grandes grupos de microorganismos. Actualmente 13 TLRs de mamíferos y muchas de sus ligandos son conocidos [15]. Funcional, ya sea solo o en concierto con los co-receptores específicos en el reconocimiento de patrones microbianos el acto TLRs como porteros constantemente el muestreo del medio ambiente y la obtención de respuestas para prevenir /controlar la infección [15, 16]. TLR-2 y TLR-4 se ha demostrado que reconocer el peptidoglicano de bacterias Gram positivas y el lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas, respectivamente, ya sea solo o en asociación con el común co-receptor CD14 [17, 18]. Los odontoblastos localizadas en la superficie de dentina-pulpar en dientes sanos han demostrado expresar TLR-2 y TLR-4. Dependiendo de la naturaleza de la progresión de la caries odontoblástica respuesta es suprimida ya sea con la formación de dentina reaccionaria o acelerada que conduce a la inflamación pulpar [19, 20]. la invasión microbiana de la dentina se ha demostrado que upregulate TLR-4 en odontoblastos y mediar la secreción de TGF-β facilitar la síntesis de colágeno. Además TLR-4 de señalización en odontoblastos también regulan al alza la matriz metaloproteinasa-2 promover la escisión de sialophosphoprotein dentina (DSPP) a sialoproteína dental (DSP) que forma un sitio de nucleación para la formación de cristales hydroxyapeptite en el colágeno recién formado [19]. La estimulación de los odontoblastos como células con componentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas suscitó de citoquinas y quimioquinas secreciones en una forma dependiente de TLR-2 [20]. Los niveles elevados de citocinas IL-6, TNF-α y la IL-8 se han observado en caries saliva activa [21].
Aunque principalmente membrana asociada, recientemente formas solubles de ciertos TLRs se han identificado en los fluidos corporales. Se ha sugerido que los TLRs solubles funcionan para secuestrar patógenos [22-25]. Recientemente, nosotros y otros han informado de la presencia de sCD14 soluble y STLR-2 en la saliva [24, 26]. TLR-2 se ha demostrado que reconocer el peptidoglicano y el ácido lipotecoico de Streptococcus mutans
, las bacterias cariogénicas más comunes [27]. evidencia considerable sugiere una fuerte correlación entre el aumento de la presencia de las bacterias cariogénicas en el biofilm de la placa y los números elevados de la misma bacteria en la saliva [6, 10]. Por lo tanto la hipótesis de que el nivel de STLR-2 y sCD14 en la saliva de individuos activos caries producirá una medida indirecta de la carga bacteriana y actuar como un biomarcador de la actividad de la caries. Nuestros datos sugieren que la STLR-2 es mayor en la saliva total no estimulada (UWS) de los niños con lesiones de caries activas.
Métodos Estudio de población
En este estudio prospectivo no aleatorios estudio clínico cuarenta niños de entre 6 y 12 años de edad de informes a las consultas de pediatría de la Facultad de Odontología de la Universidad de Indiana fueron reclutados después de obtener el consentimiento informado de los pacientes y de la guarda. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Purdue Universidad de Indiana en Indianápolis. Las muestras se recogieron sólo de los niños sin enfermedad oral o sistémica conocida distinta de la caries dental y sin dientes extraídos. Los exámenes orales de los niños se realizaron y registraron la actividad de caries. Veinte niños (13 niños y 7 niñas) estaban libres de caries y veinte niños (12 niños y 8 niñas) fueron caries activas que exhiben cuatro a ocho lesiones de caries que requieran restauración.
Recogida y tratamiento
Todos los niños fueron instruidos para evitar la Muestra comer y beber por lo menos 2 horas antes de la recogida de saliva como se describe [24, 28]. Después de enjuagar la boca brevemente con agua, se recogió toda unstimulated saliva (UWS) de cada niño por el método babeo pasiva durante cinco minutos en tubos pre-refrigerados. Las muestras se transportaron en hielo al laboratorio para su procesamiento inmediato. Cada muestra se clarificó por centrifugación a 4000xg a 4 ° C durante 10 minutos y se almacena en tres partes alícuotas a -80 ° C en CompleteTM inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche, Mannheim, Alemania) hasta su posterior análisis.
Total concentración de proteínas
el contenido de proteína total de las muestras de pre se midió por el método de Bradford que implica la unión de colorante azul de Coomassie a las proteínas [24, 25]. La forma de la proteína-colorante azul se detectó a 595 nm utilizando un espectrofotómetro (Gensys5 espectrofotómetro, corp termoelectrónico, CA). La concentración de la proteína en cada muestra se determinó frente a una curva estándar desarrollado utilizando concentración conocida de albúmina de suero bovino
enzimoinmunoensayo (ELISA)
Para la determinación de sCD14 en la saliva de un kit de ELISA sandwich (R & amp;.; D Systems , Minneapolis, MN) se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. anticuerpo policlonal de TLR-2 Anti-humano (clon: Imgenex Corporation, San Diego, CA) se utilizó para la detección de TLR-2. Todas las muestras UWS se agotaron de amilasa e inmunoglobulinas mediante la incubación en serie con el anticuerpo anti-humano amilasa monoclonal (mAb) (1: 2500, catálogo # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) y perlas de proteína G (Miltenyi Biotec Inc Auburn, CA ) a 4 ° C [24]. El contenido de proteína de las muestras ya lavadas se determinó como anteriormente y limpieza previa UWS en 1 mg de concentración /ml se utilizó para la medición de sCD14 y STLR-2 niveles [25]. La preincubación de la UWS ya sea con mAb anti-TLR2 (clon: 1030A5.138, Imgenex Corp, San Diego, CA, EE.UU.) (0,5 mg /ml) o con TLR-2 péptidos (1 mg /ml) se realizó para evaluar la especificidad de la unión. Bound CD14 y TLR-2 se detectó con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anti-IgG de ratón seguido de sustrato TMB (Pharmingen, San Diego, CA). La absorbancia a 450 nm se leyó en un lector de microplacas (modelo 680: BioRad Laboratories, CA). La concentración de STLR-2 o sCD14 en pg /ml de proteínas salivales se determinó utilizando una curva estándar de purificado CD14Fc humana recombinante y TLR-2FC (R & amp; D Systems) de concentración conocida. IL-8 en la concentración de las muestras de saliva clarificados se midió utilizando kit BD OptEIA3 ™ ELISA.
Análisis estadístico
diferencias en la concentración de IL-8, CD14 y TLR-2 entre las caries libres y caries se determinaron grupos activos mediante la prueba t de los estudiantes. valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados y discusión
A pesar de los avances en los métodos de detección temprana y medidas preventivas eficaces caries dental sigue siendo una enfermedad crónica de alta prevalencia en todo el mundo. El aumento de la incidencia entre los niños en los países desarrollados constituye un problema de salud preocupante [2, 3]. Los datos demográficos de la población del estudio se dan en la Tabla 1. La concentración de proteína total de la saliva humana se ha demostrado que presentan grandes variaciones que van desde 0,4 mg /ml a 7,1 mg /ml [29, 30]. En nuestra cohorte del estudio de la concentración de proteína total mide 6,24 +/- 1,98 mg /ml en la saliva de caries y libre de 5,92 +/- 2,37 mg /ml en la saliva de caries activa (Figura 1A) .table 1 Los datos demográficos de la población del estudio
datos clínicos
Número reclutó
Edad (años)
Hombre
Mujer
caries dentales
12
8
8,76 +/- 3,42
control sanos página 13
página 7
7,77 +/- 2,7
Figura 1 La concentración total de proteínas en la saliva: toda clarificado la saliva fue evaluado para (a) contenido de proteína total por espectrofotometría y (B ) IL-8 concentración por ELISA. No se observó ninguna diferencia significativa entre los libres de caries y las caries activas grupos de saliva.
a la creciente cantidad de proteínas salivales se añaden las formas solubles de los receptores de reconocimiento de patrones, la STLR-2, sCD14 y STLR-4 [25, 26 , 31]. La concentración de STLR-2 en la saliva parótida se ha informado de que varios pliegues más alta que en la saliva total [31]. La fuente de STLR-2 podría ser o bien la secreción activa de la glándula y /o un resultado de la escisión extracelular del receptor unido a la membrana. Se observó que la concentración de STLR-2 en caries saliva activa (29,5 +/- 3 pg /ml) era significativamente más alta que en la caries saliva libre (24,8 +/- 0,6 pg /ml) (Figura 2B). La señalización a través de TLR en células huésped induce la secreción de citoquinas [15]. Anteriormente Gornowicz et al., Han informado de niveles elevados de IL-8 salival de la caries dental [21]. Se observó que la concentración salival IL-8 no fue significativamente diferente entre la caries libres y caries saliva activa (Figura 1B). La observación de la variable entre los dos estudios podría atribuirse a las diferencias en la edad y la naturaleza de la muestra (amilasa y Ig agota vs. no empobrecido). La concentración de sCD14 en la saliva era equívoca en ambos grupos; que oscila entre 509 pg /ml y 1443 pg /ml en caries grupo libre y entre 609 pg /ml y 1829 pg /ml en caries grupo activo (Figura 2A). Anteriormente Bergandi et al., Informaron ausencia completa de sCD14 en la saliva en los niños con dos a ocho lesiones de caries [28]. El uso de la saliva previamente limpiada y el método utilizado para medir sCD14 (Western blot frente ELISA tipo sándwich) podría atribuir a las diferencias observadas entre el informe Bergandi y nuestro estudio. Figura 2 sCD14 y la concentración STLR-2 en la saliva: saliva clarificada se agotan de la abundancia de proteínas de alto peso molecular, amilasa y las inmunoglobulinas, como se describe en la sección de métodos para aumentar la sensibilidad de la detección de menos abundante sCD14 y STLR-2. El nivel de (A) sCD14 y (B) STLR-2 se determinó por ELISA. * Representa p & lt; 0.05.
Sobre la base de su fuerte asociación con la incidencia de caries múltiples estudios evaluaron los niveles salivales de S. mutans
para la predicción del riesgo de caries con resultados variables [1, 32]. La etiología polimicrobiana de caries dentales, así como la interacción entre las proteínas salivales y S. mutans
podrían contribuir a la variabilidad [30, 33]. Cuatro tipos principales de interacción proteína-microbio salival se han observado in vitro. Estos incluyen la agregación, la adhesión, la inhibición /mata las células, y la nutrición [33]. Se postula que el aumento observado en STLR-2 en caries saliva activo puede representar una medida de acogida para combatir el aumento de Gram + ve bacterias cariogénicas. Esto sugiere que el nivel salival STLR-2 puede representar un biomarcador eficiente para la actividad de caries. La amplia variación en la concentración STLR-2 en caries saliva activo podría ser debido a la extensión de la caries.
Conclusiones
La caries dental es una enfermedad compleja, la gravedad clínica de la que depende de la interacción entre los microbios orales, la disponibilidad de hidratos de carbono fermentables y de los factores del huésped en la saliva. Esto hace que la identificación de factores de riesgo predictivos para el proceso de caries muy difícil [5, 6]. En este informe se observó que dos proteínas solubles, sCD14 y STLR-2, que actúan en la interfase huésped microbiano se modifican en la saliva de caries activa con una tarde que representa un biomarcador potencial para la actividad de la caries. Los estudios futuros se correlacionan los STLR 2-niveles con los recuentos de bacterias cariogénicas en la saliva
abreviaciones
UWS:.
toda la saliva no estimulada
TLR:
Toll like receptor.
Declaraciones
Reconocimiento
los autores reconocen el apoyo proporcionado a Alyssa Zhao por la Indiana CTSI para completar el programa de investigación de verano.
autores original presentado archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los archivos originales presentados los autores de las imágenes. 'archivo original de la figura 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif autores 12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif Autores archivo original para la figura 2 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen ningún interés en competencia contribuciones de los autores
AZ:. Alyssa es un alto estudiante de segundo año de la escuela que lleva a cabo los experimentos de ELISA como parte del programa de becas de investigación de verano, la Semilla del proyecto, co-patrocinado por la Sociedad Americana de química clínica y el Instituto de Ciencias Translations Indiana. Ella también escribió el primer borrador de la sección "Antecedentes". CB: Corinne es un asistente de investigación de pregrado que ayudó a Alyssa en la realización de los experimentos de ELISA, más aún en el análisis de datos. Participó activamente en el procesamiento de muestras. También participó en la escritura manuscrita. JC: Dr. Chin es el dentista pediátrico y asistido en el reclutamiento de la población de estudio y recogida de muestras. MS: es el investigador principal del proyecto, incluyendo la supervisión de obtener la aprobación ética, el diseño experimental y el análisis de datos y preparación de manuscritos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
