Resumen Antecedentes
Francia El creciente interés en los lactobacilos probióticos en el mantenimiento de la salud ha planteado la cuestión de los riesgos potenciales. Un posible efecto secundario podría ser un aumento acidogenicidad en la placa dental. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de lactobacilos probióticos en la producción de placas de ácido láctico (LA) in vitro e in vivo
.
Métodos Hoteles en la primera parte (A), suspensiones de dos cepas de lactobacilos (L. reuteri DSM 17938
, L. plantarum 299v
) se añadieron a suspensiones de la placa dental supragingival recogidos de los adultos jóvenes sanos (n = 25). Se analizó la producción de LA después de la fermentación, ya sea con xilitol o fructosa. En la segunda parte (B), los sujetos (n = 18) fueron dados pastillas con lactobacilos probióticos (L. reuteri DSM 17938
y ATCC PTA 5289) o placebo durante dos semanas en un ensayo doble ciego, aleatorizado cruzado . La concentración de LA en muestras de placa supragingival se determinó al inicio del estudio y después de 2 semanas. conteos salivales de estreptococos mutans (MS) y lactobacilos fueron estimados con los métodos del lado de la silla.
: Resultados de la suspensiones de placa con L. reuteri DSM 17938
produjeron significativamente menor en comparación con LA L. plantarum 299v o
los controles (p & lt; 0,05). La fructosa dio mayores concentraciones de LA que el xilitol. En la parte B, no hubo diferencias significativas en la producción de LA entre el valor inicial y el seguimiento en ninguno de los grupos y no hubo diferencias entre la prueba y el placebo fueron exhibidas. Los conteos salivales MS no se alteraron significativamente durante la intervención, pero los recuentos de lactobacilos aumentaron significativamente en el grupo de prueba (p & lt; 0,05). Conclusión
la producción de ácido láctico en las suspensiones de la placa y lactobacilos probióticos era dependiente de la cepa y la Este estudio proporciona evidencia de un aumento de la acidez de la placa por el suministro de lactobacilos probióticos seleccionados cuando se enfrentan a la fructosa o xilitol. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Nacional danesa sobre Ética de la Investigación Biomédica (Protocolo nº H-2-2010-112).
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Antecedentes
Las bacterias probióticas han sido utilizados para mejorar la salud gastrointestinal [1]. y no hay pruebas de que las bacterias probióticas de lactobacilos derivados también pueden tener influencias beneficiosos sobre la salud oral. Varios estudios han demostrado una disminución en el recuento de estreptococos mutans orales después del consumo a corto plazo de L. reuteri
[2-5] y L. rhamnosus
[6] y algunos han demostrado un efecto en la prevención y el control de la caries [7-9]. Sin embargo, se ha prestado menos atención a los riesgos potenciales del uso de probióticos. Los lactobacilos son considerados una parte de la microflora bucal residente, pero los recuentos elevados se han reportado después de regímenes probióticos [10]. Los lactobacilos son altamente acidogénicos y acidúricos pero se encuentra principalmente en las lesiones de caries profundas [11] y, por tanto, no se consideran implicados en la iniciación de la lesión de caries. La capacidad de los lactobacilos probióticos para fermentar los azúcares se ha demostrado que sea dependiente del tipo de azúcares y de variar entre las diferentes cepas en vitro
[12]. Por ejemplo, las cepas de L. plantarum
ácidos a un ritmo rápido producen mientras que L. reuteri
genera lentamente reacciones débiles con glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa y melibiosa, tanto en condiciones aeróbicas y anaeróbicas [12]. Sin embargo, la relevancia clínica de estos hallazgos apenas se ha investigado. Recientemente, Marttinen y compañeros de trabajo [13] informó de que la ingesta de comprimidos que contienen cualquiera de L. rhamnosus GG
o L. reuteri
no parecen afectar a los niveles de ácido láctico en la placa dental. Con la adición de bacterias probióticas a muchos productos disponibles en el mercado y su consumo creciente, los estudios sobre la seguridad de los lactobacilos destinadas a uso oral son importantes. Nuestro objetivo era, por tanto, para investigar el efecto de lactobacilos probióticos en la producción de ácido láctico en la placa dental supragingival in vitro
así como in vivo
. La hipótesis nula es que la acidogenicidad no sería diferente de placebo o controles
Métodos
La investigación se realizó en dos partes.; un estudio de laboratorio y un ensayo doble ciego, aleatorizado cruzado. Para la parte clínica, un cálculo del poder (α = 0,05 y β = 0,20) en base a los resultados experimentales indicaron que se necesitaban 18 sujetos en los grupos de prueba y placebo, respectivamente. Las cepas probióticas utilizadas en las dos partes están disponibles y se utilizan en bebidas de frutas y en tabletas comercialmente. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Nacional danesa sobre Ética de la Investigación Biomédica (Protocolo nº H-2-2010-112). número de ensayos clínicos NCT01700712.
Parte A
Veinticinco jóvenes adultos sanos de ambos sexos (edad media 27 años) con la salud oral sin compromisos (media CPOD (cariados, ausentes, dientes obturados) = 4) se inscribieron después informó consentimiento. Ninguno de los sujetos eran consumidores habituales de productos probióticos. Se les instruyó para que se abstengan de cepillado de los dientes durante 24 horas antes de su visita. la placa dental supragingival se recogió de todos los dientes con un explorador romo, se juntaron y se transfirió a un tubo de plástico. Las muestras frescas se suspendió y se homogeneizaron en PBS (tampón fosfato salino) (pH = 7,2) y se ajustaron a una densidad óptica de OD = 0,2 a 340 nm. Quinientos l de las suspensiones de placas se mezclaron después con 500 l de igualmente densos suspensiones de cualquiera de L. reuteri DSM 17938
(Biogaia, Estocolmo, Suecia) o L. plantarum 299v
(Probi AB, Lund, Suecia) en PBS. Las cepas de lactobacilos se cultivaron en Man Rogosa Sharpe (MRS) caldo (Oxoid Ldt., Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) en una incubadora anaeróbica a 37 ° C durante 24 h y después se lavaron dos veces en PBS. Un ml de la suspensión de la placa sin adición de bacterias probióticas sirvieron como control. También, uno suspensiones ml de lactobacilos con la misma densidad óptica que las otras muestras se utilizaron como controles. espectrofotométrico de línea de base (Genesys 10 Scanning uv, Thermo Scientific, MA, EE.UU.) Los valores se registraron y las suspensiones se incubaron a continuación durante 1 h en 37 ° C sin agitación. Las lecturas de OD-se repitieron y la producción de ácido se inició añadiendo 25 l de fructosa (10%) o xilitol (10%) a cada muestra. Después de 30 minutos de incubación adicional, la fermentación se detuvo por centrifugación durante 2 min (10.000 rpm) y el sobrenadante se retiró para análisis adicionales. Se determinó enzimáticamente la concentración de los isómeros L y D- de ácido láctico (LA) y se expresó como mg /ml con ayuda de un kit comercial (EnzyPlus, Biocontrol) según las instrucciones del fabricante. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y se calcularon la suma media de los isómeros L y D-.
Parte B Opiniones Treinta sujetos fueron examinados para detectar la presencia de estreptococos mutans salivales y dieciocho años eran elegibles para el ensayo clínico (14 femenino, 4 hombres; edad media = 26 años; CPOD = 2). Los criterios de inclusión fueron: i)
moderados a altos cargos de los estreptococos mutans salivales (& gt; 10
4 UFC) según se estimó con la prueba, ii)
no visibles lesiones de caries abiertas o periodontal del lado de la silla Dentocult SM la enfermedad, y iii) sobre ser no fumadores. Además, ninguno de los sujetos fueron consumiendo los productos probióticos, o había estado tomando antibióticos en los últimos dos meses. Después de la asignación de grupos y un período de adaptación de 3 días (fase 1) con la limpieza dental profesional, los participantes fueron instruidos para tomar tres comprimidos al día (mañana, tarde y noche) que contenían dos cepas de la bacteria probiótica L. reuteri
(DSM 17938 y ATCC PTA 5289; 1x10 8 UFC de cada cepa) o placebo durante 2 semanas (fase 2). Tanto los comprimidos fueron proporcionados por BioGaia AB (Suecia). muestras de saliva estimulada se recogieron después de 3 minutos de las gomas de mascar de parafina. Las muestras de placa supragingival reunidas se recogieron al inicio del estudio y después de la intervención. El número de estreptococos mutans y lactobacilos
en la saliva se determinó mediante la ayuda de un kit de prueba (SM Dentocult Strip mutans y Dentocult LB respectivamente, Orion Diagnostica, Finlandia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron recolectadas entre 10 y 11 am antes del almuerzo y aproximadamente 3-4 horas después de consumir el último comprimido. Después de un período de lavado de 3-semana (fase 3), la intervención 2-semana se repitió con la segunda tableta (fase 4). Una vez más, se recogieron muestras de línea de base y de seguimiento. Los comprimidos se suministran y se codificaron A o B por el fabricante y los productos de ensayo y de placebo eran idénticos en el sabor, composición y apariencia. El código no se dio a conocer hasta después de los análisis y los cálculos estadísticos. Durante todas las fases, se pidió a los sujetos para mantener sus rutinas normales de higiene bucal que incluye el cepillado de dientes con pasta de dientes con fluoruro. Fueron sin embargo firmemente solicitaron para evitar la ingesta de cualquier alimento suplementado con bacterias probióticas. Los ensayos de laboratorio
Todos los análisis y los recuentos bacterianos se hicieron sin conocimiento de la asignación de grupos. Las muestras de saliva se incubaron en 2 y 4 días, respectivamente, a 37 ° C para la presencia de estreptococos mutans y lactobacilos
con la ayuda de las pruebas selectivas por el lado de la silla (Dentocult SM y LB, respectivamente; Orion Diagnostica, Helsinki, Finlandia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La unidades formadoras de colonias se contaron en un microscopio estereoscópico (12 a 25 aumentos) por un solo examinador y anotó en categorías como se describe en las Tablas 1 y 2. La concentración de LA en las muestras de placa se determinó por duplicado como se describió anteriormente usando el fresco la placa samples.Table 1 puntuación lactobacilos salivales
puntuación de lactobacilos
0 (0 UFC /ml)
1 (103 UFC /ml )
2 (104 UFC /ml)
3 (& gt; 105 UFC /ml) guía empresas p
prueba BL
página 9
4
1
4
& lt; 0,05
prueba FU
0
4
10
4
Placebo BL
7
5
4
2
NS
Placebo FU
5
6
4
3
Las muestras recogidas de individuos (n = 18) antes (BL) y después (FU) un período de intervención 2-semana con L. reuteri
o placebo. . NS = no significativo sobre Table 2 mutans puntuación de los estreptococos
Streptococcus mutans puntuación
0 (& lt; 103 UFC /ml)
1 (103 & lt; 104 UFC /ml)
2 (104 & lt; 105 UFC /ml)
3 (≥105 UFC /ml) guía empresas p
prueba BL
2
4
8
4
NS
Prueba FU
1
7
6
4
Placebo BL
2
5
6
5
NS
Placebo FU
1
4
9
4
Las muestras recogidas de individuos (n = 18) antes (BL) y después (FU) un período de intervención 2-semana con L. reuteri
o placebo. NS = no significativo.
Métodos estadísticos
datos se procesaron con el software IBM SPSS (versión 19.0, Chicago Illinois, EE.UU.). En la parte A, las diferencias en los resultados entre las cepas probióticas comparación con el testigo se analizaron con la prueba de rangos de Wilcoxon signo. En la parte B, la producción de ácido se comparó antes y después de la intervención dentro de los grupos, así como entre los grupos antes y después de la intervención de prueba de Wilcoxon. Las diferencias en los lactobacilos y estreptococos mutans se analizaron mediante la prueba de Chi cuadrado. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. La fiabilidad de la puntuación bacteriana se analizó en una muestra aleatoria (20%) de las pruebas y la correlación intra examinador mostró un valor de CCI de 0,97.
Resultados
Parte A
Todas las muestras de placa a partir de los 25 sujetos producidos niveles detectables de ácido láctico y los niveles iniciados a partir de fructosa fueron significativamente más altos que los de xilitol (Figura 1). Sin embargo, se observaron importantes variaciones interindividuales. Después de la fermentación con fructosa, las suspensiones placa mixta con L. reuteri DSM 17938
produjo significativamente menos LA en comparación tanto con las muestras de control y las muestras con L. plantarum 299v
(p & lt; 0,05). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de control y las muestras con L. plantarum 299v
. Las suspensiones de control que contienen sólo uno de los dos lactobacilos tanto mostraron la producción de ácido de la misma magnitud que el control de la placa (L. reuteri DSM 17938
: significa 6,0 (4,8) y L. plantarum 299v
: media 9,3 (5,9 )). Después de la producción de ácido inició con xilitol, una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,035) se obtuvo diferencia entre la muestra de control y las muestras con L. reuteri DSM 17938
. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre las muestras de control y las muestras con L. plantarum 299v
o entre las dos muestras con lactobacilos probióticos añadidos. Las muestras que se añadió el xilitol a suspensiones puras de cualquiera de los lactobacilos ambos mostraron valores ligeramente más bajos que la suspensión de la placa, pero no fueron significativamente diferentes (L. reuteri DSM 17938
: significa 0,5 (3,4) y L. plantarum
299v: significa 3,4 (3,5)). Figura 1 la producción de ácido láctico significan en suspensiones de placa y con la adición de L. plantarum 299v y L. reuteri DSM 17938 después de la fermentación de la fructosa (a) y xilitol (b). Los controles son suspensiones placa sin bacterias probióticas. Los valores que se muestran son mg /ml después de 30 minutos de fermentación. ns = no significativo.
Parte B Opiniones No hubo diferencias importantes en la concentración de LA entre las muestras recogidas al inicio del estudio y seguimiento, ya sea en la prueba o el grupo de placebo (Tabla 3). Una vez más, las muestras suministradas con fructosa como sustrato muestran niveles significativamente más altos de ácido láctico producido que aquellos con xilitol añadido. Las puntuaciones de lactobacilos salivales en el grupo de prueba aumentó significativamente (p & lt; 0,05) desde el inicio hasta el seguimiento, pero no se observaron diferencias en el grupo de placebo (Tabla 1). Al inicio del estudio, nueve participantes en el grupo de prueba presentaron niveles no detectables de lactobacilos en comparación con seis en el grupo placebo. Después de dos semanas, todos los sujetos en el grupo de prueba que se muestra recuentos detectables mientras que cinco sujetos en el grupo de placebo todavía tenían niveles más allá de la detección. En la Tabla 2, se presentan las puntuaciones mutans salivales. No estadísticamente se observaron efectos significativos durante los períodos experimentales en cualquiera de los grupos. No tiene efectos secundarios tras el uso de las pastillas con probióticos dieron reported.Table 3 concentración de ácido láctico Media (DE) mg /ml en las suspensiones de la placa supragingival agrupados de los adultos jóvenes de salud (n = 18) Grupo
BL
FU
fructosa
xilitol
fructosa
xilitol
Prueba
8,6 (5,4)
2,9 (2,0) guía empresas 8.7 (4.7)
1,5 (3,5) guía empresas
Placebo
9.5 (4.2) guía empresas 3.2 (3.5) guía empresas 10,8 (5,2)
2,9 (3,4) guía empresas
las mediciones realizadas en la línea base (BL) y seguimiento (FU) después de que el período de intervención de dos semanas con L. reuteri gratis (prueba) o placebo. La producción de ácido se inició ya sea con fructosa o xilitol.
Discusión Francia El creciente interés en el uso de lactobacilos probióticos para mejorar la salud oral ha expresado su preocupación sobre sus posibles efectos secundarios. Un efecto secundario desde un punto de vista cariological sería un aumento de la producción de ácidos orgánicos en la placa dental. Por lo tanto, hemos querido investigar si la adición de lactobacilos probióticos a la placa dental podría influir en su acidogenicidad. En la parte de laboratorio, encontramos claras diferencias entre la producción de ácido láctico en suspensiones de placa agruparon y L. reuteri DSM 17938
por un lado y la placa además de L. plantarum 299v
controles o puro en el otro. Esto está de acuerdo con el estudio in vitro
en de Hedberg et al. [12], que encontró L. plantarum 299v
a ser más propensos a producir ácido entre seis cepas comerciales diferentes ensayadas. A la inversa, Haukioja y compañeros de trabajo [14] encontró que tanto L. reuteri DSM
(anteriormente ATCC 55730) y L. plantarum 299v
bajaron el pH significativamente después de la fermentación de la glucosa y la sacarosa. Según Hedberg et al. [12], la fermentación de la sacarosa y la glucosa por L. reuteri
PTA 5289 dio como resultado una disminución del pH (pH 5.2 a 6.8), mientras que la fermentación de fructosa causó un aumento menor en el pH (pH & gt; 6,8). Esto, junto con nuestros resultados actuales, indica que el azúcar elegido para la fermentación tiene un fuerte impacto en la producción de L. reuteri LA
. Por lo tanto, a partir de la primera parte de este estudio, parece claro que el acidogenicidad de suspensiones de la placa dental y las bacterias probióticas depende de la cepa y altamente influenciada por el tipo de azúcar disponible. Por otra parte, era de destacar que los resultados de la parte A estaban completamente de acuerdo con los hallazgos de los estudios previos in vitro
en [12, 14]. Esto indica que los métodos de laboratorio para la selección de candidatos para las enfermedades probióticos orales pueden ser útiles para diferenciar entre las propiedades deseadas y no deseadas dirigidas. Como la producción de ácido en suspensiones en el laboratorio no puede imitar las condiciones exactas en el complejo de biofilm in situ
, un paso más podría ser la de estudiar el pH de la placa in vivo
por un pH-metro micro.
en la parte clínica de este estudio no se encontraron diferencias en la producción de ácido antes y después de la intervención con L. reuteri o placebo
cuando las muestras de placa se fermentaban fructosa. Por lo tanto, la hipótesis nula no puede ser rechazada. Los resultados estaban de acuerdo con Marttinen et al. [13], que no demostró ninguna diferencia en la producción de ácido láctico después de la intervención, ya sea con L. reuteri o L. rhamnosus
GG. Se podría argumentar que el acidogenity disminución de las muestras de placa podría ser causada por la actividad antibacteriana de L. reuteri, pero debido al relativamente corto período de administración creemos que este no era el caso. Desde el xilitol no se piensa que es fermentado por las bacterias orales se esperaba [15] las bajas concentraciones de LA después de la adición de xilitol. No obstante, cabe destacar que los voluntarios en este proyecto tenían afecciones bucales saludables y lo más probable es que no totalmente representativa de sujetos con una biopelícula ecológicamente estresado y desequilibrada. En teoría, una condición de este tipo podría, posiblemente, aumentar la eficacia del tratamiento probiótico. Nosotros y otros grupos de investigación han demostrado que las condiciones de pH bajo pueden promover la inhibición del crecimiento de Streptococcus mutans por los lactobacilos probióticos [16, 17] e interferir con la formación de biopelículas [18]. Por lo tanto, nuevos estudios sobre pacientes de caries activas seleccionadas serían interesantes. La conclusión tan lejos de la parte clínica fue que a pesar de sus fuertes habilidades acidogenic, no parecían suplementos diarios de lactobacilos probióticos para aumentar la acidogenity de la placa dental cuando se expone a la fructosa o xilitol.
No hubo diferencias en los estreptococos mutans salivales los niveles entre los dos grupos y se registró ningún cambio después del período de intervención. Esto fue en contraste con varios estudios anteriores [2-5], pero de acuerdo con otros [9, 19, 20]. Las diferencias en las cepas bacterianas, y las concentraciones de los regímenes de dosis y grupos de edad utilizados en los ensayos anteriores impiden cualquier comparación entre las pruebas y las conclusiones de ese modo firmes. En general se cree que los suplementos de probióticos pueden ser más eficaces en edades preescolares que en los adultos [21], que en cierta medida puede explicar nuestros resultados negativos. El aumento del número de lactobacilos en el grupo de prueba era lógico y apoya las conclusiones de Marttinen y compañeros de trabajo [13] aunque no estábamos en condiciones de analizar si es o no se debió a la cepa específica de la prueba. Sin embargo, es poco probable que un cambio permanente de la composición microbiana se produce [22, 23]. Caglar et al. [22] estudiaron el número de portadores de L. reuteri ATCC 55730
después de un período de admisión 2-semanas de comprimidos que contienen dicha cepa. El uso de medios selectivos y análisis para Reuterin producción, las bacterias se recuperó en todos los sujetos de prueba inmediatamente después del período de intervención, pero fue eliminado gradualmente dentro de unas pocas semanas. Sin embargo, es todavía una cuestión abierta si un colonización del biofilm oral de por sí
es un requisito absoluto para la acción probiótica.
Conclusión
Los resultados del presente estudio sugieren que la acidogenicidad de la suspensión de la placa dental y lactobacilos probióticos depende de la cepa e influenciado por el tipo de azúcar disponible. Por otra parte, el presente estudio proporciona evidencia de un aumento de la acidez de la placa por el suministro de lactobacilos probióticos seleccionados cuando se enfrentan a la fructosa o xilitol.
Declaraciones
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Mads Møller, Jesper Olsen y Rasmus Ryhl para la recogida de muestras de placa y Ulla Larsen ayuda de laboratorio experto. Los productos experimentales fueron amablemente proporcionados por BioGaia AB, Suecia.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de las imágenes. 'archivo original para la figura 1 Conflicto de intereses
MKK haber recibido una beca de investigación de Biogaia AB, Suecia para ensayos clínicos de los probióticos orales.
autores 12903_2011_237_MOESM1_ESM.jpeg Autores contribuciones
MKK contribuyó con el trabajo de laboratorio, la adquisición, análisis e interpretación de datos y redacción del manuscrito. ST contribuyó con el diseño, la interpretación de los datos y la revisión del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
