Resumen Antecedentes
Un número de enfermedades orales, incluyendo la periodontitis, se derivan de microbiana biopelículas y están asociados con un aumento de la resistencia a los antimicrobianos. A pesar del uso generalizado de los enjuagues bucales se utiliza como medidas complementarias para controlar estos biofilms, su uso prolongado no se recomienda debido a varios efectos secundarios. Por lo tanto, los antimicrobianos de amplio espectro alternativas que minimicen estos efectos son muy codiciados. ácidos fúlvicos derivados de hidratos de carbono (CC-FA) es un ácido orgánico que se ha demostrado previamente para ser microbicida contra la Candida albicans
biopelículas, por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron evaluar la actividad antibacteriana de CHD-FA en las biopelículas por vía oral y derivados para investigar los efectos biológicos complementarios.
Métodos
concentraciones inhibitorias mínimas se evaluaron para CHD-FA y clorhexidina (CHX) contra una gama de bacterias orales utilizando la prueba de microdilución estandarizado para planctónicas y sésiles. También se empleó microscopía electrónica de barrido para visualizar los cambios en las biopelículas orales después del tratamiento antimicrobiano. La citotoxicidad de estos compuestos se evaluó frente a las células epiteliales orales, y el efecto de las enfermedades del corazón-FA en los marcadores inflamatorios de acogida se evaluó midiendo la expresión de mRNA y proteína.
Resultados
CHD-FA fue muy activo frente a todas las bacterias orales probado, incluyendo Porphyromonas gingivalis
, con una concentración mínima inhibitoria sésiles de 0,5%. Esta concentración se muestra para matar biofilms de especies múltiples en aproximadamente un 90%, niveles comparables a la de la clorhexidina (CHX). En un modelo de cultivo de células de mamíferos, se mostró que el pretratamiento de las células epiteliales con tamponada CHD-FA para regular a la baja significativamente los mediadores inflamatorios principales, incluyendo la interleuquina-8 (IL-8), después de la estimulación con un biofilm de múltiples especies.
Conclusiones
general, CHD-FA se demostró que poseen actividad antibacteriana de amplio espectro, con una función adicional de ser capaz de regular a la baja la inflamación. Estas propiedades ofrecen un espectro atractivo de la función de un compuesto de origen natural, que podría ser utilizado como una estrategia de tratamiento tópico sustitución para las enfermedades de biopelícula oral. Se requieren más estudios in vitro e in vivo
para determinar el mecanismo exacto por el cual la EC-FA modula la respuesta inmune del huésped.
material complementario Palabras clave
fúlvicos ácido clorhexidina Biofilm antibacteriana periodontitis inflamación electrónica
la versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-47). contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
la caries dental, gingivitis y la periodontitis son la la mayoría de las enfermedades microbianas comunes de la cavidad oral, con la mayoría asociado con un biofilm polimicrobiana [1, 2]. Las biopelículas son una colección de microorganismos multicelulares unidos uno a otro o sobre una superficie, y se encajan por una capa protectora de la matriz extracelular (ECM) [3]. Las biopelículas son de mayor importancia clínica que sus homólogos planctónicas de libre flotación debido a su capacidad innata para resistir la terapia y las defensas del huésped antimicrobianos. Esto es debido a la producción extensiva de ECM y de otros factores tales como el aumento de extrusión de antimicrobianos través de la actividad de flujo de salida mejorada de la bomba [3, 4].
Enjuagues bucales antimicrobianos son una de las principales estrategias terapéuticas y preventivas que actualmente se utilizan en la gestión de biofilm bucal enfermedades, de las cuales la clorhexidina (CHX) es ampliamente aceptado como el "patrón oro" [5]. Este agente antiséptico tiene una actividad superior a sus comparadores, y es a la vez bactericida y estático contra los microorganismos presentes en los biofilms orales con papeles en la patogénesis de la enfermedad oral. Además, su sustantividad proporciona una actividad prolongada por su capacidad de adsorberse sobre la película que se encuentra en las superficies de esmalte de los dientes [6]. A pesar de esto, varios estudios han demostrado que el uso a largo plazo de CHX puede no ser práctico ya que se asocia con la tinción de los dientes y el gusto alteraciones [7, 8]. Además, se han descrito los últimos informes de eventos adversos, incluyendo reacciones anafilácticas, a este compuesto [9]. También se ha demostrado recientemente ser ineficaz contra las biopelículas cultivadas a partir de aislados clínicos [10]. México La prevención y el tratamiento de las enfermedades de biopelículas orales, tales como las enfermedades periodontales y las infecciones de las mucosas, pueden beneficiarse de un compuesto que tiene la potencia de CHX con efectos secundarios mínimos, pero también provoca propiedades adyuvantes biológicos, tales como la alteración de las vías inflamatorias, que son claramente importantes en la patogénesis de la enfermedad de biofilm oral de [11, 12]. Un estudio previo ha demostrado CHX es capaz de regular a la baja mediadores de la inflamación cuando se enfrentan a un estímulo de bacterias [13], aunque los aspectos toxicológicos de CHX pueden ser la razón de la disminución de expresión. También hemos demostrado el beneficio del uso de agentes naturales en el tratamiento de las infecciones orales, donde el aceite de árbol de té (TTO) no sólo era no tóxico, pero fue capaz de disminuir la respuesta inmune del huésped a un estímulo hongos [14]. Además, nuestro grupo ha estimado previamente la actividad antiséptica de ácido de hidratos de carbono derivados de fúlvico (CHD-FA), donde se demostró que el compuesto era igual de eficaz contra Candida albicans
células planctónicas y biofilm. Mecánicamente este se identificó como un proceso de disrupción de la membrana que no fue afectada por mecanismos definidos de biopelícula de adaptación de resistencia [15]. CHD-FA es un ácido orgánico coloidal, que es un constituyente principal de los ácidos húmicos. Una forma purificada de CHD-FA ha sido recientemente producido por un proceso patentado, que se ha demostrado que es no tóxico en un modelo de herida de la rata, con las sugerencias de la actividad anti-inflamatoria [16]. Por otra parte, un estudio doble ciego, ensayo reciente aleatorizado, controlado indicó que fue bien tolerado en un estudio clínico de eccema [17]. México La finalidad de este estudio fue investigar si la CHD-FA tiene un amplio espectro de actividad contra las biopelículas microbianas de interés por vía oral para determinar si se podría utilizar como una alternativa a CHX enjuagues bucales base, que han conocidos efectos secundarios de un uso prolongado. El objetivo secundario del estudio fue determinar si la concentración antibacteriana de CHD-FA tenía propiedades inmunomoduladoras adyuvantes, según ha informado en otras partes [16]. Nos informan de que la EC-FA muestra la actividad microbicida contra las biopelículas rápida por vía oral pertinentes, y que también es capaz de regular negativamente la expresión de moléculas pro-inflamatorias en las células epiteliales por vía oral pertinentes.
Métodos Francia culture condiciones y la normalización
Una selección de cepas de laboratorio de comensal y bacterias patógenas asociadas con la enfermedad biofilms orales se utilizaron en este estudio, incluyendo Porphyromonas gingivalis ATCC 33277
y Fusobacterium nucleatum
ATCC 10596, que se mantuvieron a 37 ° C en anaeróbico exigente agar (FAA [Lab M, Lancashire, Reino Unido]) en condiciones anaerobias (85% N
2, 10% de CO 2 y 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Reino Unido] ). Streptococcus mutans
10449, Streptococcus mitis
NCTC 12261, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
OSM 1123 y Enterococcus faecalis
NCTC 5957 se cultivaron y se mantuvo a 37 ° C en Colombia agar sangre (CBA [Oxoid, Hampshire, Reino Unido ] en 5% de CO 2. Todos los aislamientos fueron almacenados indefinidamente en viales Microbank® (Pro-Lab Diagnostics, Cheshire, Reino Unido) a -80 ° C.
P. gingivalis y F. nucleatum
se propagaron en caldo anaeróbico 10 ml de Schaedler (Oxoid), S. mitis
y A. actinomycetemcomitans
fueron cultivadas en 10 ml de caldo de soja tripticasa (TSB [Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido]) suplementado con 0,6% extracto de levadura y 0,8% de glucosa. E. faecalis
se hizo crecer en TSB con un 0,25% de glucosa, y S. mutans
se cultivó en 10 ml de infusión de cerebro y corazón (BHI [Sigma-Aldrich]), todo a 37 ° C y en condiciones atmosféricas apropiadas. cultivos de una noche se lavaron por centrifugación (1.000 xg
) y se resuspendieron en 10 ml de PBS. Todas las bacterias fueron luego estandarizados y se ajustaron a una concentración de trabajo final de 5 × 10 4 y 1 × 10 7 células /ml para las pruebas de sensibilidad planctónicos y sésiles, respectivamente.
pruebas de susceptibilidad antibacteriana de células planctónicas y biofilm
Durante el curso de este estudio dos compuestos activos de la productos de higiene oral Dentracine (Fulhold Ltd, Ciudad del Cabo, África del Sur) y Corsodyl (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, Reino Unido) se pusieron a prueba, a saber, la EC-FA y CHX, respectivamente.
pruebas antimicrobianas para determinar llevó a cabo concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de las células planctónicas (PMIC) usando el método de microdilución en caldo CLSI M11-A8 para las bacterias anaeróbicas [18] y CLSI M7-A9 para las bacterias cultivadas en 5% de CO 2 [19]. Las concentraciones mínimas bactericidas (CMB) también se determinaron por métodos estándar de chapado.
Para las pruebas estandarizadas de biopelículas P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
y A. actinomycetemcomitans
se cultivaron durante 72 h y E. faecalis
durante 24 h en sus respectivos medios de comunicación y las condiciones atmosféricas, con la excepción de S. mutans
que se cultivó en BHI suplementado con 2% de sacarosa durante 48 h. Las biopelículas se cultivaron estáticamente en placas de microtitulación disponibles en el mercado de 96 pocillos de fondo plano (Corning Incorporated, Nueva York, EE.UU.) y las pruebas de sensibilidad sésiles se realizó como se describe en otro lugar [20]. Después del tratamiento antimicrobiano, biofilms se lavaron dos veces con PBS y 10% AlamarBlue® (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) se añadió a las biopelículas antes de la incubación durante 4 h en la oscuridad [21]. Las concentraciones mínimas inhibitorias sésiles (SMICS) se leyeron visualmente y ningún cambio en el color se definió como el SMIC. Las pruebas de todos los aislados planctónicas sésiles y se llevó a cabo por cuadruplicado en dos ocasiones separadas.
Pruebas de susceptibilidad antibacteriana de un biofilm de múltiples especies periodontal
Un modelo de biopelícula periodontal consiste de múltiples especies de P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
y A. actinomycetemcomitans
fue desarrollado para pruebas antimicrobianas. Todas las especies bacterianas se estandarizaron a 1 × 10 7 ufc /ml en saliva artificial (AS) como se describe anteriormente [22]. Este se compone de mucinas de estómago porcino (0,25% w /v), cloruro de sodio (0,35 w /v), cloruro de potasio (0,02 w /v), cloruro de calcio dihidrato (0,02 w /v), extracto de levadura (0,2 w /v ), laboratorio Lemco en polvo (0,1 w /v), peptona proteosa (0,5 w /v) en ddH 2O. Urea se diluyó en PBS (40% w /v) y se añadió a una concentración final de 0,05% (v /v) en AS. Las biopelículas se prepararon en placas de 24 pocillos (Corning, NY, EE.UU.) que contienen cubreobjetos Thermanox ™ personalizados (13 mm de diámetro, Fisher Scientific). Para la adición de cada especie bacteriana a la biopelícula una suspensión bacteriana estandarizada se preparó en 500 l de AS. Inicialmente, S. mitis
biofilms se hicieron crecer durante 24 h. a continuación, los medios de comunicación se ha retirado y estandarizado F. nucleatum
añadió, que se incubó anaeróbicamente durante otras 24 h. El sobrenadante se retiró de nuevo y estandarizados P. gingivalis
y A. actinomycetemcomitans
en AS añade a la biopelícula. Después, esto se incubó a 37 ° C en una cámara anaeróbica durante 4 días; cada día sobrenadantes fueron reemplazados con AS fresco. Como CHD-FA se demostró que era activo a 0,5% v /v en contra de todas las biopelículas bacterianas probadas en este estudio, esta concentración se utilizó además de 0,2% v /v CHX para el tratamiento de especies múltiples biofilms de 30 min, antes de que se lavó cuidadosamente con PBS , y la viabilidad biofilm determina utilizando AlamarBlue®. La absorbancia se leyó a 570 nm y la longitud de onda de referencia a 600 nm. El porcentaje de reducción en la viabilidad biofilm se calculó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este estudio se realizó en tres ocasiones separadas por triplicado.
Después del tratamiento antimicrobiano, biofilms se retuvieron y se utilizan para cuantificar el número de cada especie bacteriana que se encuentran después de CHD-FA y el tratamiento CHX en comparación con el control no tratado. En pocas palabras, las biopelículas se sometieron a ultrasonidos en 1 ml de PBS durante 10 minutos y el ADN extraído por medio de la MasterPure Gram Positivo ADN Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante. 1 l de ADN extraído se añadió a una mezcla maestra que contiene 12,5 l SYBR ™ más verde, 9.5 tratada con UV l RNasa libre de agua y 1 l de 10 mM cebadores adelante /atrás para cada especie bacteriana. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: A. actinomycetemcomitans
F - 5'GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA3 ', A. actinomycetemcomitans
R - 5'TGCAGCACCTGTCTCAAAGC3', F. nucleatum
F - 5'GGATTTATTGGGCGTAAAGC3 ', F . nucleatum
R - 5'GGCATTCCTACAAATATCTACGAA3 ', P. gingivalis
F - 5'GCGCTCAACGTTCAGCC3', P. gingivalis
R - 5'CACGAATTCGCCTGC3 ', S. mitis
F - 5'GATACATAGCCGACCTGAG3' , S. mitis
R -. Tres repeticiones independientes 5'CCATTGCCGAAGATTCC3 '
de cada parámetro se analizaron por triplicado utilizando la máquina MxProP PCR cuantitativa y el software MxProP 3000 (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). Las muestras se cuantificó basándose en una curva patrón previamente establecida compuestos de recuentos bacterianos conocidos. Cambios ultraestructurales Red de biopelículas bacterianas
microscopía electrónica de barrido (SEM) se realizó en S. mutans
, E. faecalis
y las especies múltiples biopelículas. Las células se estandarizaron en medios apropiados, como se describe anteriormente, y se hicieron crecer directamente sobre cubreobjetos Thermanox ™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para permitir la formación de biopelículas. A raíz de las biopelículas de maduración se lavaron cuidadosamente con PBS antes de sus respectivos tratamientos. Biofilms fueron entonces cuidadosamente lavadas dos veces con PBS y después se fijaron en 2% para-formaldehído, 2% de glutaraldehído y de cacodilato de sodio 0,15 M, y 0,15% w /v azul Alcian, pH 7,4, y se preparó para SEM como se describe anteriormente [23]. Las muestras fueron recubiertas por pulverización catódica con oro y se observan bajo un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400. Las imágenes fueron ensambladas utilizando el programa Photoshop (Adobe, San Jose, CA, EE.UU.).
Toxicidad de CHD-FA en una línea de células epiteliales orales
OKF6 /TERT2 células (regalado por el laboratorio Rheinwald, del Hospital Brigham y de la Mujer, Boston, EE.UU.), una línea celular de queratinocitos oral humana inmortalizada, se utilizaron para la determinación de la citotoxicidad de las enfermedades del corazón-FA. Las células fueron cultivadas a 90% de confluencia en queratinocitos medio libre de suero (KSFM) a 37 ° C en 5% de CO 2 y se sembraron a una densidad de 1 x 10 5 células /ml en una placa de 24 pocillos. Una vez que las células alcanzaron un 80-90% de confluencia, las células se lavaron cuidadosamente con PBS antes del tratamiento con 0,5% (v /v) CHD-FA en el pH nativo 2.0 y un pH neutro de 7,0 y 0,2% (v /v) CHX por 30 min. Después de 30 min, los compuestos se retiraron y las células cuidadosamente lavadas con PBS para eliminar cualquier activos residuales. Las células se incubaron en KSFM durante 4 y 24 h antes de la viabilidad celular se evaluó usando el ensayo de AlamarBlue®, como se describe anteriormente. Los estudios de viabilidad se llevaron a cabo por triplicado, en tres ocasiones distintas.
evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de la EC-FA
OKF6 /TERT2 células fueron cultivadas a 90% de confluencia en placas de 24 pocillos en KSFM definidos a continuación, tratados previamente con 0,5 % CHD-FA (pH 7,0) durante 30 min. CHD-FA a pH 2,0 era tóxico contra la línea celular utilizada en este estudio y por lo tanto no podía nos permitirá analizar las propiedades inmunomoduladoras potenciales de este compuesto. Por lo tanto, CHD-FA tamponado a pH 7,0 se utilizó para evaluar las propiedades biológicas adicionales de los compuestos. 0,5% CHD-FA a pH 2,0 y 0,2% CHX mostraron ser tóxicos para las células epiteliales, por lo que no se investigó adicionalmente. Las células se lavaron con PBS para eliminar residual CHD-FA. Como un agonista inflamatoria utilizamos las especies múltiples de biopelícula periodontal, como se describe anteriormente, que se adjunta a la parte inferior de un inserto de cultivo celular colgante (Millipore, Massachusetts, EE.UU.), utilizando vaselina, a continuación, colocamos adyacente a la monocapa celular. Las células se incubaron con el biofilm periodontal durante 4 y 24 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. Las células no tratadas previamente con CC-FA, o no desafiados con las biopelículas, sirvieron como controles apropiados. Después de la estimulación, los sobrenadantes y los lisados celulares fueron retenidas para evaluar la regulación de un panel de mediadores pro-inflamatorios.
Análisis de la expresión génica inicial se llevó a cabo usando un diseño personalizado RT 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, Reino Unido ). RT 2 matrices Profiler son un tiempo real SYBR ™ más verde basado en la PCR que permiten la detección de varios genes de interés, al mismo tiempo. Brevemente, 24 l de una mezcla maestra que contiene más verde SYBR ™, ADNc sintetizado utilizando la RT 2 la primera cadena de kit (Qiagen) y RNasa libre de agua se añadió a cada pocillo de la placa de perfiles RT 2, que ya contenía los cebadores directo e inverso para los genes de interés (IL-1a, IL-1, IL-6, TNF, CSF2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 y GAPDH). Dos réplicas de cada condición se utilizaron en la RT 2 Profiler, que se llevó a cabo en dos ocasiones separadas. Hotels, IL-8 la expresión de genes se analizó utilizando SYBR verde basada qPCR (Invitrogen), utilizando GAPDH como un servicio de limpieza gene. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: IL-8 F 5'CAGAGACAGCAGAGCACACAA3 ', IL-8 R 5'TTAGCACTCCTTGGCAAAAC3', GAPDH F 5'CAAGGCTGAGAACGGGAAG3 ', GAPDH R 5'GGTGGTGAAGACGCCAGT3'. Brevemente, el ARN se extrajo a partir de lisados celulares (Qiagen, Crawley, Reino Unido) y 55 ng /l de cDNA sintetizado usando el RT 2 primera hebra de ADNc kit de síntesis de (Qiagen, Crawley, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Se añadió 1 l de cDNA sintetizado a una mezcla maestra que contiene 12,5 l SYBR ™ más verde, con tratamiento UV 10,5 l de agua libre de RNasa y 0,5 l de cebadores directos /atrás. Tres repeticiones independientes de cada parámetro se analizaron por duplicado utilizando la máquina MxProP PCR cuantitativa y el software MxProP 3000 (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) y la expresión génica normalizada a la limpieza gen GAPDH según la -ΔΔCT
método 2 [24 ].
interleucina 8 de liberación (IL-8) en sobrenadantes de cultivo de células se evaluó por ELISA (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Los resultados se calcularon usando una curva de ajuste de 4 parámetros, cuantificar los cambios colorimétrico a 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Alemania).
El análisis estadístico
la producción de gráficos, la distribución de datos y análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 4; La Jolla, CA, EE.UU.). Después de evaluar si los datos se ajustaban a una distribución normal antes y después de las transformaciones de datos, análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y pruebas t se utilizaron para investigar las diferencias significativas entre los grupos independientes de datos que se aproximan a una distribución de Gauss. Una corrección de Bonferroni se aplicó para el valor p para dar cuenta de comparaciones múltiples de los datos. Los datos no paramétricos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney U-test
para evaluar las diferencias entre los dos grupos de muestras independientes. T de Student pruebas se utilizaron para medir las diferencias estadísticas entre los valores de Δ Ct
de los dos grupos independientes evaluadas en estudios de expresión génica, aunque los datos pueden ser representados como porcentaje o doble cambio en las figuras. La significación estadística se logra si P & lt; 0.05
.
Resultados
CHD-FA tiene actividad antibacteriana rápida y de amplio espectro
Corsodyl® (0,2% CHX) y Dentracine (0,8% EC-FA) son formulaciones orales que contienen los ingredientes activos CHX y la EC-FA, respectivamente. Ambos agentes se mostró a ser muy activo frente a todas las planctónicas y sésiles bacterias orales ensayadas (datos no presentados). Los estudios descritos en este manuscrito se centró en la CHX ingredientes activos y CHD-FA y ambos mostraron ser altamente eficiente en la inhibición y matando a todos los aislados ensayados orales cuando se cultivan o bien planktonically y como biofilms (Tabla 1). PMICs para los aislados orales variaron de 0,0625% a 0,25% para CHD-FA y de & lt; 0,00039% al 0,00078% de CHX. La relación /PMIC PMBC para CHD-FA y CHX eran ≤4, lo que indica que ambos compuestos muestran actividad bactericida. Ninguna de las especies bacterianas probadas eran notablemente más sensible o resistente a cualquiera de los compuestos. Tanto la EC-FA y CHX mostraron actividad contra las biopelículas maduras, con SMICS de 0,5% para las enfermedades del corazón-FA y de 0,003% a 0,025% de CHX. Curiosamente, a pesar de CHX fue eficaz a concentraciones más bajas, el pliegue del cambio del PMIC al SMIC varió de solamente 2 a 8 para CHD-FA, mientras que para este CHX varió de 2 a 64. En general, P. gingivalis
fue el más susceptible organismo a las terapias antimicrobianas probados, en particular para las células planctónicas. Además, todas las biopelículas bacterianas eran igualmente susceptibles a las enfermedades del corazón-FA con un SMIC de 0,5% .Tabla perfil 1 La susceptibilidad de las bacterias orales clínicamente relevantes a cuatro agentes antimicrobianos
MIC (%)
EC-FA
CHX
Organismo
PMIC
MBC
SMIC
Doble cambiar
PMIC
MBC
SMIC
doble cambio
(SMIC /PMIC)
gratis (SMIC /PMIC)
A. a *
0.25
0.25
0.5
2
0.00078
0.00313
0.025
32
S. mitis
0.0625
0.125
0.5
8
0.00078
0.00156
0.0125
16
S. mutans
0.25
0.25
0.5
2
0.00039
0.00078
0.025
64
E. faecalis
0.125
0.25
0.5
4
0.00156
0.025
0.003
2
F. nucleatum
0.125
0.5
0.5
4
0.00039
0.00078
0.195
32
P. gingivalis
0.0625
0.5
0.5
8
≤0.00039
0.00078
0.0625
≥16
*UN. . Actinobacillus
CHD-FA - (Fulhold Ltd, Sudáfrica), CHX -. (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, Reino Unido): perfil Un análisis más detallado del impacto de las enfermedades del corazón-FA en la estructura celular física se evaluó por SEM para biofilms representativos. tratamiento CHD-FA reduce la cantidad global de S. mutans
ECM (Figura 1B) y también causó la perturbación de la membrana celular, como se demuestra por la aparición pinchado de E. faecalis
(Figura 1D). Figura 1 CHD-FA reduce estructura de la membrana celular ECM y compromisos. S. mutans
(x2000) y E. faecalis
(X5000) biofilms se dejaron sin tratar (A y C, respectivamente) o se trataron con 0,5% (v /v) CHD-FA (B y D, respectivamente) durante 24 h en cubreobjetos Thermanox ™. Estos se procesaron a continuación y vieron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400 y las imágenes ensambladas utilizando software Photoshop. Tenga en cuenta la reducción de la matriz extracelular (B) y la perturbación de las membranas bacterianas de células (D), denotadas por las flechas en las células sésiles.
CHD-FA es eficaz contra una de múltiples especies biofilm periodontal
Dado que las biopelículas de la vía oral cavidad son de naturaleza polimicrobiana, hemos desarrollado un sencillo y reproducible de múltiples especies modelo representativo de la placa subgingival para probar la EC-FA (Figura 2A). La actividad antimicrobiana de CHD-FA en 1 x SMIC ha demostrado reducir significativamente la viabilidad celular a menos del 10% (p & lt; 0,0001), que era comparable a la CHX, que también reduce significativamente la viabilidad celular a 8% (p & lt; 0,0001). Sin embargo, después del tratamiento el número de cada especie dentro de los biofilms se cuantificaron y no mostró ninguna reducción significativa en la biomasa después de CHD-FA o tratamiento CHX, en comparación con el control sin tratar (Figura 2B). Figura 2 EC-FA mata e interrumpe múltiples especies biofilms periodontales. Multiespecíficas biopelículas periodontales se cultivaron en cubreobjetos Thermanox ™ en placas de 24 pocillos para un total de 5 días, con AS medios cambian cada día. Al desarrollo de la biopelícula, las células se trataron con 0,5% (v /v)-FA CHD y 0,2% (v /v) CHX durante 24 h antes de ser lavada con PBS. Reducción de la actividad metabólica se midió usando el ensayo de AlamarBlue® (A). Todas las muestras se analizaron por triplicado, en tres ocasiones distintas. Los datos representan la media ± SD (*** p & lt; 0,0001). Las biopelículas se retuvieron después del tratamiento con CC-FA o CHX y el ADN se extrajo para la cuantificación de cada especie utilizando SYBR ™ más verde basada qPCR (B). Las biopelículas también se analizaron mediante SEM en cualquiera de 2000x (C, E, G) y 5000x (D, F, H). Estos se procesaron y se vieron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6400 y las imágenes ensambladas utilizando software Photoshop. multiespecíficas no tratados biofilms se compararon primero a bajo aumento (C) para biopelículas tratados con 0,2% (v /v) CHX (E) y 0,5% (v /v) CHD-FA (G) durante 24 h y se demostró que biofilm tratamientos causaron desagregación. A mayor aumento los biofilms tratados con 0,5% (v /v) de CHD-FA durante 24 h dio lugar a una ECM fibroso, como se indica por las flechas (H), en comparación con el control (D) y CHX (F).
a continuación, se realizó un análisis SEM de estas biopelículas para evaluar cualquier efecto sobre la arquitectura de biofilm (Figura 2C-H). A menor aumento (x2000) se muestran tanto CHX y CHD-FA para interrumpir la arquitectura biofilm (Figura 2E y G) en comparación con el control sin tratar (Figura 2C), como se muestra por las áreas de biofilms desglosados dispersos. Por otra parte, en la alta ampliación (x5000) CHD-FA también parecía alterar la apariencia física general de la matriz de la biopelícula con mayores cantidades de ECM fibroso observados como se indica mediante las flechas (Figura 2H), en comparación con el control y CHX (Figura 2D y F).
CHD-FA altera la expresión de mediadores proinflamatorios
toxicidad CHD-FA se evaluó utilizando una línea celular epitelial oral relevante para determinar si existían efectos perjudiciales de los compuestos ensayados con anterioridad a las investigaciones inmunomoduladores. Tanto CHX y CHD-FA, a su pH natural de 2,0, mostraron ser altamente tóxico hacia las células epiteliales, reduciendo la viabilidad a menos del 10% después de 30 min de exposición (Figura 3). Sin embargo, cuando CHD-FA fue tamponada a un pH neutro de 7,0, no se observó disminución significativa de la viabilidad celular. Figura 3 CHD-FA no es tóxico contra una línea celular epitelial oral. Una línea de células epiteliales por vía oral relevante (OKF6 /TERT2) se cultivó a 90% de confluencia en placas de 24 pocillos para los estudios de toxicidad. Las células se trataron con 0,5% (v /v) CHD-FA a pH 2,0 y 7,0 y con 0,2% CHX para 30 min. Después del tratamiento, las células se lavaron cuidadosamente con PBS y se evaluaron la viabilidad celular usando el ensayo de AlamarBlue®, con leyó la absorbancia a 570 y 600 nm. Todas las muestras se ensayaron por triplicado, en tres ocasiones independientes. Los datos representan la media ± SD (*** p & lt; 0,0001).
Próxima establecidos para determinar si es o no CHD-FA fue capaz de inducir una respuesta biológica de las células epiteliales, principalmente mediante la medición de los cambios en los mediadores inmunes. Para evaluar esto, un modelo de biopelícula de cuatro especies fue desarrollado, en donde no se observaron problemas de toxicidad cuando está en contacto con la línea de células epiteliales a las 4 h (datos no mostrados). Por otra parte, hemos demostrado que las células CHD-FA tratados no alteran significativamente la liberación de IL-8 después de 4 h y 24 h (datos no mostrados). Los primeros estudios de expresión génica utilizando el RT 2 Profiler en las células epiteliales de pre-tratados con CC-FA antes de la exposición del biofilm mostraron una baja regulación general de mediadores pro-inflamatorios (Figura 4A). genes regulados hacia abajo significativas incluidas IL-6 (8,5 veces [p = 0,018]), IL-1β (7,05 veces [p = 0,012]), TNFa (5,22 veces [p = 0,013]) y IL-8 (4,24 veces [ ,,,0],p = 0,021]). Figura 4 EC-FA modula principales mediadores inflamatorios in vitro. Una línea de células epiteliales orales (OKF6) se cultivó a 90% de confluencia en placas de 24 pocillos para evaluar el efecto de las enfermedades del corazón-FA en la respuesta inmune del huésped. Las células se pre-trataron con 0,5% (v /v) CHD-FA de pH 7,0 durante 30 min, se lavaron con PBS y se estimularon con la de múltiples especies biofilm periodontal para 4 y 24 h. También se incluyeron controles no tratados. Las muestras fueron analizadas por triplicado y en tres ocasiones distintas. Se extrajo ARN de los lisados de células 4 h, el ADNc sintetizado y usado en el RT2 Profiler para analizar la expresión de un panel de mediadores pro-inflamatorios (A). Las muestras duplicadas de dos experimentos independientes se utilizaron en el RT2 Profiler. Los datos se representan por medio CI + 95%, con respecto al control no tratado. Las muestras también se analizaron para IL-8 la expresión génica utilizando qPCR basado SYBR® más verde ™ (B). La expresión de IL-8 está representado en relación con limpieza de genes; GAPDH. sobrenadantes retenidas también se utilizaron para medir la liberación de la proteína IL-8 mediante ELISA (C). Todas las muestras se ensayaron por triplicado, en tres ocasiones independientes. Los datos representan la media ± SD (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01)
A continuación centramos en la IL-8 expresión, uno de los genes afectados significativamente y un mediador clave de la inflamación periodontal.. En el nivel de mRNA, IL-8 fue significativamente pre-tratadas las reguladas en las células con CHD-FA después de 4 h, en comparación con el control no tratado (p = 0,0383) (Figura 4B). No se observaron diferencias estadísticamente significativas después de 24 h de estimulación (p = 0,1712). Además, a nivel de proteínas, la liberación de IL-8 se demostró que era significativamente las reguladas cuando las células fueron tratadas previamente con CHD-FA, después de 4 h (p = 0,008) y 24 h (p = 0,0037) estimulación biofilm ( Figura 4C). . Solo CHD-FA no tuvo efecto en las células epiteliales orales IL-8 mRNA o la expresión de proteínas (datos no presentados)
Discusión
enfermedades microbianas orales son típicamente mediada por biofilms; comunidades de microorganismos que co-agregado como estructuras adhesivas y tenaces y que presentan un incremento en la resistencia a los antimicrobianos [25]. Recientemente hemos informado de que los enjuagues bucales, incluyendo CHX no eran eficaces contra una variedad de cepas de MRSA clínicos [10], lo que sugiere que los agentes antimicrobianos alternativos debe ser investigado. De hecho, estudios recientes en C. albicans
han demostrado que el uso de moléculas de origen natural son eficaces contra ambos aislados por vía oral y sistémicamente derivados [14, 15]. Aquí mostramos que la CHD-FA, una molécula de origen natural antiséptico, muestra una rápida actividad antimicrobiana de amplio espectro, y también desencadena una actividad inmunomoduladora.
En primer lugar, realizamos una evaluación comparativa de las enfermedades del corazón y FA-CHX contra una gama de bacterias importantes asociados con infecciones biofilm orales.
