.
Resumen Antecedentes
Este estudio tiene como objetivo observar las características morfológicas e identificar las características de la función de epitelio de unión (EJ) tejidos y células cultivadas JE
Métodos
secciones de parafina de molares y premolares humana en el lado bucolingual gingival se preparan a partir de 6 sujetos. Tinción HE y análisis de imágenes se realizaron para medir y comparar la diferencia morfológica entre JE, epitelio bucal gingival (OGE) y el epitelio del surco (SE). La inmunohistoquímica se aplica para detectar el patrón de expresión de citoqueratina 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, y 20 en JE, OGE y SE. Por otro lado, las células JE y OGE humanos primarios se cultivaron in vitro. Identificar celular fue confirmado por histología e inmunohistoquímica. En un modelo de co-cultivo, TEM se utilizó para observar la formación de unión entre las células JE y la superficie del diente.
Resultados
JE humano era un tejido único, que era diferente de la SE y en la morfología de la OGE. Del mismo modo, la morfología de las células JE también se comparó en particular con las células cultivadas in vitro OGE. Además, las células JE tuvieron un período de incubación más largo que las células OGE. Diferente expresión de varios CK ilustra JE estaba en una característica de baja diferenciación y regeneración de alta. Después de estar co-cultivaron durante 14 d, capas de células múltiples, fueron aparecido en la unión de la membrana celular y la superficie del diente JE membrana basal-como las estructuras y hemidesmosome similares.
Conclusiones
JE es un epitelio estratificado especialmente con baja la diferenciación y la alta capacidad de regeneración en el tejido gingival tanto in vivo como in vitro. En el modelo de co-cultivo, las células JE humanos pueden formar estructuras de la membrana basal-like y hemidesmosomas-al igual que en aproximadamente 2 semanas.
Palabras clave
juntural epitelio gingival oral epitelio citoqueratina inmunohistoquímica Co-cultura electrónica material complementario sobre The en línea versión de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-30) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
gingival epitelio consiste en tres regiones:. epitelio gingival oral ( OGE), epitelio del surco (SE) y juntural epitelio (JE). JE es un epitelio gingival especializado localizar en la unión de tejido blando periodontal y el tejido duro, y adjuntar a la corona o raíz como un collar. células JE son uniformes en forma (ya sea plana o husillo) y alineadas en paralelo a la superficie del diente, que contiene grandes espacios intercelulares debido a uniones celulares relajado [1]. Como una estructura especial en el cruce dentogingival, JE es diferente de otros epitelios (OGE, SE) en origen, morfología celular, proliferación y diferenciación [2, 3]. Mientras tanto, se ha informado de que JE es crítica para mantener la integridad del tejido periodontal [4, 5] y es un área clave para el inicio primaria de las enfermedades periodontales y tratamientos [6]. Además, se encontró neutrófilos a-defensinas para localizar en el epitelio de unión, que tiene efectos significativos sobre la integridad epitelial y en funcionamiento (la adhesión de los queratinocitos, difusión y proliferación), y los efectos son más allá de sus actividades antibacterianas [7]. Sin embargo, todavía no está claro y controvertido sobre JE en la diferenciación, la actividad fagocítica, mecanismo de su apego a la superficie del diente, la reparación y el mecanismo de reconstrucción después de la lesión [5, 8]. México La procedimientos histológicos convencionales para la investigación de JE in vivo son simplistas en el enfoque y limitado en el intervalo de observación [9-12]. En los últimos años, los investigadores han estudiado la JE utilizando en los modelos de cultivo celular in vitro y técnicas citológicas moleculares utilizando células epiteliales orales [13-16] Las células OGE humanos animal y /o, las células epiteliales del ligamento periodontal y. Aunque estas células son células epiteliales orales, que no pueden modelar células primarias JE completamente debido a diferencias en la fuente, morfología, estructura, la diferenciación y los estímulos que inducen la proliferación.
Citoqueratinas (CK) son proteínas de filamentos intermedios de la familia citoesqueleto y son la principal proteínas estructurales en las células epiteliales. Como sabemos, la expresión de queratinas es una de las características definitivas de las células epiteliales y refleja las propiedades biológicas de las células epiteliales, incluyendo su origen, el desarrollo, el tipo histológico y grado de diferenciación [17, 18]. Varias investigaciones han estudiado la expresión y distribución de una variedad de CK (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) en los tejidos periodontales de los seres humanos y los animales, y la expresión de algunos queratinas en el epitelio gingival se determinó [15, 19-21]. Por ejemplo, los patrones de expresión de CK10 /13, 16, 19 en JE eran diferentes de la de OGE y SE; El especialmente alta expresión de CK19 en todas las capas de JE hizo se convirtió en un marcador histológico característico de JE in vivo [3, 22-24]. Sin embargo, las expresiones de los diversos tipos de citoqueratina en JE y la diferencia con OGE y SE no se han reportado de manera sistemática.
En este estudio, las características morfológicas de los tejidos JE fueron examinados por observación histológica, análisis de imágenes e inmunohistoquímica. La expresión y la distribución de una variedad de CKs se determinaron en los tejidos JE y se comparan con OGE y SE. Además, las células JE y OGE primarios se cultivaron. Se observó la estructura y el crecimiento patrón morfológico de las células JE y OGE primarias y las expresiones de las queratinas específicas (CK-pan, 19, 10/13, 16) también se detectaron mediante inmunohistoquímica. Sospechamos para identificar las propiedades biológicas únicas (morfología, potencial de regeneración) de JE in vivo e in vitro. Además, las células humanas cultivadas JE se sembraron directamente sobre las rebanadas de raíz humanos en una cultura material compuesto con el fin de explorar el proceso de JE nuevo adjunto. Esto proporcionaría evidencia experimental para el estudio adicional de cómo una nueva inserción se produce después de la cirugía periodontal y la formación de la cicatrización del tejido alrededor del implante en la clínica.
Métodos
características morfológicas de los tejidos gingivales humanos epitelio
muestras gingivales humanos fueron aislados a partir de muestras de mandíbula de cuatro dos pacientes de sexo femenino con el ameloblastoma mandibular y masculinos. Eran los no fumadores sin ninguna otra enfermedad. El sitio de la edad y el muestreo fue lista en la Tabla 1. Una cirugía ablativa se llevó a cabo en el departamento de patología oral en la IX Personas Hospital afiliado a la Universidad de Shanghai Jiao Tong entre septiembre y octubre de 2010. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética local y el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. molar o premolar inferior y los tejidos gingivales distantes del sitio del tumor con morfología gingival normal fueron seleccionados por la observación clínica. Además, las muestras de menos de 3 mm de profundidad detectada por sondaje periodontal se recogieron y se fijaron en formaldehído al 10% a temperatura ambiente durante 24 h. Las muestras se colocaron en Plank-Rychlo descalcificación solución (70 g de AlCl
3, 56 ml de ácido fórmico, 85 ml de ácido clorhídrico y agua destilada añadida a 1 L) durante 2 semanas después de que se corte vertical a la eje largo del diente a lo largo del lado bucolingual usando una sierra de mano. Por último, varias secciones gruesas 5 mm de los dientes y tejidos gingivales en el centro del diente se obtuvieron de cada muestra. A continuación, estas secciones se sometieron a deshidratación de etanol y embebidos en parafina. Se seleccionaron tres bloques de parafina al azar de cada espécimen y en serie seccionaron a 4 micras. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) y se observaron al microscopio óptico. El ancho, espesor, área de la JE y la anchura de la SE en el lado bucal se midieron mediante axioplan imagen 2 dimensiones de análisis system.Table 1 medidos en JE humana y se
muestra n.
Edad
sitio de muestreo
Ancho de JE (mm) Espesor de
JE (mm) guía empresas Área de JE (mm2) guía empresas Ancho de SE (mm)
1
21
Premolar
1.135
0.069
0.047
0.325
1.134
0.066
0.045
0.321
1.133
0.064
0.043
0.334
2
28
Molar
1.113
0.062
0.043
0.308
1.102
0.066
0.044
0.303
1.120
0.065
0.044
0.323
3
31
Molar
0.850
0.058
0.041
0.563
0.845
0.059
0.041
0.565
0.847
0.060
0.041
0.554
4
28
Molar
0.838
0.052
0.038
0.550
0.844
0.055
0.040
0.552
0.858
0.056
0.040
0.543
5
33
Premolar
1.105
0.083
0.043
0.785
1.108
0.083
0.043
0.801
1.105
0.083
0.041
0.808
6
38
Premolar
1.081
0.069
0.041
0.625
1.072
0.065
0.038
0.667
1.078
0.069
0.040
0.644
Mean
1.021
0.066
0.042
0.532
Standard desviación
0,128
0.009
0.002
0.176
O muestra 2, 3 eran mujeres y la izquierda eran varones .
debido a la separación de JE con la superficie del diente después de la descalcificación, el límite entre JE y sE se determinó de acuerdo con las crestas epiteliales, la queratinización, la morfología celular y la tinción. De acuerdo con el método de proyección, líneas perpendiculares fueron extraídas de margen libre de la SE, cruce de la JE y SE, y la parte de la raíz de la mayoría JE hacia la superficie del diente, respectivamente. Las longitudes de proyección de SE y JE sobre la superficie del diente se midieron como sus anchuras. Una línea perpendicular se dibuja en la parte más gruesa de JE y la distancia entre los dos puntos de intersección de la línea perpendicular y el epitelio se midió como el espesor de JE. Una curva se extrae de la parte de raíz la mayor parte de la JE a su cruce con SE incluyendo toda la región y el área JE (Figura 1). Figura 1 Esquema descripción de la medición JE y SE. A. SE ancho; anchura B. JE; C. espesor JE; D. JE zona.
JE humana y la OGE de cultivo de células
Para el cultivo de células y JE OGE in vitro, las incisiones de 2 mm de longitud se hace a lo largo bucal y gingival marginal lingual. Cinco dientes sanos y erupcionado por completo fueron retirados junto con los dientes de ortodoncia o afectado (12 a 25 años, buena salud bucal y la encía sana clínica). Los dientes junto con la encía marginal incisa se retiraron. La encía libre (incluyendo la OGE y SE) se cortó lo más posible macroscópicamente. tejidos JE firmemente unidos al cuello del diente (no la raíz) se rasparon de la superficie del diente (figura 2), y se lavaron mediante una solución de D-Hank que contiene antibióticos dobles de penicilina-estreptomicina. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Zhongshan (n: 2009-173). Figura 2 muestras JE. A. estalló Eliminar totalmente diente impactado con la encía marginal; B. Corte el exceso de encía libre (incluyendo la OGE y SE); C. Permanecer JE tejido en el cuello del diente; D. obtener tejido JE raspando en el cuello del diente; E. extracción de tejidos JE; F. cuello del diente suave después de raspar.
En cultivo primario, tejidos JE se digirieron con 2 ml de solución de trabajo DispaseII a 4 ° C durante 16-18 horas. El epitelio fue separado de la lámina propia por pinzas, y luego se corta en piezas, se digirieron con 4 ml de 0,025% de tripsina-EDTA al 0,01% durante 5-8 minutos con agitación. La digestión se terminó por adición de solución de D-Hank que contiene 10% de FBS, seguido de filtración usando 180 micras de tamiz de acero inoxidable y después de la centrifugación. Los precipitados se mezclaron en (medio de crecimiento de queratinocitos definido) DKGM para formar la suspensión celular. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a 2 x 10 5 células /ml, y se colocan en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. El medio se renovó después de 3 días por primera vez, a continuación, una vez al día. En la cultura paso, las células se pasaron a 60-70% de confluencia mediante la adición de 0,25% de tripsina-EDTA al 0,02% a 37 ° C durante 5-8 min. Cuando las células aparecían redondeados bajo un microscopio, se terminó la digestión. A continuación, se suspendieron las células y se centrifugaron. DKGM se añadió para formar la suspensión de células, y se dispensa en nuevos platos de petri. Por otro lado, las células se trataron OGE como células JE anteriores. Con otras palabras, el tejido OGE fue cortado en pequeños trozos de 5 x 5 mm 2. La suspensión de células OGE se sembró a densidades que van desde 5 hasta 10 × 10 5 células /ml en placas de Petri de 60 mm de diámetro. Se observaron las células cultivadas diariamente usando microscopio de contraste de fase invertida para realizar un seguimiento de su morfología y condiciones de crecimiento. Además, la suspensión de células individuales passaged se inoculó a densidades que van desde 2 hasta 5 × 10 a partir de 5 células /ml en cubreobjetos en placas petri estériles. Después se trató con H & amp; E tinción cuando las células fueron cultivadas a 60% de confluencia, y se observaron utilizando un microscopio de luz para seguir los cambios en la morfología y la estructura de la curva
el crecimiento celular en células JE y OGE
primaria JE, las células OGE. a 100% de confluencia fueron digeridos para formar suspensión de células individuales y se sembraron a una densidad de 2 × 10 placas 4 /cm 2 en 24 pocillos. Las células en dos pozos aleatorios se contaron diariamente utilizando un hematocitómetro. Una curva de crecimiento de las células se representó por el número promedio de células cada día frente al número de días. Se obtuvo el tiempo de duplicación de la curva de crecimiento que podría indicar la longitud de tiempo requerido para que las células dobles en número durante la fase logarítmica. Inmunohistoquímica análisis
de tejidos gingivales humanos epitelio y células cultivadas in vitro
inmunohistoquímica estreptavidina conjugada con peroxidasa método (SP) se realizó en el tejido gingival humano por incubación con anti-CK 5/6 (clon D5 /16B4), anti-CK 7 (OV-TL12 /30), anti-CK 8/18 (clon Zym5.2) , anti-CK 10/13 (clon DE-K13), anti-CK 16 (LL025 clon), anti-CK 17 (E3 clon), anti-CK 19 (clon A53 /BA2) y anti-CK 20 (KS20 clon 0.8). Estos anticuerpos monoclonales anti-citoqueratina humanos se obtuvieron de Zymed (U.S.A). tejido de la glándula parótida humana se tiñó como control positivo [25] y el anticuerpo primario sustituido por PBS se utilizó como control negativo. El procedimiento de tinción inmunohistoquímica se realizó por las instrucciones del fabricante Ab. Simplemente, secciones desparafinados se incubaron con solución de pepsina a 37 ° C durante 5 a 10 min, y se incubaron con suero de bloqueo a temperatura ambiente durante 30 min. anticuerpo primario a dilución 1:50 se añadió en el grupo de estudio y el control positivo. PBS en lugar del anticuerpo primario se añadió en el control negativo. Después de ser incubadas a 4 ° C durante la noche, las secciones se incubaron en la solución de trabajo con biotina anticuerpo secundario marcado a temperatura ambiente durante 30 min, y siguieron con peroxidasa de rábano picante marcado solución de estreptavidina a temperatura ambiente. Se añadió solución de cromógeno DAB durante 5-10 minutos. Las secciones fueron lavadas con agua corriente, re-tiñeron con hematoxilina y se montaron. Por otro lado, las células a pases adheridas a cubreobjetos se fijaron usando 10% de formalina neutral. Las células se trataron como JE tejidos anteriormente. En estas células, CK-Pan, CK19, CK10 se detectaron /13 y CK16. El citoplasma de las células positivas CK estaba manchada y se clasificó como negativo (-) sin colorear, débilmente positivo (+) con el colorante de, luz amarilla positiva moderada (++) con el colorante de color amarillo o positivo fuerte (+ + +) con coloración de marrón [26]. & Co-cultivo de células humanas y JE raíz rebanadas
dientes rebanadas eran de las mismas muestras reclutados para las células primarias JE. Las muestras se imbricadas chatarra con una cureta Gracia para eliminar la membrana periodontal. Ellos fueron fijadas en 10% formalina neutra durante 12 h, y descalcificadas usando solución de descalcificación Plank-Rychlo durante 2 semanas. Las coronas dentales se retiraron y los dientes fueron seccionados a lo largo de la superficie de la raíz en las películas dentales de 5 x 5 mm 2 de tamaño y de 1-1,5 mm de espesor. Las películas se lavaron durante 2-3d y se sumergen en solución de D-Hank que contiene antibióticos dobles penicilina-estreptomicina a 4 ° C antes de su uso. La células JE suspensión mediante pasajes humana se inoculó a una densidad de 5 × 10 5 células /ml en las rodajas de raíz con el cemento de superficie en placas de 24 pocillos, de 2 a 3 rebanadas por pocillo, y se colocan durante 14 días en a 37 ° C 5% de CO 2 saturación de humedad incubadora. El medio fue refrescado 3 d más tarde, y luego una vez al día
Observación mediante TEM:. Rodajas de raíz se recogieron 3, 5, 7, 9, 11, y 14 días después de la inoculación, respectivamente, y se fijaron en glutaraldehído al 2% a 4 ° C durante 2 h. rebanadas de raíz, con el cemento superficie hacia arriba, se cortaron en pequeños trozos de 5 × 1 × 1 mm, después de la fijada en ácido ósmico al 1% a 4 ° C durante 2 h, se deshidrataron con etanol, empapado por óxido de propileno a temperatura ambiente durante 24 h, y se incluyeron en Araldite. Las muestras incrustadas se cortaron en rodajas de ultra fino, que se tiñeron con citrato de plomo, seguido de la observación utilizando TEM (PHILIP CM-120, Holanda) para realizar un seguimiento de la formación de células JE unión a la superficie del cemento.
Resultados
morfológica análisis de los tejidos gingivales humanos epitelio
Bajo el microscopio, JE fue corta y en forma de tira, se espesó gradualmente desde la unión cemento-esmalte a la corona. Después se tiñeron con HE, sin queratinización o crestas epiteliales existían en el tejido JE que se dividió en capa basal y la capa suprabasal, mientras que las crestas epiteliales queratinizadas o epitelio parcialmente queratinizada, densos e irregulares que se proyectan en el tejido conectivo adyacente fueron encontrados en SE-manchado oscuro y OGE tejidos (Figura 3A). Además, las células JE eran diferentes de SE y OGE en la morfología y tenía límite claro con SE (Figura 3B). Las células en el tejido JE eran uniformes en forma, ya sea plana o husillo, alineados en paralelo a la superficie del diente y las uniones celulares estaban sueltos con el espacio intercelular obvio. Sin embargo, las células SE y OGE fueron todos los polígonos irregulares y estrechamente alineados con menos o incluso ningún espacio intercelular. Además, las células JE eran abundantes en orgánulos y el núcleo era grande, y de manera similar, los núcleos de las células SE y OGE también eran grandes, pero hipercromáticos. Además, las células SE y OGE presentan unas características estructurales típicas de células escamosas y recíprocamente podrían transformar sin límite claro. Figura 3 tinción HE del tejido gingival humano. A. La región entre las flechas es JE (x150); B. El límite entre JE y SE, la flecha apunta a la frontera (x1200).
De acuerdo con las mediciones en el análisis de imágenes, tejido JE fue 1.021 ± 0.128 mm de ancho, 0,066 ± 0,009 mm de espesor, y 0,042 ± 0.002 mm 2 en la zona, mientras que, la SE fue 0,532 ± 0,176 mm de ancho (Tabla 1). el análisis morfológico Red de cultivaron células gingivales humanos y JE OGE in vitro
con el fin de observar las células JE claridad e identificar las características, las células JE y OGE se cultivaron in vitro. Como resultado, inicialmente sembraron células JE primarias presentan morfología diversa, tales como poligonal plana, en forma de huso, oval y esférica. Después de 24 a 96 h de incubación, las células adheridas al fondo del plato de Petri, el citoplasma se volvió oscuro, la membrana era áspero, y 2-3 células de plegado se estiran completamente. Los núcleos eran grandes y comúnmente 2 a 3 nucleolos en cada celda. Después de 7 d, las células llegaron gradualmente en período de crecimiento rápido y se extendieron a lo largo del borde placa de Petri en el centro. Dispersos clones de la mitosis y de células con morfología fusiforme o angular aparecían como se muestra en la Figura 4A. Después de 10 a 12 d, clones de células con diversa morfología, tamaño no uniforme parches confluentes formados (Figura 4B). En el primer pasaje, las células se adhirieron al fondo del plato y estira en 24 a 48 h después de la inoculación, a continuación, las células presentan una morfología similar con las células primarias; En el segundo paso, las células JE, presentaron una morfología irregular, tales como pseudópodos '' células gigantes, y vacuolización citoplásmica (Figura 4C); En los siguientes pasajes, la morfología era más irregular y la proliferación celular pareció ralentizarse, incluso la presentación de envejecimiento y la muerte signos (Figura 4D). Figura 4 La observación de JE y OGE la morfología celular (células primarias). clones de células A. JE formadas (la flecha × 200); B. En 10-12 d, JE células presentan la morfología no uniforme y disposición dispersa (× 200); C. La tercera pasaje JE células múltiples '' apareció células gigantes (la flecha x 200); D. El quinto paso de células JE mostró signos de envejecimiento y muerte (x400); E. los clones de células OGE formaron y expandieron (la flecha x 200); F. En 7-9 d, las células de la OEG presentó morfología uniforme, arreglo apretado, y 'pavimentación similar a la piedra' queratinizante (× 200); G. En el 3er paso de células OGE 'células gigantes' apareció (× 200); H. El 7 de pasaje células OGE mostró signos de envejecimiento y muerte (× 400): perfil A medida que las células la OGE, inicialmente sembraron células primarias presentan formas poligonales o esféricas y se adhieren a la parte inferior del plato dentro de 24-72 h.; Después de 5 días, los clones de células formadas con morfología triangular o poligonal, sin embargo, estas células eran más uniformes que los clones de células JE del mismo período (Figura 4E); Después de 7-9 d, los clones OGE agrandados y convergentes, entonces fuertemente organizado y mostró típico 'pavimentación similar a la piedra' queratinización (Figura 4F); Después de 9-11 d, las células fueron aproximadamente 100% de confluencia; En el segundo paso, las células se adhirieron y se estiran en 48 h. Y entonces aparecieron las "células gigantes '(Figura 4G); Después de haber sido pasar durante 4 horas, las células fueron principalmente "células gigantes 'y la proliferación se desaceleró también con el envejecimiento y la muerte signos (Figura 4H).
Después de eso, las células JE y OGE se tiñeron con HE y se observaron bajo el microscopio. Como resultado, las células JE aparecieron morfología diversa (en forma de huso, triángulo, oval), tamaño no uniforme, arreglo relajado, grandes y oscuros núcleos teñidos y múltiples divisiones nucleares como se mencionó anteriormente (figura 5A). Sin embargo, las células OGE fueron uniformes en tamaño, bien dispuestos, típicamente queratinizado, y con núcleos redondos en el centro, así como las divisiones nucleares visibles (Figura 5B). Por lo tanto, JE fueron significativamente diferentes de OGE en la morfología celular. Figura 5 H & amp; E tinción de las células JE y OGE (células sometidas a pases segunda, H & amp; E x 400). A. células JE presente no uniformes en tamaño y morfología, disposición dispersa, núcleos grandes y profundamente teñidos con múltiples divisiones y nucleares; células B. OGE fueron uniformes en tamaño y forma, bien arreglado, y 'pavimentación similar a la piedra' queratinizante.
condiciones de crecimiento de las células y JE OGE cultivadas in vitro
A continuación, analizamos las condiciones de crecimiento de estas dos células. Hubo más células cultivadas OGE en comparación con JE. Como resultado, el período de incubación de células JE para fijar y proliferar era 1-7 d in vitro, mientras que para las células OGE fue 1-3 d, un poco más corto. La fase logarítmica y el pico de crecimiento de las células JE aparecieron en el 8 ª - 12 º d (sólo duran 5 días), mientras que de la OGE fue 4 ª - 11 º d (8 días). Después de 12 días, las células JE y OGE eran ambos entraron en un período de estancamiento. Además, el número de células JE ha crecido de 6 × 10 4 /ml a 12 × 10 4 /ml durante 9-12 días, y las células la OGE ha crecido de 7 × 10 4 /ml de 14 × 10 4 /ml durante 6-10 días. Según las estadísticas, el tiempo de duplicación celular de las células era JE 48-60 h, mientras que la OGE fue 72-96 h. En general, la OGE exhiben curvas más suavemente que JE (Figura 6). Como se muestra en la Figura 7, las células JE se pasaron con éxito por 5 veces mientras OGE 7 veces en el presente experimento. La calidad de las células sometidas a pases JE disminuyó drásticamente después del 3er paso, pero después de 4 º paso en las células la OGE. Figura 6 Curva de crecimiento de las células y JE OGE. Las células JE estaban en fase latente (1-7 d después de la inoculación), fase exponencial (8-12 d), y la fase de meseta (12 d después). OGE células estaban en fase latente (1-3 días después de la inoculación), fase exponencial (4-11 d), y la fase de meseta (12 d después).
Figura 7 números paso de las células y el número de células por paso para JE y células OGE. (JE células se pasaron cinco veces. OGE células se pasaron 7 veces).
Análisis inmunohistoquímico de los tejidos gingivales y células epiteliales humanas cultivadas in vitro
el fin de identificar a fondo las características funcionales de la JE, se analizaron varios CK. En los tejidos gingivales humanos epitelio, la expresión de CK5 /6 y CK20 era similar aunque CK5 /6 fue más fuerte de colores. Ellos fueron positivas teñidas en la capa suprabasal (especialmente cerca de la superficie) y negativo de colores en la capa basal; La expresión de CK7 y CK17 fue negativo, o sólo débilmente positivo en muy pocas células; En CK10 /13 y CK16, que se expresaron en todas las capas de JE pero sólo en la capa suprabasal de OGE y SE; La expresión de CK10 /13 fue fuertemente positivo y CK16 era débil positiva o positiva; CK19 se detectó en todas las capas de JE con fuerte expresión positiva, mientras que su expresión en OGE y SE se limita a la capa suprabasal y no se observó tinción en la capa basal. El límite entre JE y SE fue debido a la diferencia en la tinción CK19 claramente; El patrón de expresión de CK8 /18 estaba en un nivel inferior, que era similar a la CK19 excepto la capa basal de OGE y SE. Además, también mostraron expresión positiva débil de la capa suprabasal (cerca de la capa basal) en algunos sectores. Las descripciones detalladas estaban en la Tabla 2 y la Figura 2 8.Table patrón de expresión de citoqueratinas en diferentes JE, OGE, y se
Anticuerpo
CK
muestra n. (N) guía empresas Slice no. (N) guía empresas JE
OGE
SE
b
sb
b
sb
b
sb
D5/16B4
5/6
6
20
-
++
-
+
-
+
OV-TL12/30
7
6
10
-
-
-
-
-
-
Zym5.2
8/18
6
15
++
++
+
-*
+
-*
DE-K13
10/13
6
20
+++
+++
-
+++
-
+++
LL025
16
6
18
+
+
-
++
-
+
E3
17
6
11
-
-
-
-
-
-
A53/BA2
19
6
10
+++
+++
+++
-
+++
-
Ks20.8
20
6
14
-
+
-
+
-
+
Nota: b: capa basal, SB: capa suprabasal, -.: Negativa, +: débil positiva, ++: positiva y moderada, +++: positivo fuerte, *: expresión positiva débil de la capa suprabasal en algunas rebanadas
Figura 8 La inmunohistoquímica tinción de los tejidos gingivales humanos (× 100). Se realizó tinción contra diferentes citoqueratinas. A. CK5 /6; B. CK7; C. CK8 /18; D. CK10 /13; E. CK16; F. CK17; G. CK19; H. CK20; tejido gingival I. humano se utilizó como control negativo; J. tejido parotídeo humano se utilizó como control positivo. Hoteles en células cultivadas, tanto en células JE y OGE se tiñeron positivamente para CK-Pan (Figura 9A, B). tinción fuertemente positiva de CK19 se observó en las células JE (Figura 9C), pero sólo un pequeño número de células dispersas OGE se tiñeron positivo (Figura 9D); La mancha CK10 /13, de las dos células JE y OGE fueron débilmente positivo o positivo (Figura 9E, F); Además, los dos tipos de células fueron esparcidas tiñeron positivamente con CK16 (Figura 9G, H). Los controles negativos no se tiñeron en todas las condiciones (Figura 9i, J). Figura 9 Tinción inmunohistoquímica de las células JE y OGE (células de segundo pase, SP x 400). A. células JE, CK-Pan positivo; células B. OGE, CK-Pan positivo; C. Las células JE, CK19 fuertemente positiva; D. células OGE, CK19 en un muy pequeño número de células positivas dispersas; E. JE células, CK10 /13 débilmente positivo a positivo; F. OGE células, CK10 /13 débilmente positivo a positivo; células G. JE, CK16 positivas dispersas; H. células OGE, CK16 positivas dispersas; I. células JE, control negativo; J. células OGE, control negativo.
observación TEM de la formación de células JE apego a la raíz rebanadas
Por último, la formación de unión entre las células y JE superficie del diente se estudió mediante un modelo de co-cultivo. JE y células raíz rebanadas fueron co-cultivadas in vitro. A continuación, se observaron células JE en la superficie de cemento humana. Tres días después de la inoculación, las células eran esféricas y no estiradas por completo (Figura 10A); Cinco días después, el número de células en la superficie JE cemento aumentó y una parte de las células se estira (Figura 10B); A los 7 días, las células se estiran completamente JE ser de forma plana, unida a la superficie del cemento con la membrana celular, pero no aparecieron membrana basal clara y estructuras similares a hemidesmosomas (Figura 10C); En 9 d, células JE parecía tener un pequeño número de depósitos densos en electrones como hemidesmosoma en la membrana celular local conectada a la superficie de cemento (flechas, Figura 10D); En 11 a 14 d, hubo un número significativamente mayor de células en rodajas de raíz, y las células de múltiples capas aparecido (Figura 10E). Además, un gran número de depósitos electrón-densos apareció en la membrana celular-cemento de unión de la superficie. Por último, parecida a la membrana basal y hemidesmosomas estructuras similares se formaron (flechas, Figura 10F). Figura 10 observaciones TEM de la formación estructural de JE células unión a la superficie del cemento. A. A 3 d, hubo un pequeño número de células en la superficie del cemento, las células eran esféricas, no estirar (TEM × 13.500); B. En 5 d, células en la superficie de cemento aumentó en número, y una parte de las células se extendía (TEM × 9700); C. En 7 d, células completamente estirada ser de forma plana, y unido a la superficie del cemento, pero no de forma clara las estructuras de la membrana basal y similares a hemidesmosoma-como (TEM × 24.500); D. En 9 d, células JE parecía tener un pequeño número de depósitos densos en electrones como hemidesmosoma en la membrana celular local conectada a la superficie de cemento (flechas, TEM × 33.000); E. En 11-14 d, hubo un incremento significativamente en el número de células en la superficie de cemento, y apareció células de múltiples capas (TEM × 7400). F. un gran número de depósitos densos en electrones (flechas) apareció en JE membrana celular cemento de unión de la superficie, la formación de las estructuras de la membrana basal y similares a hemidesmosoma-como (TEM × 46.000).
Discusión
JE es una único tejido humano epitelio gingival
de acuerdo con la observación de los tejidos, se encontró que JE tejido normal humano pertenecía a la simple epitelio estratificado. Las células fueron uniformes en forma, relativamente menor en la diferenciación, sin queratinización y crestas epiteliales in vivo. Esto es probablemente debido a su ubicación en la parte inferior del surco gingival, el apego superficie del diente y rara vez sometido a la estimulación externa. Sin embargo, la SE y OGE están expuestos al ambiente de la cavidad oral y exhiben características típicas de las células del epitelio escamoso. Fueron polígono en forma, bien alineado, queratinizado en la capa superficial con crestas epiteliales densos, que se proyectaban hacia el tejido conectivo, y presentan un límite claro con JE. En experimentos preliminares, las crestas epiteliales también fueron vistos en JE de la atrofia gingival o de las bolsas periodontales. Estos sugieren que la estimulación externa y la inflamación puede dar lugar a la formación de crestas epiteliales. Además, los resultados de análisis de imagen mostraron que JE fue sólo alrededor de 1 mm de longitud, 60 m de ancho, y 15 a 20 capas de células de profundidad. Este resultado mostró que el volumen de tejido JE era extremadamente pequeña y difícil de recoger, que es una de las razones principales por JE es difícil de estudiar. Por otro lado, las células JE y OGE se aislaron y se cultivaron in vitro. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
