gingival
Abstract
Antecedentes
Teniendo en cuenta que el tejido gingival injertado podría tener que ser adaptada a la zona de receptor y que los fibroblastos tienen la capacidad de responder a estímulos bacterianos a través de la liberación de varias citoquinas, este estudio investigó si los fibroblastos de la mucosa palatina se comportan de manera diferente cuando injertado en el margen gingival respecto a la secreción de citoquinas.
Métodos
las biopsias de la mucosa palatina se recogieron en el momento de la libre cirugía de injerto gingival, y después de cuatro meses de recogida de re-se llevó a cabo en la cirugía para la cobertura de la raíz. Los fibroblastos se aislaron por la técnica de explante, se cultivaron y se estimularon con Porphyromonas gingivalis
(Pg
) y Escherichia coli
(
Ec) LPS para 24 o 48 h para la evaluación comparativa de la secreción de citocinas y quimiocinas, tales como IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF y CXCL16. Se utilizaron células no estimuladas como el grupo de control. Las células se ensayaron para la viabilidad a través de ensayo de MTT, y la secreción de citocinas y quimiocinas se evaluó en los sobrenadantes de las células mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Resultados
Los fibroblastos de la mucosa del paladar mantienen el mismo patrón de secreción de IL -6 cuando injertado en el margen gingival. Por el contrario, los fibroblastos de injerto gingival marginal mostraron un aumento de la secreción de IL-8 /CXCL8, incluso en ausencia de estimulación. Curiosamente, la secreción de MIP-1α /CCL3 por los fibroblastos de injerto gingival marginal fue significativamente mayor después de 48 horas de estimulación con PG
LPS y después de 24 h con LPS Ec
. Sólo los fibroblastos de injerto gingival marginal mostraron secreción de TGF-β. VEGF y la secreción de CXCL16 no fueron detectados por los dos subconjuntos de fibroblastos.
Conclusión
Los fibroblastos de la mucosa palatina parece estar adaptado a las condiciones locales del microambiente sitio cuando injertado en la zona marginal gingival. Esta evidencia apoya la participación efectiva de los fibroblastos en la homeostasis del periodonto marginal a través de la modulación de la secreción de mediadores inflamatorios importantes.
Material complementario Palabras clave
fibroblastos gingivales periodontitis Las citoquinas quimiocina inflamación Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi :. 10 1186 /1472-6831-14-21) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
exposición del tejido gingival a la placa bacteriana puede causar inflamación de los tejidos con signos clínicos de cambio de color. , tamaño, forma, consistencia y hemorragia con la posibilidad de la pérdida de hueso alveolar debido a progresión de la enfermedad periodontal [1]. El efecto acumulativo y eventos patológicos repetitivas al tejido gingival puede conducir a la aparición y progresión de la recesión gingival, especialmente en los casos con banda estrecha o ausencia de encía adherida [2-4].
De acuerdo con la Academia Americana de Periodontología, periodontal cirugía plástica puede estar indicada para aumentar el ancho gingival, creando un vestíbulo más profundo en los sitios con inserción del frenillo anormal e inadecuado encía insertada [5]. A pesar de que el ancho de mucosa queratinizada y la encía se determinan genéticamente, pueden ser afectados por la presencia de la placa bacteriana asociada con la inflamación o por intervenciones mecánicas [6].
Se ha demostrado que los fibroblastos, además de ser las células más importantes en el mantenimiento y remodelación de la matriz extracelular del tejido conectivo, están involucrados en la respuesta huésped inmune e inflamatoria en la enfermedad periodontal, ya que son las células predominantes estructurales que se encuentran en las infecciones periodontales por bacterias anaerobias tales como Porphyromonas gingivalis (Pg)
y pueden ser estimulados para liberar citoquinas inflamatorias sobre Pg
subproductos y su desafío [7-11]. Además de ser sensibles a sus propias citocinas y factores de crecimiento, pueden interactuar directamente con las bacterias y sus factores de virulencia, incluyendo lipopolisacárido (LPS) en las lesiones periodontales [12].
Sobre el papel fibroblastos gingivales en la respuesta a PG
LPS a través citoquinas de liberación, se ha demostrado previamente que estas células muestran un comportamiento diferencial de ligamento periodontal de los mismos donantes, lo que confirma la individualidad de la región anatómica en la determinación de la respuesta de células [9]. En concreto, para IL-6 y IL-8 /CXCL8, una quimiocina conocida requerido para neutrófilos reclutamiento, se informó de que estas células son capaces de secretar grandes cantidades cuando son estimuladas por LPS [Pg
8, 13-15] . Además, los fibroblastos gingivales también secretan la quimioquina MIP-1α /CCL3 lo que implica en monocitos quimioatracción en la enfermedad periodontal [16], así como TGF-β que induce la expresión de tipo pro-colágeno I [17]. VEGF es otra citoquina relacionada con la etiología de la enfermedad periodontal debido a la capacidad de aumentar la permeabilidad vascular que contribuye a la difusión de la inflamación, lo que permite la liberación de mediadores inflamatorios por las células en el tejido inflamado y permitiendo la formación de nuevos vasos sanguíneos [18]. Además, la quimiocina CXCL16 es inducida por otras citoquinas que promueven la proliferación de fibroblastos gingivales y la migración de leucocitos hacia los tejidos inflamados ayudando a los tejidos periodontales reorganización [19, 20]. A lo mejor de nuestro conocimiento, ningún trabajo previo ha abordado el perfil de secreción de las citoquinas mencionadas comparan los fibroblastos de mucosa palatina (generalmente utilizado como un sitio donante autólogo para los procedimientos de injerto gingival) con células originaron de área gingival marginal.
Injertado tejido gingival podría tener que ser adaptada a la zona de receptor y hay una gran cantidad de evidencia de que los fibroblastos gingivales son capaces de reaccionar a varios estímulos a través de citocinas y quimiocinas de liberación, que a su vez juegan un papel importante en la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar si la secreción de citocinas y quimiocinas que incluyen mediadores de reparación por los fibroblastos gingivales humanos podría ser modulada cuando se injerta de la mucosa del paladar a la zona marginal de la encía en un procedimiento de injerto gingival libre.
Métodos
recogida y fibroblastos muestra de cultivo primario
Después de la aprobación por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Odontología de Bauru, Universidad de Sao Paulo, # 055/2011, tres individuos sanos sistémica y periodontalmente (28, 38 y 50 años de edad, 3 hembras) fueron seleccionados en periodoncia Clínicas, todos los cuales necesita cobertura de la raíz en las zonas con escasa mucosa queratinizada. No tenían signos de inflamación gingival, sangrado al sondaje o crítica la profundidad de sondaje. Todos los individuos fueron sometidos a anamnesis, examen clínico periodontal y exámenes radiográficos. Los criterios de inclusión fueron los individuos con mucosa queratinizada deficiente, tanto en cantidad como en calidad, sin complicaciones sistémicas que podrían contraindicar los procedimientos quirúrgicos, y que el consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Comentario El muestras de mucosa del paladar, 3x3 mm de tamaño, se obtuvieron inmediatamente cuando un injerto de tejido epitelio conjuntivo se retiró de la zona donante palatal en la zona de premolares durante la cirugía de injerto gingival libre [21]. Después de cuatro meses, las muestras de injerto gingival se obtuvieron de la zona marginal, durante un segundo procedimiento quirúrgico para la cobertura de la raíz. Los fibroblastos se aislaron por la técnica de explante como se describe anteriormente [8-11]. Brevemente, las muestras fueron procesadas inmediatamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 20% (FBS; Gibco, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La capa epitelial se retiró y las muestras se picada lo más pequeño posible. fragmentos de tejido de mucosa palatina o injerto gingival se sembraron por separado en placas de Petri y se cubren con DMEM suplementado con 20% de FBS y antibióticos (600 l /ml de penicilina, 300 l /ml de sulfato de gentamicina y anfotericina B 100 l /ml). Los explantes se colocaron en 25 cm
2 frascos y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. El medio (DMEM 10% de FBS) se cambió cada 2-3 días y se mantuvieron los cultivos hasta que los fibroblastos alcanzaron la confluencia. Después de la confluencia, los fibroblastos se recogen y se utilizan entre los pasos cuarto y octavo [8-11].
Estimulación fibroblastos
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10 4 células /bien y se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 durante 18 horas en DMEM 1% de FBS. Después de la adhesión durante la noche, DMEM que contenía 1 mg /ml de LPS Pg
(Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.) o EC
LPS (Invivogen) se añadió a los pocillos durante 24 o 48 h. Se utilizaron células no estimuladas con como controles. Tanto Pg
LPS y EC
LPS eran ultrapura y adquiriendo de Invivogen.
Caracterización fenotípica de los fibroblastos
Las células cultivadas a partir de la muestra de mucosa gingival y el injerto se caracterizaron como los fibroblastos por su morfología y tinción con superficie de fibroblastos proteína (FSP; ab 11333, Abcam, Cambridge, UK) por medio de la inmunotinción [11]. Las células se sembraron en una placa de 8 pocillos con 1 × 10 4 células por pocillo y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 18 horas a que se adhieran en subconfluencia. Posteriormente, los pocillos se dividieron en grupos (control, Pg
LPS, EC
LPS y control negativo, que se realizó sin el anticuerpo primario) por duplicado, a la celda de estimulación. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (15 min) y se lavaron 3 veces con 1 x PBS y se incubaron con PBS BSA 3% (30 min a temperatura ambiente) seguido de incubación de anticuerpo monoclonal primario de fibroblastos marcador de superficie diluido a 1: 100 (2 g /ml concentración final), y finalmente con un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína (1: 400) (Abcam) a 37 ° C en la oscuridad durante 1 hora. Los cubreobjetos se montaron con Vectashield medio de montaje Soporte Hard-Conjunto de montaje que contiene 49,6-diamino-2-fenilindol (DAPI; H-1500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) y se analizaron mediante escaneo láser confocal microscopio (modelo TCS, SPE , Leica Mannheim, Alemania).
Cell viabilidad
la viabilidad celular se analizó de la actividad enzimática con un ensayo colorimétrico MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Brevemente, las células se lavaron con 1 x PBS para eliminar el medio de cultivo y se añadió MTT (5 mg /ml) para los grupos (control, Pg
LPS y Ec
LPS) o pozos libres de células (en blanco). La placa se incubó durante 4 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de la incubación, se centrifugó la placa (200 g
durante 7 minutos a 21 ° C) y una solución de MTT se eliminó para añadir dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La densidad óptica de los pocillos se determinó usando un lector de placas (Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Alemania) en la longitud de onda de 570 nm.
Enzyme-ensayo inmunoenzimático (ELISA)
ELISA se realizó siguiendo el fabricante de instrucciones para determinar los niveles de proteína de IL-6 (amp I +; D System, Minneapolis, MN, EUA), IL-8 /CXCL8 (amp I +; D System, Minneapolis, MN, EUA), MIP-1α /CCL3 (amplificador de investigación y desarrollo; D sistema, Minneapolis, MN, EUA), el TGF-β (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.), VEGF (PeproTech, Londres, Reino Unido) y CXCL16 (PeproTech, Londres, Reino Unido). Brevemente, las placas de 96 pocillos se incubaron con anticuerpo de captura anti-IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF o CXCL16 diluido en tampón 1x PBS. Después de bloquear durante 1 hora para evitar la unión no específica, 100 l de estándar de IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF y CXCL16 y sobrenadantes de cultivo fueron colocados. Las citoquinas fueron detectados por el anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de rábano picante a cada objetivo después de la adición de 100 l anti-IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-beta, VEGF y CXCL16 anticuerpos biotinilados se colocaron en cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La microplaca se lavó para eliminar los anticuerpos marcados con enzimas no unidos. La cantidad de peroxidasa de rábano picante unida a cada pocillo se determinó mediante la adición de 100 l de solución de sustrato. La reacción se detuvo por la adición de 100 l de ácido sulfúrico 1 M, y las placas se leyeron a 450 nm (Synergy ™ MX monocromador Based Multi-Mode lector de microplacas, BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT, EE.UU.). Las concentraciones de IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF y CXCL16 se determinaron por interpolación a partir de una curva estándar y se presentan como pg /ml para los ensayos por duplicado de muestras duplicadas de cada uno de los probado condiciones.
análisis estadístico Las comparaciones
de viabilidad a través de MTT entre las muestras se realizaron mediante una vía ANOVA seguido por el test de Tukey. normalidad de los datos de ELISA se verificó mediante el método de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias estadísticas se determinaron por de tres vías ANOVA seguido por la prueba de Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron con STATISTICA (versión 11.0; StatSoft Inc). los valores & lt; P 0,05 se consideraron significativos. Los resultados se expresaron como media y una desviación estándar de la media.
Resultados
Caracterización fenotípica de los fibroblastos
tinción celular se realizó con un marcador de superficie de fibroblastos (FSP) para confirmar el fenotipo fibroblástico. Los fibroblastos se analizaron por inmunofluorescencia en todos los grupos (control, Pg
LPS, EC
LPS y control negativo). Se observó tinción positiva para todos los grupos (Figura 1), con Pg
LPS (Figura 1C) y grupos Ec
LPS (Figura 1B) siendo ligeramente superior. Para el grupo de control negativo (Figura 1D), que no recibió anticuerpo primario, no se detectó señal. Este resultado confirma la caracterización de las células cultivadas como fibroblastos. Figura 1 Las células caracterización de proteínas por tinción de la superficie de fibroblastos. Las células cultivadas se inmunotiñeron para la proteína de superficie de fibroblastos (FSP) y se analizaron mediante un microscopio confocal en un aumento de 63x. (Un control; (B) estimulada por LPS Ec
; (C) estimulada por LPS y Pg
(D) de control negativo, núcleos marcados en azul (DAPI).
Viabilidad celular
se evaluó la viabilidad celular después de 24 y 48 h, en el control (no estimulado ) y los grupos de prueba (estimuladas con LPS y Pg
Ec
LPS). No hubo diferencias en las células de viabilidad con los estímulos utilizados después de 24 y 48 h (Figura 2). Figura 2 Las células viabilidad. Los fibroblastos viabilidad desafió con LPS y Pg
Ec
LPS evaluados a los 24 y 48 horas en el control (no estimulado) y grupos de ensayo (estimuladas con LPS y Pg
Ec
LPS) mediante el ensayo de MTT .
la secreción de citoquinas comparación de los fibroblastos de la mucosa del paladar con las células de la encía marginal injertados
Cuando los objetivos de este estudio fueron comparados entre las dos subpoblaciones de fibroblastos, la secreción de IL-6 fue estadísticamente significativa después de 24 y 48 h de Pg estimulación
LPS (Figura 3A y B) por ambos subtipos de fibroblastos (de la mucosa del paladar y de injerto gingival en la zona marginal), y la diferencia fue mayor con 48 h (Figura 3B). Por otro lado, la secreción después de la estimulación con LPS Ec
solamente fue estadísticamente significativa después de 48 h, por ambos subtipos de fibroblastos (Figura 3D). Además, IL-6 secreción fue mayor por los fibroblastos no estimulados desde el injerto gingival marginal (Figura 3). Figura 3 IL-6 secreción por fibroblastos humanos cultivados de mucosa palatina y injerto gingival marginal. A-D: cultivos de células primarias se obtuvieron de los tejidos periodontales de tres sujetos sanos y, después de que el cuarto paso, se estimularon con LPS de P. gingivalis
y de E. coli
en una concentración de 1 mg /ml. El medio de cultivo sin estímulos se utilizó como control. ELISA se llevó a cabo para la cuantificación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo celular. figura representativa de la media de tres experimentos independientes, n = 3. * P & lt; 0,05 se consideró significativamente diferente. PMF = fibroblastos de mucosa palatina. GMF = marginales fibroblastos gingivales.
Los fibroblastos de la mucosa palatina secretada más IL-8 /CXCL8 de los fibroblastos de injerto gingival marginal cuando son estimuladas por LPS Pg
con una diferencia estadísticamente significativa a las 48 h (Figura 4A y B) . También, con respecto a esta quimiocina, los fibroblastos de la mucosa palatina mostraron un aumento en ambos 24 h y 48 h cuando es estimulado por la CE
LPS (Figura 4C y D), que no fue observado por las células del injerto gingival marginal. Figura 4 IL-8 /CXCL8 la secreción por los fibroblastos humanos cultivados de mucosa palatina y injerto gingival marginal. A-D: cultivos de células primarias se obtuvieron de los tejidos periodontales de tres sujetos sanos y, después de que el cuarto paso, se estimularon con LPS de P. gingivalis
y de E. coli
en una concentración de 1 mg /ml. El medio de cultivo sin estímulos se utilizó como control. ELISA se llevó a cabo para la cuantificación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo celular. figura representativa de la media de tres experimentos independientes, n = 3. * P & lt; 0,05 se consideró significativamente diferente. PMF = fibroblastos de mucosa palatina. GMF = fibroblastos gingivales marginales.
En este estudio, se observó MIP-1α /CCL3 ser constitutivamente secretada por fibroblastos ambos subtipos (Figura 5). Por otra parte, no hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa en la secreción de MIP-1α /CCL3 entre los fibroblastos no estimuladas (grupo control) y los fibroblastos estimulados con Pg
o ec
LPS de la mucosa palatina (Figura 5). Sin embargo, se observó una diferencia estadísticamente significativa en el MIP-1α /secreción CCL3 después de 48 h cuando los fibroblastos del injerto gingival marginal fueron estimuladas con LPS Pg
(Figura 5B) y después de 24 h cuando es desafiado por EC
LPS (Figura 5C). Figura 5 MIP-1α /CCL3 la secreción por los fibroblastos humanos cultivados de mucosa palatina y injerto gingival marginal. A-D: cultivos de células primarias se obtuvieron de los tejidos periodontales de tres sujetos sanos y, después de que el cuarto paso, se estimularon con LPS de P. gingivalis
y de E. coli
en una concentración de 1 mg /ml. El medio de cultivo sin estímulos se utilizó como control. ELISA se llevó a cabo para la cuantificación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo celular. figura representativa de la media de tres experimentos independientes, n = 3. * P & lt; 0,05 se consideró significativamente diferente. PMF = fibroblastos de mucosa palatina. GMF = marginales fibroblastos gingivales.
Cuando se evaluó la secreción de TGF-β, los fibroblastos de la mucosa palatina no mostraron niveles detectables incluso en presencia de Pg
LPS (Figura 6 A y B) o EC
LPS (Figura 6C y D). Por el contrario, los fibroblastos de injerto gingival marginal mostraron una secreción de TGF-β constitutiva y no había diferencias estadísticamente significativas entre las células estimuladas y no estimuladas, tanto a las 24 h y 48 h (Figura 6). No se detectó VEGF y CXCL16 secreción ya sea en fibroblastos sobrenadante del cultivo de la mucosa del paladar ni del tejido gingival marginal, sin tener en cuenta la estimulación por Pg
o EC
LPS. Figura 6 TGF-β secreción por los fibroblastos humanos cultivados de la mucosa del paladar y de injerto gingival marginal. A-D: cultivos de células primarias se obtuvieron de los tejidos periodontales de tres sujetos sanos y, después de que el cuarto paso, se estimularon con LPS de P. gingivalis
y de E. coli
en una concentración de 1 mg /ml. El medio de cultivo sin estímulos se utilizó como control. ELISA se llevó a cabo para la cuantificación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo celular. figura representativa de la media de tres experimentos independientes, n = 3. * P & lt; 0,05 se consideró significativamente diferente. PMF = fibroblastos de mucosa palatina. GMF = fibroblastos gingivales marginales.
Discusión
Los fibroblastos no son un grupo de células único a través de las diferentes regiones anatómicas [9, 22-24]. Son las células predominantes en el tejido conectivo periodontal [12], y están involucrados en la respuesta inmune del huésped por la liberación de citoquinas inflamatorias [7] y mediadores de reparación [25, 26]. Para el mejor conocimiento del autor, este es el primer estudio para investigar y comparar el perfil de secreción de mediadores por los fibroblastos humanos cultivados de mucosa palatina no marginal con la encía marginal injertado tejido, lo que indica las diferencias o similitudes entre estas células en la contribución de citoquinas secreción de LPS a la estimulación bacteriana.
En el presente estudio, se observó que tanto los fibroblastos derivados de la mucosa del paladar y el injerto gingival marginal secretan citoquinas IL-6 de manera similar cuando son estimuladas por Pg
o EC
LPS. Reconocemos que habría sido valiosa para investigar la expresión de ARNm con el fin de comprender mejor si los niveles de transcripción serían diferentes entre ellos. Esto nos podría dar alguna información sobre posibles modificaciones posteriores a la transcripción que pueden alterar la producción de citoquinas. Estudios previos [8, 14, 15, 27, 28] han demostrado que los fibroblastos expuestos a estímulos bacterianos tales como LPS mostraron significativo IL-6 expresión, lo que indica la importancia de esta citocina en la respuesta inmune e inflamatoria en la periodontitis anfitrión, pero la presente investigación también reveló aumento de la secreción de IL-6 a las 48 h para ambos subtipos de fibroblastos. Aquí, no era IL-6 secreción constitutiva por las células no estimuladas de la mucosa palatina y también del injerto gingival marginal, siendo estadísticamente significativa para el segundo. Scheres et al. [14] demostraron que los fibroblastos gingivales no estimuladas expresan y secretan más IL-6 de fibroblastos del ligamento periodontal. Esto sugiere que los fibroblastos gingivales tienen un estado más alto de actividad, ya que son más susceptibles a tener contacto con los patógenos periodontales y aquí resaltar este importante papel para ambos subtipos de células de la encía.
Se muestra aquí que los fibroblastos de la mucosa palatina única secretada IL-8 /CXCL8 de quimioquinas cuando se estimula con LPS bacterianos. Cuando se injertaron estas células a la zona marginal gingival, se observó después de la secreción de 4 meses IL-8 /CXCL8 de quimioquinas, incluso en ausencia de LPS estímulos. Este cambio en el perfil de expresión puede estar relacionado con el contacto más estrecho de las células con factores de virulencia bacterianas, tales como pg
LPS, en el periodonto marginal. Estudios previos [9, 13-15, 29] han demostrado que los fibroblastos estimulados por LPS Pg
son capaces de producir IL-8, y fibroblastos de diferentes regiones anatómicas muestran heterogeneidad en el perfil de secreción de quimiocinas [14]. Por lo tanto, se hace hincapié, además, que la secreción heterogéneo de IL-8 /CXCL8 en el estudio actual puede haber ocurrido por la influencia del medio ambiente sobre la secreción de mediadores de fibroblastos injertados en una nueva región anatómica, en la que existe la adaptación y la proliferación de estas células.
cuando se investigó la quimioquina MIP-1α /CCL3, se observó que cuando los fibroblastos de la mucosa palatina se injertan en el área gingival marginal, mantuvieron citoquinas similares secreción constitutiva en ausencia de estimulación bacteriana. Sin embargo, los fibroblastos de injerto gingival marginal mostraron una secreción más alta en comparación con los fibroblastos de la mucosa palatina sólo después de 48 h cuando son estimuladas por Pg
LPS, mostrando una expresión dependiente del tiempo. De nuevo, el aumento de la secreción de quimioquinas, en este caso MIP-1α /CCL3, por los fibroblastos de injerto gingival marginal podría haber ocurrido debido a la estimulación previa en la zona marginal de la placa dental en el surco, lo que sugiere que estas células presentan un comportamiento de adaptación cuando injertado en el margen gingival. Un trabajo previo de nuestro grupo [9] mostró que gingivales y periodontales fibroblastos del ligamento se comportaron de manera diferente en el MIP-1α secreción /CCL3 cuando son estimuladas por LPS Pg
, y también mostraron una secreción MIP-1α /CCL3 aumento cuando las células fueron desafiados por Pg
LPS en bajas concentraciones, tales como 0,1 g /ml, que aumentaron con el tiempo.
en cuanto a la secreción de TGF-β, fibroblastos cultivados de la mucosa palatina y del injerto gingival marginal mostró un comportamiento heterogéneo. Los fibroblastos de la mucosa palatina no mostraron la secreción de TGF-β incluso en contra de los estímulos aplicados bacterianas. Por el contrario, los fibroblastos de injerto gingival marginal secretan TGF-β, sin ninguna diferencia entre las células estimuladas y no estimuladas. Un estudio [30] mostró que los fibroblastos de ligamento periodontal expresan TGF-β pero su producción no se vio afectada por LPS bacteriano, lo que sugiere que el TGF-β se acumulan en condiciones inflamatorias supresión de la función inmune celular, sin embargo, sin conducir a la destrucción del tejido a través de la estimulación con bacteriana LPS. Otro estudio que compara ligamento periodontal y las células gingivales [8] encontró que la secreción de TGF-β dependía de la concentración de estímulos, principalmente para los fibroblastos gingivales, siendo mayor cuando fueron estimulados con 10 mg /ml de LPS, mientras que la concentración de 1 mg /ml tal como se utiliza en el estudio actual, no mostró diferencias significativas en comparación con los fibroblastos no estimulados. La secreción de TGF-β aumento encontrado aquí por las células injertadas marginales podría estar relacionado con la reparación de tejidos y podría haber ocurrido por la necesidad de reparación continua, ya que la presencia constante de la microbiota surco dental induce cambios marginales.
Por último, los resultados indicaron que ni fibroblastos de la mucosa palatina ni del VEGF injerto gingival marginal secretada ni CXCL16, según los estímulos utilizados. En estudios anteriores [31, 32] han demostrado que los fibroblastos gingivales humanos estimulados por LPS, vesículas y proteínas de Pg Opiniones y Aa
membrana extracelular fueron capaces de producir VEGF cuando son estimuladas por dichos agentes. Tal vez en este estudio, el tiempo y la concentración de LPS utilizados no eran suficientes para la inducción de VEGF. En cuanto a CXCL16, se informó de que esta expresión fue inducida por otras citoquinas tales como IFN-γ y TNF-α, y su secreción fue mediada por ADAM 10 receptor de membrana, que regula la función de CXCL16 en tejidos inflamados [33]. Otro trabajo [19] mostró que la expresión CXCL16 por los fibroblastos gingivales estaba controlada por varias citoquinas como la IL-1β, TNF-α y γ IFN. De hecho, se podría especular que la secreción de CXCL16 no se detectó en el estudio actual, porque los fibroblastos fueron estimulados solamente por LPS bacteriano, y la acción de otras citoquinas u otros estímulos podría ser necesaria para la secreción de CXCL16 por los fibroblastos gingivales [19, 33].
la secreción heterogéneo de mediadores de la inflamación y reparación puede indicar que los fibroblastos injertados en una nueva región (margen gingival) anatómica puede estar influenciada por el microambiente en el momento estas células están en contacto con los productos bacterianos, participando de manera más eficaz en el contexto de la respuesta inflamatoria.
Conclusiones
los fibroblastos de la mucosa palatina presentan un comportamiento de adaptación con respecto a la secreción de citoquinas cuando se injerta en el margen gingival, que muestra la diferencia en la secreción de mediadores inflamatorios importantes para la homeostasis periodonto marginal.
abreviaciones
Pg:
Porphyromonas gingivalis
Ec:
Escherichia coli
ELISA :
Enzimoinmunoensayo ensayo
LPS:
lipopolisacárido
DMEM:
medio de Eagle modificado por Dulbecco
FBS: suero bovino fetal
FSP:
proteína de la superficie de fibroblastos
BSA: albúmina sérica bovina
DAPI: 49,6
-diamino-2-fenilindol
DMSO:
dimetilsulfóxido
MTT:.
[3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio
declaraciones
Agradecimientos
No hay conflictos de interés relacionados con este estudio. Este estudio fue apoyado en parte por el Sao Paulo de la Fundación de Investigación (FAPESP; Subvención # 2010 /01230-1 al SFC) y por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq; subvención # 480160 /2013-9 a CFS) <. br> autores de archivos presentados originales para imágenes
a continuación están los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12903_2013_366_MOESM2_ESM.tif autores 12903_2013_366_MOESM1_ESM.tif Autores archivo original de' archivo original de la figura 3 12903_2013_366_MOESM4_ESM.tif autores figura 2 12903_2013_366_MOESM3_ESM.tif Autores archivo original de la figura 4 12903_2013_366_MOESM5_ESM.tif archivo original de los autores de la figura 5 12903_2013_366_MOESM6_ESM.tif autores archivo original de la figura 6 Conflicto de intereses México la autores declaran que no tienen intereses en competencia.
autores de las contribuciones
FPA, ACFM, CRS, síndrome de fatiga crónica y la escoria concebido y planeado el proyecto. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
