Resumen Antecedentes
Nano-hidroxiapatita (NHA) es un biomaterial ideales potencial para la regeneración ósea. Sin embargo, los estudios todavía tienen que caracterizar el comportamiento de los osteoblastos humanos derivados de hueso alveolar en CNS. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de las CNS en la adhesión, proliferación y diferenciación de estas células derivadas de hueso alveolar.
Métodos
osteoblastos alveolares humanos primarios se obtuvieron de la cresta alveolar de un varón paciente periodontal durante la cirugía de resección ósea y se cultivaron en placas de cultivo recubiertas con polilisina o ya sea con polilisina nanocompuesto-hidroxiapatita (POL /CSN). Las células se cultivan y se observaron durante 14 días, y luego se evalúan, para las posibles modificaciones a la homeostasis osteoblastos como se evaluó mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa-transcriptasa inversa (en tiempo real RT-PCR), microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica.
Resultados
PCR en tiempo real reveló un aumento significativo en la expresión de los marcadores seleccionados de diferenciación de osteoblastos (proteína morfogenética ósea (BMP) -2, -5, -7, ALP, COLL-1A2, OC, ON) en las células cultivadas en el POL sustrato /CNS. Además, en comparación con la superficie POL, las células cultivadas en el POL /sustrato NHA demostraron mejores propiedades osteoconductivas, como se demuestra por el aumento en la adhesión y la propagación, probablemente como resultado del aumento de la rugosidad de la superficie del material compuesto.
Conclusiones Francia el aumento de la expresión de las BMP y los biomarcadores osteoinductores sugieren que nano-hidroxiapatita puede estimular la proliferación y diferenciación de los osteoblastos alveolares locales y por lo tanto estimular la regeneración ósea en los sitios de la regeneración ósea alveolar.
osteoblastos Palabras clave
Nanohydroxyapatite Humanos hueso alveolar material complementario de regeneración Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-22) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes Francia El principal. preocupación de la periodoncia es la rehabilitación de los dientes con compromiso periodontal, posiblemente con miras a la regeneración del tejido periodontal completa [1]. Idealmente, este proceso incluiría la formación de hueso nuevo, nuevo ligamento periodontal y cemento nuevo, o más bien una nueva inserción sobre la raíz que previamente haya sido privado de todo el aparato de unión [2]. Los enfoques terapéuticos que tratan de alcanzar este objetivo incluyen el uso de diferentes materiales de injerto (autógeno, alogénico, xenogénico y los injertos aloplásticos), barreras físicas para el tejido de regeneración guiada (GTR), proteínas de la matriz derivada de esmalte, y diversos factores de crecimiento [3, 4 ].
se supone que el uso de injertos de hueso o materiales aloplásticos resultaría tanto en el nuevo crecimiento de hueso alveolar y la formación de una nueva capa de cemento con fibras de colágeno insertados en la superficie de la raíz previamente periodontitis involucrados-[5]. El mecanismo de acción puede ser o bien a través de la estimulación de la osteogénesis (formación de hueso nuevo de las células formadoras de hueso contenido en el injerto), osteoconducción (cuando el injerto sirve como un andamio para la formación ósea de hueso huésped adyacente), o osteoinducción ( la matriz del injerto óseo contiene sustancias óseas inductor que resultan en la formación de hueso en los tejidos circundantes incluso si no tejido óseo) [6]. materiales aloplásticos se presume que la promoción de la curación del hueso a través de la osteoconducción y, posteriormente, se comportan como un andamio para este proceso [5].
Un andamio ideal es un material biocompatible que proporciona soporte mecánico apropiado [7]. Se debe poseer una estructura similar a la matriz extracelular nativa, exhibir propiedades de superficie favorables, y conducir a un aumento en la adhesión, la proliferación y diferenciación de las células osteoblásticas [7]. La hidroxiapatita (HA) [Ca
5 (PO 4) 3 OH] es un material aloplástico, químicamente similar al componente inorgánico de la matriz ósea que traduce estas propiedades en una biocompatibilidad valioso y óptima [7] . Cuando se injerta HA debajo de un periostio sano y de hueso bien vascularizado, que primero se integra por un coágulo de [8] y luego libera iones de fosfato en el medio ambiente circundante, que estimula la neo-osteogénesis.
Un factor fundamental que rige la integración óptima de HA con el hueso es de las dimensiones de los cristales. partículas de HA con dimensiones más cerca del tamaño de los cristales naturales que se encuentran en los tejidos duros de vertebrados (es decir, que van de 1 a 10 nm), y ya están disponibles [9], y se han reportado para imitar la matriz extracelular del hueso en tamaño y estructura [10]. Los estudios in vitro
realizados con el fin de comprender el mecanismo de acción de este material de tamaño nanométrico han descrito un efecto estimulador sobre las células madre mesenquimales [11], un aumento en la absorción de proteínas y la adhesión de osteoblastos, en comparación con micro de tamaño tradicional HA [12, 13], la estimulación de la proliferación celular similar a osteoblastos humana que resulta en la formación de hueso [14], y la estimulación de la unión de las células PDL [15]. A pesar de esto, hay poca información hasta la fecha con respecto a las respuestas de osteoblastos alveolares humanos en contacto con este material de injerto una vez que se llena el defecto óseo. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar in vitro
los efectos de las CNS en la adhesión y proliferación de los osteoblastos alveolares humanos y para determinar el impacto que este material tiene aloplástica sobre la expresión de los biomarcadores de la formación de hueso durante HA-mediada la regeneración ósea periodontal.
Métodos
se obtuvieron Aislamiento de osteoblastos humanos primarios
hueso humano fresco retirado de la cresta alveolar con la aprobación del Comité ético de la Universidad Sapienza de Roma y el consentimiento informado del paciente.
humana primaria osteoblastos alveolares (fuegos) fueron cosechadas a partir de una de 53 años de edad, paciente de sexo masculino periodontal durante la cirugía periodontal resectiva de acuerdo con un protocolo previamente validado [16, 17].
muestras de hueso cosechadas se almacenaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO) que contenía 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina hasta su procesamiento. Para el procesamiento, las muestras de hueso se enjuagaron en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, fragmentada con un escalpelo, y se digirieron en solución de 1 mg /ml de colagenasa tipo IV y 0,25% de tripsina (en PBS) a 37 ° C durante 30 min con agitación, seguido de dos etapas de digestión adicionales para 40 min y 90 min, como se describe anteriormente [18, 19]. Se recogieron las células obtenidas de la segunda y tercera digestiones, se centrifugaron y se resuspendieron en Modified Eagles Medium de Dulbecco (DMEM, Gibco-BRL, Rockville, MD) suplementado con 50 U /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 4 mmol /l L- glutamina y 10% de suero bovino fetal (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Wilmington, dE). Células de adhesión, la proliferación y la morfología se inspeccionaron visualmente por microscopía (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Tokio, Japón) sobre el marco de tiempo de 2 semanas. Después de que las células alcanzaron un 70-80% de confluencia, se separaron con tripsina-EDTA, recogen y se utilizan para los experimentos entre pasajes 2 y 4.
poli-L-lisina y poli-L-lisina-NHA preparación de recubrimiento
Un mililitro por cada 25 cm 2 de 0,01% de poli-L-lisina solución (POL, Bioreagent, peso mol 150.000-300.000, esterilizada por filtración, Sigma-Aldrich) se utilizó para recubrir las superficies de las placas de Petri. Las muestras se agitaron suavemente a 4 ° C a 1200 rpm durante 10 min para homogeneizar la estratificación. Las superficies se enjuagaron luego con agua estéril y se dejaron secar a temperatura ambiente. Posteriormente, se volvió a suspender 10 mg de polvo de NHA (Ghimas Spa, Casalecchio di Reno, BO, Italia) en 1 ml de agua estéril y se utilizan para recubrir las placas POL-tratada. Finalmente, las superficies recubiertas se lavaron con agua estéril y se dejaron secar
osteoblastos-POL y osteoblastos-POL-NHA muestras preparación
comportamiento osteoblastos se examinó en placas recubiertas utilizando dos pruebas:. En el Ensayo 1, las placas recubiertas solamente con POL se sembraron con placas a una densidad de 2 × 10 4 células /cm 2; en el Ensayo 2, placas se sembraron con la misma densidad en placas recubiertas con POL y el polvo de las CNS. Las muestras de prueba 1 y la prueba 2 se cultivaron en las mismas condiciones experimentales (95% de humedad, 5% de CO 2, 37 ° C) en DMEM que contenía 10% de FBS. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces cada uno de microscopía electrónica de barrido
.
Propiedades de superficie de las placas recubiertas y la morfología de osteoblastos se investigaron visualmente por microscopía electrónica de barrido (SEM). Después de 24 h de cultivo en POL o superficies POL-NHA recubierto, las muestras se enjuagaron dos veces con PBS, se fijaron en glutaraldehído al 2,5% durante 1 h, se enjuagaron con agua destilada, se deshidrataron con concentraciones graduadas de alcohol (50%, 70%, 90% , 100% de etanol) y, finalmente, tratada con CO 2 en el punto de primera crítica. Las muestras fueron fijadas en los trozos de aluminio utilizando una cinta de carbón conductor y luego recubiertos con una capa de oro de 10 nm (Coating Unidad E5000, Polaron Ltd. Watford, Reino Unido). Se observaron las muestras con SEM (Leo 1450VP, Carl Zeiss, Jena, Alemania) a diversos aumentos, utilizando electrones secundarios a 15 kV.
microscopía de fuerza atómica
microscopía de fuerza atómica (AFM) se llevó a cabo utilizando un Nanonics Imaging AFM sistema (Jerusalén, Israel) en un modo sin contacto y un voltaje de referencia de 0,8-1,0 V entre la punta y la superficie de la muestra durante todos los experimentos. la expresión de genes
Después de 14 días de cultivo en POL y POL-NHA superficies, el ARN se extrajo de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente [18]. ARN transcrito se invirtió utilizando el kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA), usando hexámeros aleatorios. PCR en tiempo real fue entonces lleva a cabo usando el ensayo de SYBR expresión génica verde (Applied Biosystems) en un sistema de PCR en tiempo real ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) para evaluar los cambios en la expresión de marcadores osteogénicos: fosfatasa alcalina (ALP), A2 pro-colágeno cadena de tipo 1 (COLL-1A2), proteína morfogenética ósea (BMP) -2, BMP-5, BMP-7, osteocalcina y osteonectina. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control endógeno. Las secuencias fueron diseñados utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems) y se sintetizaron por Primm (Milán, Italia). Primers se enumeran en la Tabla 1. La expresión génica se analizó de acuerdo con el método ΔΔCT , con los niveles de expresión de prueba 2 (POL /NHA) normalizaron las muestras de prueba hacia 1 (POL) values.Table 1 cebadores humano usados en RT- PCR para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), la fosfatasa alcalina (ALP), A2 pro-colágeno de tipo 1 de la cadena (COLL-1A2), la proteína morfogenética ósea 2, -5, -7 (BMP-2, -5, -7)
Objetivo gen
cartilla sequences
GADPH
5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′
5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′
ALP
5′-TGCGGAAGAACCCCAAAG-3′
5′-ATGGTGCCCGTGGTCAAT-3′
Coll-1A2
5′-CCCAGCCAAGAACTGGTATAGG-3′
5′-GGCTGCCAGCATTGATAGTTTC-3′
Osteocalcin
5′-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3′
5′-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3′
Osteonectin
5′-CCACACGTTTCTTTGAGACC-3′
5′-GATGTCCTGCTCCTTGATGC-3′
BMP-2
FW5′-CCAGCTGTAAGAGACACCCTTTG-3′
RV5′-ACCCACAATCCAGTCATTCCA-3′
BMP-5
FW5′-CGTCCTCTGCACCTCTCTTTATG-3′
RV5′-CTCCGACTCTTCAGGATTTTCTTC-3′
BMP-7
FW5′-TCTTCCACCCACGTACCA-3′
RV5'-GCTTCCCCTTCTGGGATCTT-3 '
El análisis estadístico de los datos de Francia El Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (v15.0 SPPS, SPSS Inc. Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico . Los análisis se realizaron mediante la t de Student
. La significación se fijó en p & lt; 0.05.
Resultados
humano osteoblastos extracción y cultivo primario
Los osteoblastos conectar sin problemas a las superficies de los sustratos y se observaron a someterse a la proliferación desde el día 4 hasta el día 14, como se determinará mediante inspección visual por microscopía (Figura 1A-C ). Figura 1 osteoblastos primarios humanos. (A) Después de 4 (B) Después de 5 días (c) después de 14 días (ampliación original, 20 aumentos).
POL POL-NHA y propiedades de rugosidad superficial comentario El rugosidad de ambas superficies del sustrato se evaluó mediante SEM y AFM. La rugosidad de la superficie nanométrica evaluado por AFM fue 49,7 RMS /nm para POL-CNS y 6.3 rms /nm para POL. Por lo tanto, las placas cubiertas en POL-NHA mostró un 7,89 veces mayor rugosidad superficial nanométrica en comparación con placas de Pol (Figura 2A-D). Además, las observaciones de SEM reveló la morfología de las partículas de CNS para tener una forma de varilla de 70 a 90 nm de diámetro. Figura 2 microscopía de barrido. (A) Microscopía electrónica de imagen de los sustratos (POL) polilisina. (B) la microscopía de fuerza atómica de POL /nanohydroxyapatite. (C) Microscopía Electrónica de Barrido. (D) la microscopía de fuerza atómica de POL /nanohydroxyapatite (POL /CSN).
Efecto de nano-hidroxiapatita en la adhesión y la proliferación de osteoblastos
Las posibles modificaciones morfológicas a HOBS fueron evaluados después de que las células se sembraron en placas recubiertas con POL y POL-CNS. Después de 24 h, las células que crecen en las placas de Pol-revestido mantuvieron una forma esférica (figura 3A), mientras que las células en el sustrato POL-NHA parecían estar bien sujeto, como se demuestra por la presencia de numerosas extensiones filopodios (Figura 3B), lo que sugiere que las partículas NHA mejoran la adhesión de osteoblastos y la difusión. Por otra parte, las imágenes obtenidas por AFM mostraron que placas cultivadas en POL /NHA adhirieron más fuerte que los de POL solo, como se muestra por el aumento de la rugosidad superficial nanométrica (Figura 3C-D). Figura 3 microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Las células (A) cultivadas en POL aparecieron esférico con fibras retraída. (B) Las células cultivadas en POL /NHA aparecieron alargada y con muchas filopodios. (C) Las células cultivadas en POL aparecieron esférico con fibras retraída. (D) Las células cultivadas en POL /NHA apareció alargada y con muchas filopodios.
Efectos de las nano-se extrajo hidroxiapatita sobre la expresión génica de los osteoblastos humanos
ARN de las células cultivadas durante 14 días en ambos sustratos (POL frente POL /NHA) y se sometió a tiempo real de RT-PCR para evaluar los cambios en la expresión de genes específicos de diferenciación osteoblásticas (Tabla 1): BMP-2, -5 y -7, ALP, COLL-1A2, OC y ON, conocida marcadores de diferenciación. Como se muestra en la Figura 4, BMP-2, BMP-5 y BMP-7 se aumentó en aproximadamente 1,7, 4,5 y 4,3 veces, respectivamente, en placas cultivadas en POL sustratos /CSN en comparación con las cultivadas en POL sola (p & lt; 0,05). Curiosamente, COLL-1A2, OC y en la expresión fue de 1,6, 1,9 y 2,1 veces mayores, respectivamente, en HOBS cultivadas en POL /NHA en comparación con las cultivadas en POL (p & lt; 0,01). ALP también se incrementó 2,5 veces en placas cultivadas en POL /NHA (p & lt; 0,01), lo que sugiere un aumento de la diferenciación de estas células en las condiciones de cultivo actuales. Figura 4 La expresión de genes de fuegos puestas en cultivo en POL POL y /CNS.
En general, nuestros resultados muestran que, dentro de un plazo de 14 días, el sustrato POL /CNS pueden aumentar la expresión de genes específicos osteoblásticas, lo que indica fuertemente un efecto positivo de las CNS en la diferenciación de los osteoblastos (Figura 4).
discusión
hidroxiapatita, entre los diversos sustitutos de injerto óseo, ha sido ampliamente investigado en la regeneración periodontal en las últimas tres décadas [4, 20]. HA injertos aloplásticos, a pesar de su composición química similar al hueso, se conoce principalmente por sus propiedades osteoconductive [5]. Nuestro estudio ha confirmado las propiedades osteoconductive de una versión de tamaño nanométrico de este material, lo que demuestra que las CNS pueden estimular los osteoblastos para producir biomarcadores seleccionados representante de la formación ósea y el reclutamiento de células mesenquimales. México La justificación de la elección de los osteoblastos humanos alveolar se basa en el hecho de que estas células se encuentran en la superficie del hueso del defecto, lo que significa que el material injertado estará en contacto directo con estos osteoblastos durante la curación. El método de recogida de células se realizó con un bisturí de hueso como parte de una técnica bien documentada utilizado durante la cirugía periodontal resectiva [21, 22]. Cultivo de células y se llevaron a cabo la formación de los sustratos siguieron modelos utilizados anteriormente (dispersión de las partículas de las CNS en poli-etileno-glicol-dimetacrilato o NHA asociados con un policarbonato, poliamida, polisacárido) [23-27]. osteoblastos alveolares humanos son las células primarias responsables de la formación de hueso alveolar, a pesar de que no parecen ser capaces de migrar y proliferar en sitios distantes en que se requiere la regeneración ósea. Albrektsson & amp; Johansson sugirió que las células osteoblásticas preexistentes sólo contribuyen una parte menor del nuevo hueso sea necesario en una situación de curación de la fractura y que el reclutamiento de células inmaduras y su diferenciación en los osteoblastos son probablemente la curación del hueso mecanismo básico y fundamental que regula [6]. De hecho, los osteoblastos se han demostrado para contribuir a la producción de factores de crecimiento que fomentan la migración celular, así como la osteogénico y diferenciación condrogénica de las células progenitoras mesenquimales [28]. Nuestro estudio demuestra que las CNS estimula los osteoblastos alveolares locales para producir BMPs hueso específica relevante, que son conocidos para iniciar y regular la formación de hueso a partir de las células progenitoras.
Varios tipos de BMPs, que pertenecen al factor de crecimiento transformante (TGF ) -β familia, se han investigado y se caracteriza por su papel modulador en la homeostasis del tejido óseo. BMP-2 y BMP-7 son de particular interés, ya que se liberan de manera natural en respuesta a un trauma o durante la remodelación ósea y son, hasta la fecha, los únicos agentes inductivos conocidos [6]. La estimulación de BMP-2, -5 y -7 es un aspecto importante de la osteogénesis, ya que estas proteínas son los tres de los factores de crecimiento más potentes que mejoran la formación de hueso. Los resultados presentados en este documento demuestran que las CNS promueve la expresión de BMP por los osteoblastos alveolares in vitro
. Esta observación sugiere que las CNS podría actuar como promotor de la regeneración ósea en el sitio del defecto óseo de dos maneras: mediante la inducción de la diferenciación osteogénica como se observa por Lock et al. [11] y /o mediante la inducción de la secreción de factores específicos, tales como BMPs o otros factores de crecimiento no han sido evaluados en este experimento. Por otra parte, la ASN influenciada un aumento significativo en la expresión de varios marcadores importantes de ALP osteogénesis, OC, ON y COLL-1A2.
A instigar la formación de hueso, las células tienen que adherirse y proliferar. La rugosidad superficial es una consideración importante cuando se selecciona un sustrato de hueso que inducen. De acuerdo con los principios físicos y mecánicos, un sustrato con rugosidad superficial muestra una mayor capacidad para la adhesión en comparación con una superficie lisa [29-32]. En este estudio, se evaluó la adhesión de osteoblastos sobre la base de los cambios en la forma celular y en la presencia de filopodios. SEM y AFM imágenes mostraron que las CNS tenía una superficie más rugosa que el sustrato de control y favoreció la adhesión y proliferación de los osteoblastos humanos. Estos resultados están de acuerdo con los reportados por Thian et al., Que muestran que las CNS, mejora la adhesión y la propagación de células humanas similares a osteoblastos [33] y Liu et al., Demostrando la inducción de la adhesión y proliferación de osteoblastos MG-como humana 63 células en las CNS [14].
Conclusiones
Dentro de los límites de este estudio, se observó que las CNS pueden aumentar significativamente en lugar de adhesión de osteoblastos humanos alveolar y la diferenciación, y por lo tanto especular que las CNS podría alentar la formación de hueso por los osteoblastos locales en los sitios de la reconstrucción ósea alveolar. Además, el aumento de la expresión de las BMP en la superficie de CNS podría indicar un aumento en el reclutamiento de células progenitoras durante la curación con andamios CNS. Estos in vitro
hallazgos podrían explicar, al menos en parte, la formación de hueso nuevo testigo en defectos óseos llenos de Nha material de injerto [34, 35] y sugerir el papel aún más de las CNS en los procesos de reinserción periodontales, incluyendo la formación de nuevo cemento y el nuevo ligamento periodontal. Se necesitan más estudios histológicos y clínicos para dar importancia a los resultados in vitro
, así como una explicación biológica de los resultados clínicos observados por otros.
Declaraciones
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los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores AP y SM fueron los principales investigadores de este estudio. Ellos hicieron contribuciones sustanciales a la concepción y diseño, así como la adquisición, análisis e interpretación de datos; GP, MS, GDC y BZ participaron en la redacción del manuscrito o revisar críticamente importante para el contenido intelectual, y dio la aprobación final de la versión para ser publicada. LR, MB y FW hicieron contribuciones sustanciales en la adquisición de datos y participó en la redacción del manuscrito y ayudó en la revisión del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
