Abstract
Antecedentes
La inflamación en la cavidad oral se produce debido a la desregulación entre biopelículas microbianas y la respuesta del huésped. La comprensión de cómo diferentes productos de higiene oral influyen sobre las propiedades inflamatorias es importante para el desarrollo de nuevos productos. Por lo tanto, la creación de una plataforma de biopelículas huésped-patógeno robusta capaz de evaluar nuevos compuestos de la salud bucal es una opción atractiva. Por lo tanto, realizamos un modelo de biopelícula de co-cultivo de múltiples especies para evaluar el resveratrol de origen natural de polifenoles (RSV) y el oro clorhexidina estándar (CHX) con respecto a anti-biopelícula y propiedades anti-inflamatorias.
Métodos
Un en
vitro de múltiples especies de biopelículas que contiene S. mitis, F. nucleatum, P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans
fue creado para representar una biopelícula asociada a la enfermedad y la célula epitelial oral en OKF6-TERT2. estudios de citotoxicidad se realizaron mediante el VRS y CHX. biofilms Multi-especies fueron tratados con cualquiera de molécula, o, alternativamente, las células epiteliales fueron tratados con estos antes de biofilm co-cultivo. composición Biofilm se evaluó y respuestas inflamatorias cuantificarse a nivel transcripcional y la proteína.
Resultados
CHX era tóxico para las células epiteliales y las biopelículas de especies múltiples en concentraciones que van 0,01-0,2%. RSV no afectó la composición del biofilm de múltiples especies, pero era tóxico para las células epiteliales a concentraciones superiores a 0,01%. En co-cultivo, las biopelículas tratados con CHX dieron lugar a la regulación negativa de la quimiocina inflamatoria IL-8, tanto a nivel de ARNm y proteínas. células epiteliales RSV tratados en co-cultivo se redujeron reguladas en la liberación de la proteína IL-8, pero no ARNm.
Conclusiones
CHX posee propiedades bactericidas potentes, que pueden afectar mediadores inflamatorios aguas abajo. RSV no parecen tener propiedades bactericidas contra las biopelículas de especies múltiples, sin embargo, parecía suprimir las células epiteliales de la liberación de mediadores inflamatorios. Este estudio demuestra el potencial para entender los mecanismos por los que diferentes productos de higiene oral pueden influir en la inflamación gingival, validando así el uso de un modelo de co-cultivo de biopelículas.
Palabras clave
celular epitelial enfermedad periodontal Biofilm material complementario Electrónico
la versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-80) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
la enfermedad periodontal se produce a partir de una desregulación entre el bacteriana. biofilm en el margen de las encías y la respuesta inmune, lo que resulta en la destrucción irreversible de ambos tejidos blandos y duros de soporte de los dientes, en última instancia conduce a la pérdida de dientes. En materia de salud, las moléculas inmune innata y adaptativa median el equilibrio entre el huésped y las suspensiones predominantemente Gram positivas heterogéneos de bacterias en la saliva y las comunidades de biopelículas en las superficies adherentes tejido blando y duro a lo largo de la cavidad oral. En la enfermedad periodontal el cambio en la microbiota de bacterias Gram positivas Gram especies negativas conduce a una respuesta del huésped mal regulada tanto de los tejidos locales y células del sistema inmune que induce la inflamación y crea un nicho en la raíz para las especies anaerobias para sobrevivir, lo que agrava aún más la enfermedad [1 ]
. Numerosas especies procariotas han sido identificados dentro de la cavidad oral existente dentro de los ecosistemas biofilm complejos ya sea como supra o placa sub-gingival. Muchos están sin cultivar y sin nombre, pero todos importantes funciones estructurales y funcionales que juegan [2]. estudios de microarrays y secuenciación de próxima generación de la microbiota oral ha permitido la clasificación de algunas especies de bacterias en los complejos basados en asociaciones con la salud y la enfermedad [3, 4]. Estos han permitido estudios para investigar las especies, tales como la enfermedad asociada a la bacteria Porphyromonas gingivalis
, y comprender su papel en impugnar la respuesta del huésped [5]. Sin embargo, las biopelículas orales son complejos y dentro de estas estructuras de biopelícula polimicrobianas se producen un gran número de interacciones íntimas, lo que hace difícil delinear los factores desencadenantes precisas para los resultados patógenos asociados con la desregulación inmune. Por lo tanto, la creación de un modelo simplificado con varios de estos patógenos clave es una propuesta atractiva para evaluar las interacciones huésped-patógeno y activos de ensayo para el tratamiento potencial de
tratar la enfermedad periodontal es difícil.; dentistas realizan desbridamiento en los dientes, enjuagues bucales administración de antimicrobianos para orientar las biopelículas y en la periodontitis avanzada, cirugía. Sin embargo, los éxitos del tratamiento son variables y de forma individual y sugiriendo composición del biofilm pueden influir en el resultado del tratamiento [6]. enjuagues bucales antimicrobianos empleados en la actualidad para gestionar enfermedades orales incluyen una variedad de compuestos con clorhexidina (CHX) de ser considerado el "patrón oro" debido a su propiedades bactericidas y bacteriostáticos [7]. Además, los polifenoles, que se encuentran de forma natural en las plantas, tales como las uvas se han convertido en un foco de terapias orales debido a sus propiedades anti-inflamatorias y anti-bacterianas [8]. Resveratrol (VRS) es un polifenol de origen natural, que se ha demostrado que tiene propiedades anti-inflamatorias potentes en una variedad de células de cáncer y, recientemente, la periodontitis en ratas [9, 10].
Tanto CHX y RSV tienen propiedades deseables para periodontitis prevención, siendo antimicrobiano o antiinflamatorio y antimicrobiano, respectivamente. El propósito de este estudio fue, por tanto, para crear y validar un modelo de biopelícula de múltiples especies para ser utilizado en co-cultivo con células epiteliales anfitrión con el fin de probar los activos CHX y RSV con el fin de validar si el modelo de sistema podría ser utilizado como una método sensible de delinear sus modos básicos de actuación. Aquí mostramos que las células epiteliales orales producen una respuesta proinflamatoria reproducible en nuestro biopelícula de múltiples especies, tanto a nivel genético y proteínas. Además, el tratamiento de cualquiera de las células epiteliales o biofilms de especies múltiples con activos resultó en una alteración de la inflamación en el modelo de co-cultivo.
Métodos
crecimiento y la normalización de las bacterias
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277
, Fusobacterium nucleatum
ATCC 10953, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
ATCC 43718 y Streptococcus mitis
ATCC 12261 se utiliza en el curso de estos estudios. P. gingivalis ATCC 33277
y F. nucleatum
ATCC 10596 se cultivaron a 37 ° C en caldo de Schaedler anaerobio (Oxoid, Cambridge, Reino Unido) durante 2 días y 1 día, respectivamente, en una cámara anaeróbica (85% N
2, 10% de CO 2 y el 5% de H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Reino Unido]). A. actinomycetemcomitans
ATCC 43718 y Streptococcus mitis
ATCC 12261 se cultivaron a 37 ° C en caldo de soja tríptico (Sigma, Poole, Reino Unido) suplementado con 0,8% w /v de glucosa (BDH, Poole, Reino Unido) y 0,6 % w /v extracto de levadura (Oxoid, Cambridge, Reino Unido) durante 1 día en 5% de CO 2. Las bacterias se lavaron con PBS y luego normalizado para un OD 550 de 0,2, con excepción de S. mitis
, que fue normalizado para un OD 550 de 0,5, en un colorímetro para obtener aproximadamente 1 × 10 < sup> 8 ufc /ml de cada especie bacteriana en su día de uso especificado.
compuestos activos
clorhexidina (CHX [Sigma]) y el resveratrol (RV [Sigma]) se utilizan en todo este estudio. solución CHX se preparó a 0,01, 0,05 y 0,2% v /v en el suero de queratinocitos libre de los medios de comunicación (KSFM) y se utiliza para pruebas antimicrobianas posterior. polvo de RSV se solubilizó en ddH 2O antes de la preparación en KSFM a 0,01, 0,05 y 0,5% v /v y se utiliza para estudios de estimulación celular subsiguiente.
formación de biopelículas de especies múltiples
Las bacterias fueron estandarizadas (1 × 10 7 ufc /ml) en saliva artificial (AS), que contenía los siguientes componentes, como se describe anteriormente [11]. Esto incluyó las mucinas porcino estómago (0.25% w /v), cloruro de sodio (0,35 w /v), cloruro de potasio, cloruro de calcio dihidrato (0,02 w /v), extracto de levadura (0,2 w /v), (0,02 w /v) polvo de BAL Lemco (0,1 w /v), peptona proteosa (0,5 w /v) en ddH 2O (Sigma, Poole, UK). después se añadió urea a independientemente a una concentración final de 0,05% (v /v). Para iniciar el desarrollo de múltiples especies de biopelículas la especie pionera S. mitis
biofilm se forma en primer lugar durante 24 h en 5% de CO 2 en 13 mm de diámetro cubreobjetos Thermanox ™ en placas de 24 pocillos (Corning, NY, EE.UU.). El sobrenadante se retiró y se añadió nucleatum
F., que se incubó anaeróbicamente a 37 ° C durante otras 24 h. El sobrenadante se retiró y P. gingivalis
y A. actinomycetemcomitans
añade a la biopelícula especies dual, que se incubó anaeróbicamente a 37 ° C durante 4 días, reemplazando el AS diaria para producir un cuatro especies mixtas biofilm (Figura 1A). Figura 1 El desarrollo de múltiples especies biofilm modelo de co-cultivo. A. protocolo de cultivo de biopelículas de múltiples especies. cubreobjetos Thermanox ™ se colocaron en placas de 24 pocillos para el cultivo de biofilm. Las bacterias se cultivaron en placas de agar adecuadas y se cultivaron en caldo durante 1-2 días. Los cultivos se lavaron tres veces en PBS y referido a 1 × 109 UFC /ml, añadido a la saliva artificial para hacer un /volumen final ml 1 × 108 UFC y se añade a la biopelícula en los días apropiados y se cultivaron en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Después de 7 días de cultivo saliva artificial se elimina de biofilms maduros que luego se lavaron con PBS y se almacenan a -80 ° C. B. Cesta colgante modelo de co-cultivo. biofilms Multi-especies se cultivaron en cubreobjetos Thermanox ™ y descritos anteriormente. Las células epiteliales (OKF6-TERT2) se sembraron en placas de 24 pocillos a 1 x 105 células /ml en medio de cultivo celular. Las biopelículas se adjuntan a la inversa de Millipore insertos de cultivo celular utilizando vaselina y se colocan sobre pocillos que contienen las células. Las células y las biopelículas se co-cultivaron durante 4 y 24 h.
El análisis cuantitativo de la composición del biofilm
-PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) se realizaron entonces para enumerar la composición definitiva y relativa de las biopelículas. Brevemente, las biopelículas bacterianas se eliminaron por tratamiento con ultrasonidos en un baño de ultrasonidos a 35 kHz durante 10 minutos, como se describe anteriormente [12]. Para qPCR se utilizó el sonicado biofilm para la extracción de ADN usando el MasterPure Gram Positivo ADN Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante, con la modificación de que el sonicado se incubó durante 4 h para asegurar la lisis celular. El ADN extraído se sometió a controles de calidad utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (Fischer Scientific, Loughborough). Brevemente, se añadió 1 l de ADN extraído a una mezcla maestra que contiene 12,5 l SYBR ™ más verde, 9.5 tratada con UV l RNasa libre de agua y 1 l de 10 mM cebadores adelante /atrás para cada especie bacteriana. Los cebadores utilizados fueron publicadas previamente, que se enumeran en la Tabla 1. Se analizaron tres repeticiones independientes de cada parámetro por triplicado utilizando la máquina MxProP PCR cuantitativa y el software MxProP 3000 (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). Las muestras se cuantificaron para calcular el equivalente de formación de colonias (CFE) en base a una curva estándar previamente establecido de unidades formadoras de colonias bacterianas que van desde 1 × 10 3-10 8 ufc /mL. Los R 2 valores para estas curvas estándar osciló desde 0,956 hasta 0,994. Melting análisis de la curva se realizó para todos conjuntos de cebadores para asegurar un solo pico, que era indicativo de la especificidad del cebador. arquitectura Biofilm se analizó posteriormente mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Por esta especímenes biofilm se lavaron en PBS, se fijaron en 2% para-formaldehído, 2% de glutaraldehído, 0,15% w /v azul Alcian en cacodilato de sodio 0,15 M (pH 7,4) [13]. Las muestras fijadas y secadas se recubren por pulverización catódica con oro y se observan bajo un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400 [14] .Tabla 1 Los cebadores utilizados para la PCR cuantitativa en este estudio
génica
adelante 5'-3 '
Invertir 5'-3'
Referencia
citoquinas
IL-8
CAGAGACAGCAGAGCACACAA
TTAGCACTCCTTGGCAAAAC
[15]
GAPDH
CAAGGCTGAGAACGGGAAG
GGTGGTGAAGACGCCAGT
[15]
Las especies bacterianas
S. mitis
GATACATAGCCGACCTGAG
CCATTGCCGAAGATTCC
[16]
F. nucleatum
GGATTTATTGGGCGTAAAGC
GGCATTCCTACAAATATCTACGAA
[17]
P. gingivalis
GCGCTCAACGTTCAGCC
CACGAATTCGCCTGC
[18]
A. actinomycetemcomitans
GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA
TGCAGCACCTGTCTCAAAGC
[19]
Desarrollo de un modelo de co-cultivo de biopelículas células epiteliales
OKF6-TERT2 (especie de regalo del laboratorio Rheinwald, Brigham y el hospital de la Mujer , Boston) son una línea inmortalizada humana por vía oral de células de queratinocitos [20] se utilizó a lo largo de estas investigaciones. células OKF6 se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) como se describe anteriormente [21]. Al 90% de confluencia se tripsinizaron las células, se lavaron en solución salina equilibrada de Hanks luego re-sembraron a aproximadamente 1 × 10 5 células /ml y se sembraron sobre un cubreobjetos Thermanox ™ dentro de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (Corning, NY, ESTADOS UNIDOS). Las células epiteliales se lavaron y luego sujetos a desafiar con biofilms invertidos, unidos usando Vaseline® a cuelgan insertos de cultivo celular (Millipore, MA, EE.UU.) como se ilustra en la Figura 1B. Los biofilms en los discos Thermanox ™ se separaron de las células epiteliales en la parte inferior del pozo por un pequeño espacio de & lt; 0,5 mm, representante de una grieta gingival. Multiespecies biofilms se incubaron en el modelo de co-cultivo durante 4 y 24 h y la viabilidad de las células epiteliales ± tratamientos activos (CHX y RSV) evaluó usando un ensayo metabólico de 10% v /v AlamarBlue®, de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( Life Technologies, Paisley, Reino Unido). Después de 4 h de incubación se leyó la absorbancia a 570 nm y la longitud de onda de referencia a 600 nm, y el porcentaje de reducción en la viabilidad biofilm calculada según la fórmula del fabricante.
Evaluación de los cambios inflamatorios durante biofilm de co-cultivo
sobrenadantes y lisados de células se obtuvieron de OKF6 /TERT2 células estimuladas con diferentes especies múltiples biopelículas, que se utilizaron para el análisis de proteínas y de la transcripción, respectivamente, para evaluar la regulación de los mediadores proinflamatorios. análisis de expresión génica inicial se llevó a cabo usando un diseño personalizado RT 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, Reino Unido). RT 2 matrices Profiler son un tiempo real SYBR ™ más verde basado en la PCR que permiten la detección de varios genes de interés, al mismo tiempo. Brevemente, el ARN se extrajo a partir de lisados celulares (Qiagen, Crawley, Reino Unido) y 55 ng /l de cDNA sintetizado usando el RT 2 primera hebra de ADNc kit de síntesis de (Qiagen, Crawley, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 24 l de una mezcla maestra que contiene más verde SYBR ™, ADNc sintetizado utilizando la RT 2 la primera cadena de kit (Qiagen) y RNasa libre de agua se añadió a cada pocillo de la placa de perfiles RT 2, que ya contenía los cebadores directo e inverso de los genes de interés (IL-1a, IL-1, IL-6, TNF, CSF2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 y GAPDH), sobre la base de una gingivitis experimental modelo [22]. Dos réplicas de cada condición se utilizaron en la RT 2 Profiler, que se llevó a cabo en dos ocasiones separadas.
Más la verificación se ha realizado mediante IL-8 expresión de genes analizados utilizando SYBR verde basada qPCR (Invitrogen), utilizando GAPDH como gen de mantenimiento. Las secuencias de cebador y las fuentes de referencia se enumeran en la Tabla 1. Todos los cebadores se ensayaron frente a cada especie bacteriana para asegurar la especificidad, que era el caso (datos no mostrados). El ARN se sintetiza en ADNc después se añadió a una mezcla maestra que contiene 12,5 l SYBR ™ más verde, con tratamiento UV 10,5 l de agua libre de RNasa y 0,5 l de cebadores directos /atrás. Tres repeticiones independientes de cada parámetro se analizaron por duplicado utilizando la máquina MxProP PCR cuantitativa y el software MxProP 3000 (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) y la expresión génica normalizada a la limpieza gen GAPDH según la -ΔΔCT
método 2 [23 ]. IL-8 liberación en los sobrenadantes del cultivo de células se evaluó por ELISA (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Los resultados se calcularon usando una curva de ajuste de 4 parámetros, cuantificar los cambios colorimétrico a 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Alemania).
El análisis estadístico
la producción de gráficos, la distribución de datos y análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 4; La Jolla, CA, EE.UU.). Después de evaluar si los datos se ajustaban a una distribución normal antes y después de las transformaciones de datos, análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y pruebas t
se utilizaron para investigar las diferencias significativas entre los grupos independientes de datos que se aproximan a una distribución de Gauss. Una corrección de Bonferroni se aplicó para el valor p para dar cuenta de comparaciones múltiples de los datos. Los datos no paramétricos se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney para evaluar las diferencias entre los dos grupos de muestras independientes. T de Student pruebas se utilizaron para medir las diferencias estadísticas entre los valores de Δ Ct
de los dos grupos independientes evaluadas en estudios de expresión génica, aunque los datos pueden ser representados como porcentaje o doble cambio en las figuras. La significación estadística se logra si P & lt; 0.05
.
: Resultados de la Análisis cuantitativo de un modelo de múltiples especies de biopelículas periodontal
sometió a ultrasonidos biopelículas de especies múltiples se cuantificaron por qPCR (Figura 2A). Se demostró que cuantitativamente que S. mitis
era la especie más dominante dentro del biofilm maduro (1,36 × 10 7 CFE /ml; 83,24%), Francia seguido por F. nucleatum gratis (2,28 × 10 6; 15,16%), P. gingivalis
(3,53 × 10 4; 1,01%) y A. actinomycetemcomitans gratis (1.13 × 10 5; 0,58%). La composición biofilm fue entonces examinada usando el análisis SEM. La biopelícula se demostró que era un complejo densa de diferentes morfotipos dominados por F. nucleatum
(Figura 2B y C). Figura 2 Análisis de las biopelículas de especies múltiples en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. biofilm Multi-especies se cultivaron en cubreobjetos Thermanox ™ en placas de 24 pocillos durante 6 días como se describió anteriormente. Después de la maduración Se extrajo el ADN utilizando el kit de purificación de ADN MasterPure ™ Gram-positivo para la cuantificación de cada especie utilizando SYBR® más verde ™ basado qPCR (A). morfología de la biopelícula se analizó mediante SEM en 2000x (B) y 5000x (C). Las muestras se procesaron y vieron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400 y las imágenes ensambladas utilizando software Photoshop. Las biopelículas pueden ser vistos por qué ser complejo (B). A mayores aumentos diferentes morfologías pueden ser identificados con S. mitis
y F. nucleatum
que constituyen la mayoría de la biopelícula (C). biofilms maduros también se cultivaron en medios de cultivo celular en 5% de CO2 durante 4 y 24 h antes de la extracción de ADN y la cuantificación de cada especie utilizando utilizando SYBR® más verde ™ basado qPCR (D). Todas las muestras se analizaron por triplicado en tres ocasiones distintas. Los datos son la media ± SD.
El fin de probar las biopelículas de especies múltiples en co-cultivo con células epiteliales, se analizó el impacto de mover el biofilm de las condiciones anaeróbicas dentro de AS al 5% de CO 2 en KSFM. Para ello se evaluó la composición del biofilm como se ha descrito anteriormente. No se observaron diferencias significativas en la composición y la cantidad de las 4 especies dentro del CO 2 biofilm a las 4 y 24 h (Figura 2D). Tampoco hubo diferencia significativa entre las 24 h biofilms formados en condiciones anaerobias y después se colocaron en los CO 2 durante 24 h. Estas biopelículas se utilizaron luego en un sistema de co-cultivo para investigar las propiedades biológicas de los dos agentes bioactivos diferentes.
La investigación de los efectos de los agentes bioactivos en un multi-especies biofilm las células epiteliales modelo de co-cultivo
En primer lugar, para optimizar las concentraciones de RSV y CHX a ensayar en este modelo hemos realizado pruebas de citotoxicidad en células tanto epiteliales y en las células epiteliales biofilms.Oral trataron durante 30 minutos con tres concentraciones de la CHX activa antimicrobiana (0,01, 0,05, 0,2% v /v ) y RSV activo anti-inflamatoria (0.01, 0.05, 0.5% w /v) antes de lavar con PBS y se incubaron durante 4 y 24 h antes de se midió la viabilidad celular evaluada usando un ensayo AlamarBlue®. Los datos mostraron una disminución significativa (p & lt; 0,001) en la viabilidad celular en comparación con los controles no tratados de medios de comunicación cuando se incuban células epiteliales con CHX a cualquier concentración para ambos 4 y 24 h (Figura 3A). Cuando las células epiteliales fueron co-cultivadas con RSV disminuciones significativas en la viabilidad celular en comparación con el control de los medios de comunicación se observaron usando 0,05 y 0,5% w /concentraciones v RSV tanto a 4 (p & lt; 0,001) y 24 h (p & lt; 0,01), con una disminución de aproximadamente 50% de la viabilidad celular en cada tiempo (Figura 3B) .A continuación, a partir de estos datos de las concentraciones tomadas adelante para el resto del estudio eran 0,2% v /v CHX y 0,01% w /v RSV. biofilms Multi-especies se trataron con las concentraciones elegidas de sustancias activas para 30 min y la viabilidad biofilm medidos utilizando un ensayo de AlamarBlue® (Figura 3C). Tratamiento de la biopelícula de múltiples especies con RSV no afectó significativamente la viabilidad de biopelícula en comparación con el control sin tratar biofilm. Sin embargo, el tratamiento con CHX mostró una reducción significativa (p & lt; 0,001) del 75% en la viabilidad de las bacterias en comparación con los no tratados biofilm.To determinar si el tratamiento con estos agentes activos alterado la composición de las especies de la biopelícula, que fueron tratados durante 30 min luego DNA extraída y cuantificación de cada especie realizadas por qPCR (Figura 3D). Los datos no muestran ningún cambio significativo en la composición después de un tratamiento de 30 min con CHX o RSV en comparación con el biofilm sin tratar. Para investigar más este efecto se realizó un análisis SEM para examinar el impacto de cada activo en la arquitectura de las biopelículas de post-tratamiento (Figura 3E-J). CHX apareció para desestabilizar el biofilm, como la complejidad de la biopelícula se redujo, mientras que RSV parecía tener ningún efecto visual en la arquitectura. Figura 3 Efecto directo de las sustancias activas en las células epiteliales orales y biofilms de especies múltiples. La línea de células epiteliales orales OKF6-TERT2 se sembró a 1 x 105 células /ml en placas de 24 pocillos para los estudios de toxicidad. Las células fueron tratadas con concentraciones de CHX (0,01, 0,05, 0,2% v /v) (A) y RSV (0.01, 0.05, 0.5% w /v) (B) durante 30 minutos antes de lavar con PBS. La viabilidad celular se evaluó usando el ensayo de AlamarBlue® con leyó la absorbancia a 570 nm y 600 nm. Después de esta concentraciones elegidas para el resto del estudio se CHX 0,2% (v /v) y RSV 0,01% (w /v). Para investigar el papel de los activos en las biopelículas de tratamiento de biopelícula se cultivaron en cubreobjetos en placas de 24 pocillos durante 6 días como se describió anteriormente. biopelículas maduras se trataron con 0,2% v /v CHX y 0,01% w /v RSV durante 30 minutos antes de lavar con PBS. viabilidad Biofilm se midió utilizando AlamarBlue® leyó a 570 nm y 600 nm (C). El ADN bacteriano fue extraído y cada especie cuantificó utilizando SYBR qPCR más verde ™ basada (D). Las biopelículas también se analizaron mediante SEM en tanto 2000x (E, G, I) y 5,000 × (F, H, J). Las muestras se procesaron y vieron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400 y las imágenes ensambladas utilizando software Photoshop. biofilms no tratados (E, F) se compararon con las biopelículas tratados con 0,2% (v /v) CHX (G, H) y y 0,01% (w /v) de RSV (I, J). Las muestras fueron analizadas por triplicado en tres ocasiones separadas y los datos son la media ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
A continuación, se evaluaron los efectos de la biopelícula no tratada de múltiples especies estimulado OKF6 células para asegurar la biopelícula inducida por mediadores inflamatorios. El uso de la RT 2 perfiles se compararon las células del biofilm estimulado a las células de control de medios de comunicación después de 4 h para determinar las características inflamatorias del modelo (Tabla 2). Se observaron incrementos significativos para todos los genes sobre la RT 2 perfilador selecciona en base a su expresión durante la gingivitis experimental inducida en sujetos humanos, que van desde 4,39 veces el cambio (CCL1) a 249,8 veces el cambio (IL-8), con una media doble cambio de 60 en comparación con el control de los medios de comunicación no estimulada. Estos datos fueron verificados mediante la investigación de IL-8 usando cebadores específicos dentro de un ensayo de transcriptasa inversa (RT) qPCR (Figura 4B). Un aumento significativo se observó un cambio de 15,57 veces (p & lt; 0,001) después de 4 h y 312,88 cambio veces (p & lt; 0,001) después de 24 h en comparación con el control de medios (Tabla 2). Por último, se evaluaron los sobrenadantes de las células para la liberación de IL-8 dentro de este sistema, en donde se demostró que después de 4 h (535 ng) y 24 h (450 ng) que la IL-8 liberación fue significativamente mayor (p & lt; 0,001 ) en comparación con los controles no tratados medios de comunicación (Figura 4C). Sobre la base de estos datos colectivos, hemos demostrado que la biopelícula 4-especie tiene propiedades inflamatorias reproducibles dentro de un epitelio de co-cultivo model.Table 2 respuesta proinflamatoria de biopelículas no tratados
génica
aumento promedio pliegue
SD (±) guía empresas Importancia
IL-1
10.820
8.918
p & lt ; 0,05
IL-1B
12.662
1.161
p & lt; 0,05
IL-6
31.876
2.366
p & lt; 0,001
TNF
48.821 24.623
p & lt; 0,001
CSF-2
59.200 28.294
p & lt; 0.001
CSF-3
43.331 37.126
La P & lt; 0,001
IL-8
249.805
189,93
p & lt; 0,001
CXCL1
121.892
56.676
p & lt; 0,001
CXCL3
63.843 26.213
p & lt; 0.001
CXCL5
14.435
14.474
n/s
CCL1
4.397
4.629
n/s
Figura 4 CHX y RSV immunomodulate respuestas de las células epiteliales a múltiples especies de biopelículas co-cultivo in vitro. La línea de células epiteliales orales OKF6-TERT2 se sembró a 1 × 105 células /ml en placas de 24 pocillos para co-cultivo con las biopelículas de especies múltiples. Biofilm fueron pre tratado con 0,2% (v /v) CHX o células se trataron con 0,01% (w /v) RSV durante 30 minutos antes de lavar con PBS y después se co-cultivaron con biopelículas no tratadas o células, respectivamente, para 4 y 24 h. También se incluyeron control sin tratar de co-cultivo. Se extrajo ARN de los lisados de células a las 4 h, se sintetizó ADNc y la expresión de genes pro-inflamatoria cuantificó en una placa de perfiles RT2 (A). Las muestras duplicadas de tres experimentos independientes y se utilizaron los datos son la media ± desviación estándar relativa al control de los medios de comunicación. Las muestras también se analizaron para IL-8 con respecto a la limpieza GAPDH gen a las 4 y 24 h utilizando utilizando SYBR® más verde ™ basado qPCR (B). Los sobrenadantes se analizaron también para exógena de IL-8, medida por ELISA (C). Las muestras se ensayaron por triplicado a partir de tres experimentos independientes, los datos son la media ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
A continuación, determinamos cómo el tratamiento de la inflamación CHX biofilm afectados. El modelo de co-cultivo se utilizó con biofilms tratados con 0,2% CHX durante 30 min. A raíz de co-cultivo lisados de células epiteliales y se eliminaron los sobrenadantes a ensayar para el aumento de genes y marcadores inflamatorios proteínas. Un biofilm sin tratar y células epiteliales no co-cultivadas con la biopelícula de múltiples especies se utilizaron como controles. Después de 4 h de co-estimulación con las biopelículas CHX tratados que no mostró diferencias significativas en la expresión de genes utilizando la RT 2 perfilador, aunque la IL-8 y CXCL1 se redujeron notablemente (Figura 4A). El análisis adicional de IL-8 mediante qPCR de nuevo no mostró ninguna diferencia significativa en la expresión a las 4 h, mientras que a las 24 h se observó una disminución significativa de 5,65 veces en la CHX tratada células del biofilm estimulados (p & gt; 0,001) (Figura 4B). IL-8 expresión de la proteína también se midió a las 4 y 24 h por ELISA. Una reducción significativa (p & lt; 0,001). Se observó de la proteína IL-8 en 4 h (10 veces) y a las 24 h (13 veces) en comparación con el control no tratado (Figura 4C)
Finalmente, se evaluó la efecto de RSV trató las células epiteliales en el modelo de co-cultivo. Las células epiteliales se trataron durante 30 min con RSV, se lavaron y co-incubaron con biopelículas no tratados para 4 y 24 h. El generador de perfiles RT 2 no mostró diferencias significativas en la expresión génica después de 4 h en comparación con las biopelículas no tratadas (Figura 4A). El análisis adicional de IL-8 a las 4 y 24 h también mostró diferencias significativas en los niveles de expresión (Figura 4B). Sin embargo, una disminución significativa de IL-8 niveles de proteína en 4 h se observaron cuando se compara con el modelo de biofilm sin tratar de co-cultivo (Figura 4C (25 veces; p & lt; 0,001) y 24 h (0,01 13 veces;; p & lt) )
. Discusión
Uso experimental in vitro
modelos de biopelícula para investigar las interacciones entre las biopelículas y el anfitrión de las células epiteliales es esencial para entender los mecanismos de la patología de la enfermedad y cómo activos pueden influir en la respuesta del huésped. El uso de este modelo de biopelícula de especies múltiples a medida que hemos demostrado que la respuesta inflamatoria epitelial a biopelículas de especies múltiples puede ser alterada en presencia de compuestos antimicrobianos y anti-inflamatorias.
Los datos muestran co-cultivo de células epiteliales y sin tratar múltiples -especies biofilms producen un aumento significativo en ambos genes y la expresión de proteínas a las 4 y 24 h. los niveles de proteína IL-8 se incrementaron significativamente en ambos 4 y 24 h en co-cultivo de células epiteliales y las biopelículas de especies múltiples no tratados en comparación con las células de control solamente. Además, los aumentos en la expresión de genes de una variedad de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias, incluyendo IL-6, IL-8, TNF, CSF-2, CXCL1 y CXCL3 a las 4 h en comparación con las células sólo se observaron control. Estos cambios dinámicos en los mediadores pro-inflamatorios demuestran que hay interacción entre el complejo de biofilm y las células epiteliales. Sin embargo.
