Resumen Antecedentes
virus del papiloma humano (VPH) son oncogénicos y principalmente asociado con cánceres de cuello uterino. La evidencia reciente ha demostrado la infección por HPV en otros tejidos, incluyendo el epitelio oral y mucosa. Aunque un reciente estudio piloto proporciona nueva información sobre el estado del VPH oral en adultos sanos de Nevada, no se obtuvo información sobre la prevalencia del VPH oral entre niños o adolescentes, por lo tanto, el objetivo de este estudio es proporcionar información más detallada acerca de la prevalencia oral de alto VPH de alto riesgo entre los niños y adolescentes en Nevada
Métodos
Este estudio retrospectivo utilizado muestras de saliva recogidas con anterioridad, obtenido a partir de pacientes de clínicas dentales pediátricos (2 años de edad - 11). y adolescentes del distrito escolar local (12-17 años) de alta alto riesgo de detección del VPH (n = 118) mediante qPCR para la cuantificación y confirmación de la sensibilidad y especificidad analítica.
: resultados de la Un pequeño subconjunto de muestras de saliva se encontró que el puerto de HPV16 de alto riesgo (n = 2) y HPV18 ( n = 1), lo que representa un 2,5% del total. Los tres fueron obtenidos de varones adolescentes, y dos de estas tres muestras eran de participantes blancos.
Conclusiones
Aunque este estudio retrospectivo no podía proporcionar correlaciones con datos de comportamiento o socioeconómicos, este proyecto proyectó con éxito más de un centenar de muestras de saliva para el VPH de alto riesgo, lo que confirma tanto HPV16 y HPV18 cepas estaban presentes en un pequeño subgrupo. Con cada vez más pruebas de infección por VPH oral en los niños, este estudio proporciona información crítica de un valor significativo a otros profesionales de la salud dental, médico, oral y público que tratan de promover una comprensión de la salud oral y el riesgo de enfermedad en la población pediátrica.
Palabras clave
Virus del Papiloma humano La saliva de detección de material oral electrónica complementaria
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-43) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
. antecedentes Francia el virus del papiloma humano (VPH) abarcan una familia estrechamente relacionada de virus de ADN, que son capaces de integrarse en el genoma humano para impulsar la transformación del epitelio infectado [1-4]. Gran parte de la evidencia epidemiológica para la carcinogénesis del VPH impulsada, así como los mecanismos biológicos, se han derivado de los estudios de cáncer de cuello uterino [5-7] que aisló VPH de alto riesgo tanto de los carcinomas de células escamosas y adeno [6-9] . A pesar de VPH de alto riesgo impulsa el proceso de transformación y la malignidad de casi todos los cánceres de cuello uterino, la infección por VPH es ahora conocido para modular la transformación del epitelio en cáncer de mama, de pulmón, de pene, anal, y también los tejidos orales [10-20]. Francia El primaria factores de riesgo de carcinogénesis oral son el tabaco y el consumo de alcohol, aunque las nuevas líneas de evidencia sugieren ahora VPH también puede ser un factor de riesgo independiente [17-23]. La mayor prevalencia de cepas de VPH de alto riesgo en los tumores orofaríngeos precancerosas y cancerosas sugiere que el VPH puede infectar preferentemente el desarrollo de cánceres o establecido, modulando así la progresión cancerígena y en última instancia, influir en los resultados de salud [24-26]. De hecho, alguna evidencia sugiere que la infección por VPH de alto riesgo puede estar asociado con una mejor respuesta al tratamiento y mayores tasas de supervivencia [27-29], mientras que los informes contradictorios han demostrado disminuir significativamente la supervivencia de los pacientes [30-32] o no han observado discernible y efectos estadísticamente significativos [33].
a pesar de la naturaleza contradictoria de estos resultados, es evidente que el VPH puede estar implicada en la modulación de la respuesta tumoral y la progresión cancerígena, por lo tanto, muchos de estos estudios han proporcionado valiosa información epidemiológica con respecto a los cuales de alto riesgo cepas de VPH están implicados con mayor frecuencia en estos casos [34-36]. Estos estudios han revelado HPV16, HPV18 y, en menor medida, representaron la gran mayoría (71 a 94,7%) de HPV oral de alto riesgo detectado [17, 18, 21-23, 34-36]. Por otra parte, la nueva evidencia sugiere ahora que estas cepas de VPH de alto riesgo específicos (HPV16 y HPV18), pueden iniciar la carcinogénesis oral entre la fracción más pequeña de pacientes con cáncer bucal que no consumen alcohol o usan tabaco [37, 38]. Basado en
en las conclusiones de VPH oral en distintos del tabaco y no asociados con el alcohol cánceres orales, otros esfuerzos recientes se han centrado más específicamente para evaluar la prevalencia del VPH oral y la transmisión dentro de las poblaciones sanas, que también confirmó que HPV16 y HPV18 son los más comúnmente detectado alta orales cepas de VPH de Alto Riesgo [39-41] entre los adultos sanos.
con este fin, un estudio piloto reciente evaluación de VPH oral entre los adultos sanos se realizó en Nevada [42], un estado documentado recientemente con el aumento de las tasas de cáncer de orofaringe, en marcado contraste con las tasas decrecientes observadas en los estados vecinos y los EE.UU. de manera más general [43, 44]. Este estudio reveló la presencia de HPV16 cepa de alto riesgo, pero no HPV18, entre las mujeres y las minorías, los únicos subgrupos de población demostrado tener el aumento de las tasas de cáncer orpharyngeal - a pesar de las tasas de disminución global observada en la población general [45-47]. En este estudio se utilizó un procedimiento de selección basado en la saliva, que forma parte de una tendencia creciente hacia métodos menos invasivos, como lavage- oral y proyecciones basadas en la saliva, para analizar el estado de VPH oral entre los pacientes adultos sanos [48-51]. Aunque
las tasas de prevalencia variaron ampliamente, estos estudios han sugerido que la infección oral por VPH puede ser cada vez mayor, no sólo entre los adultos, pero más específicamente entre los jóvenes adultos, adolescentes y niños [52-54] .Para ello, algunos estudios han examinado el VPH oral en niños o adolescentes, aunque muchos de ellos se centró principalmente en los niños con condiciones médicas subyacentes, tales como la co-infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) [55-57]. La mayor parte de otras investigaciones, sin embargo, se ha centrado más específicamente en dilucidar el papel de la transmisión del VPH vertical en los recién nacidos, lo que demuestra el potencial de adquirir el VPH de alto riesgo durante el proceso de parto y el parto, aunque estas infecciones suelen resolver [58-63].
Sin embargo, la nueva evidencia está emergiendo que la infección por VPH de alto riesgo por vía oral demostrada en niños normales y sanas, con las tasas más altas observadas entre los niños menores de 7 años de edad (7.9% -8.7%), y la disminución de las tasas observadas entre los adolescentes sanos (13- 20 años de edad; 5,1% -5,2%) y adultos sanos (3,5%) [64, 65]. Estas observaciones pueden sugerir que la infección oral por VPH puede ocurrir a través del contacto personal con miembros de la familia o por contacto con objetos inanimados y otros vectores en los centros de guardería, preescolar o en entornos de educación primaria, con la mayoría de los niños inmunológicamente competentes para resolver estas infecciones [66]. Sin embargo, algunas infecciones pueden persistir y su contribución al desarrollo de los cánceres orales y otras patologías que no queda claro
Aunque un estudio piloto se llevó a cabo recientemente para evaluar la condición de VPH oral, esto implicó pacientes adultos sanos única -. Sin información obtenida acerca orales la prevalencia del VPH en los niños o adolescentes. En base a las pruebas anteriores que demuestran un cierto nivel de infección por VPH oral en niños y adolescentes sanos, combinado con la falta de datos sobre esta población, más concretamente, el objetivo de este estudio es proporcionar información más detallada acerca de la prevalencia de cepas de VPH de alto riesgo HPV16 y HPV18 en la cavidad bucal de los niños y adolescentes en Nevada.
resultados
la proporción de especímenes femeninos y masculinos de la muestra del estudio no fue estadísticamente diferente de las proporciones generales dentro de la comunidad local del Condado de Clark, Nevada ( Tabla 1). Más específicamente, el porcentaje de hembras y machos de la muestra fue aproximadamente igual (51,7% y 48,3%, respectivamente), que no fue significativamente diferente de la población de área local (p = 0,7051
). La proporción de muestras minoritarios (no blanco) fue mucho mayor en la muestra de estudio (70,3%) que en la población local (39,1%), que fue estadísticamente significativa (p
& lt; 0,0001). Aunque los datos de la población local no estaban disponibles para las comparaciones específicas por edad, la muestra estuvo compuesta por más de los niños más pequeños (edades 2-11: 59,3%) que entre los adolescentes y los adolescentes (12-17: 40,7%) Tabla 1 Análisis demográfico. de los participantes del estudio
CCSD (n = 48) guía empresas UNLV-SDM (n = 70) guía empresas de la muestra total (n = 118) guía empresas del Condado de Clark población
El análisis estadístico
Género
Mujer
n = 30 (62,5%)
n = 31 (44,3%) guía empresas n = 61 (51,7%) guía empresas n = 969.781 (49,7%) guía empresas χ2 = 0,17849 df = 1
Hombre
n = 18 (37,5%) guía empresas n = 39 (55,7%) guía empresas n = 57 (48,3% )
n = 981.488 (50,3%) guía empresas p = 0,7051
Race
blanca
n = 12 (25%) guía empresas n = 23 (32,9%) guía empresas n = 35 (29,7%) guía empresas n = 1.188.323 (60,9% ) guía empresas χ2 = 28,3634 df = 1
No blanco
n = 36 (75%) guía empresas n = 47 (67,1%) guía empresas n = 83 ( 70,3%) guía empresas n = 762.946 (39,1%) guía empresas p Hotel & lt; 0,0001
Edad
2-11
n = 0 (0%) guía empresas n = 70 (100 %) guía empresas n = 70 (59,3%) guía empresas N /A
12-17
n = 48 (100 %) guía empresas n = 0 (0%) guía empresas n = 48 (40,7%) guía empresas N /A
detallada análisis de muestras de saliva reveló cierta variabilidad entre los recuentos de células, concentración de ADN y la pureza de ADN entre las muestras (Figura 1). Los recuentos de células variaron entre D 0,8 - 2,3 x 10
6 células /ml, que se clasifica además en baja (0,8 - 1,4 x 10 6) y alta (1,6 - 2,3 x 10 6) los recuentos de células . Se aisló el ADN con éxito de todas las muestras de saliva, con la concentración media de ADN para muestras observadas en 842,7 ng /mL. Se han encontrado muestras de cada cohorte (CCSD, UNLV) con recuentos de células en la categoría baja para tener concentraciones medias más bajas de ADN que las muestras de la misma cohorte con recuentos de células en la categoría alta. Las medidas de absorbancia y análisis de la relación A260 /A280 confirmaron la pureza de ADN aislados, que era aproximadamente igual entre las cohortes, así como entre las muestras en el bajo y categorías de recuento de células de alta. Figura 1 Análisis de muestra de saliva: recuento de células, aislamiento del ADN y la pureza. A) Después de la centrifugación y resuspensión de células en solución salina, se observó que el número de células para cada muestra se determinó que revela las tres cuartas partes de las muestras UNLV tener bajos recuentos de células (0,8-1,4 x 106 células /ml), mientras que sólo un tercio de la muestra CCSD fueron estimados * para tener recuentos de células inferiores. B) No se han encontrado concentraciones de ADN a ser mayor en las muestras de recuento de células de alta dentro de cada cohorte (CCDS: 859,4 y 707,1 ng /l, respectivamente; UNLV: 886,3 y 910,2 ng /l, respectivamente). pureza del ADN promedio de entre 1.71 y 1.82. C) La igualdad de concentraciones de ADN extraído (1 l) se escrutó utilizando GAPDH, que no reveló una considerable variación en la intensidad de banda entre las cohortes de muestras de categorías de alto y bajo recuento de células.
Las muestras de ADN extraído se rastrearon posteriormente para la presencia de HPV16 y HPV18 usando PCR (Figura 2). Esta evaluación dio tres muestras positivas para el VPH (n = 3/118), que representa 2,5% del total proyectado. Dos de estas muestras (S5, S38) albergaban ADN de HPV16 y se encontró uno de albergar HPV18 ADN (S7). Procesamiento de las muestras de ADN utilizando qPCR proporcionado evaluaciones cuantitativas, así como mediciones de sensibilidad y especificidad. Análisis del número de copias por genoma para la limpieza de genes (β-actina) para el VPH-positivo (rango: 25 - 40 copias /genoma) y las muestras de VPH-negativas (4 - 93 copias /genoma) los valores que estaban muy por encima del revelado valor de corte (& gt; 0,1 copias /genoma). Los resultados del análisis qPCR revelaron número de copias de muestras positivas para el VPH (rango: 150 - 880 copias /genoma) que fueron significativamente más altos que las muestras de VPH-negativas (rango: 0,00148 - 0.0000016 copias /genoma), que podrían ser distinguidos usando el valor de corte (& gt; 0.001 copias /genoma). Estos análisis revelaron sin falsos positivos o falsos negativos, lo que demuestra suficiente sensibilidad y especificidad para determinar la proporción de muestras verdaderas positivas para el VPH (3/118 o 2,5%; 3/3 o 100%) y las muestras verdaderas de VPH-negativas (115/118 o 97,5%; 115/115 o 100%). La Figura 2 muestra la detección Saliva: análisis de los resultados de VPH qPCR. A) Se encontraron tres muestras para albergar el ADN del VPH: Las muestras de HPV16-positivas (S5, S38); Una muestra fue el VPH-positivo (S7). B) qPCR análisis reveló muestras positivas para el VPH tenían valores muy por encima del valor de corte establecido (& gt; 0.001 copias /genoma). C) Todas las muestras de tres VPH-positivos eran varones, lo que representa el 2,5% del total (n = 118). Dos de las tres muestras positivas para el VPH eran de participantes blancos. Todas las muestras de tres VPH-positivas eran de la cohorte de CCSD (edades: 12-17); Ambas muestras de HPV16-positivas se obtuvieron de los participantes de edad de 14 años, mientras que la muestra HPV18-positivas se obtuvo de una joven de 15 años.
A pesar de la relativamente pequeña proporción de muestras positivas para el VPH no permite inferencias más amplias, un análisis descriptivo de la información demográfica con respecto a estas muestras reveló que los tres se derivaron de los hombres (n = 3/57 o 5.3%) y ninguno se derivaron de las hembras. Las muestras de dos HPV16-positivas se obtuvieron de los participantes blancos de entre 14 (n = 2/35 o 5,7%), mientras que la muestra HPV18-positivas se recogió de un participante no blanca de 15 años (n = 1/83 o 1.2%) . Todas las muestras de tres VPH-positivos fueron de la cohorte de CCSD (adolescente) (n = 3/48 o 6,25%), mientras que no se observó ninguna en la Universidad de Las Vegas-SDM cohorte (pediátrica) (n = 70).
Discusión
el objetivo principal de este estudio fue evaluar a los niños y adolescentes sanos normales en Nevada por la presencia de VPH de alto riesgo por vía oral. Este análisis retrospectivo se utilizaron muestras de saliva existentes, recogidas de pacientes dentales pediátricos y adolescentes locales del distrito escolar, para obtener datos novedosos de esta población juvenil no probado previamente complementando así el cuerpo cada vez mayor de pruebas con respecto a la prevalencia del VPH oral en los niños. Lo más importante, estos datos han sugerido una prevalencia oral de manchas de VPH de alto riesgo de aproximadamente el 2,5%.
Estudios recientes de los adultos sanos han encontrado tasas de prevalencia similares, que oscila entre 3,1 y 5% [40, 41]. De hecho, el reciente estudio piloto de los adultos sanos en Nevada informó VPH oral en un 2,6% de 151 pacientes sin cáncer [42]. Los resultados del presente estudio fueron marcadamente diferentes, sin embargo, debido a que dos de las tres muestras de VPH-positivos se obtuvieron de los blancos y todos eran de varones - mientras que el estudio previo de los adultos encontró VPH oral entre las mujeres y las minorías solamente. Otra evidencia sugiere que a pesar de las muestras de hembras y machos tuvieron tasas similares de VPH oral (56 y 44%, respectivamente), las muestras de VPH-negativas de ese estudio fueron abrumadoramente femenino (82%) - proporcionar alguna evidencia de una posible masculina, fenómeno similar a los resultados de los estudios actuales [67] en función del género. Aunque hay muchas explicaciones posibles, tales como la naturaleza transitoria de la población local, muchos otros factores como el estrés, la dieta, el ingreso, la pobreza, el estatus socioeconómico y la exposición oral de VPH pueden afectar a diferentes grupos raciales y de ambos sexos de manera similar.
Este estudio representa un punto de inflexión importante en los esfuerzos de salud pública para dilucidar la detección de VPH oral en un área geográfica conocida por alto que el promedio (y anteriormente en aumento) de las tasas de cáncer de orofaringe [43, 44]. Sin embargo, este estudio tiene varias limitaciones que deben ser reconocidos. En primer lugar, la naturaleza retrospectiva de este estudio limita las inferencias que se podrían hacer, a diferencia de otros estudios prospectivos recientes de VPH oral en niños y adolescentes [64-68]. Además, estaban disponibles, tales como los comportamientos de ingresos o de tabaquismo de los padres no hay datos sobre el comportamiento o socioeconómicos detallados, debido a la naturaleza de este estudio piloto retrospectivo. Se espera que las futuras investigaciones relacionadas con el VPH oral, proporcionará información adicional con información más detallada del comportamiento, así como los datos relativos a la vivienda, la educación, los ingresos y otros indicadores socioeconómicos [67-71].
Conclusiones
Este proyecto proyectó con éxito muestras de saliva para VPH de alto riesgo, lo que confirma las dos cepas de VPH 16 y VPH 18 estaban presentes en un pequeño subgrupo. Aunque el trabajo previo se ha centrado en la transmisión del VPH bucal de la madre al recién nacido durante el parto y la lactancia [58-63, 68], existe una creciente evidencia para sugerir que, tras el período perinatal, la transmisión del VPH oral a través del contacto personal cercano, tales como comer compartida utensilios, juguetes, besos y baño pueden ser responsables de la transmisión del VPH oral (principalmente HPV16) en niños y adolescentes [72-75]. Este estudio, por tanto, proporciona información crítica de un valor significativo a otros profesionales de la salud dental, médico, oral y público que tratan de promover una comprensión de la prevalencia del VPH de alto riesgo entre los niños como parte de una comprensión más amplia de riesgo para la salud y la enfermedad oral en pediatría Métodos poblaciones.
tamaño de la muestra
Dada la prevalencia de las infecciones orales por VPH de alto riesgo en el estudio previo que proyectó adultos sanos dentro de esta área geográfica, el tamaño apropiado de la muestra se calculó utilizando la siguiente fórmula: n = Z
2
P gratis (1 - P
) /d
2, donde n = tamaño de la muestra, Z = Z
estadística para un nivel de confianza, P =
prevalencia esperada, y d =
precisión [76, 77]. Utilizando el nivel del 95% de confianza, se determinó el valor de Z para ser
1,96; Utilizando la anterior proporción /prevalencia de VPH de alto riesgo del 2,6%, el valor de p
se estableció como P = 0,026
; El valor de d
debe calcularse en 0,5 (P
), lo que resulta en un valor de d = 0,013
. El uso de estas entradas, el tamaño mínimo de la muestra para este estudio se calculó que era n = 75. Los sujetos humanos
Francia El protocolo de este estudio titulado "Evaluación retrospectiva de microbiana existente en presencia de saliva Repositorio: un estudio molecular PCR-Based Oral de las poblaciones microbianas de muestras de saliva existentes "fue presentada, en su versión modificada, y aprobado por la Oficina de UNLV de Integridad de la Investigación - sujetos Humanos (OPRS # 1104-3801M) el 10 de mayo de 2011. se recogieron las muestras de saliva existentes durante dos estudios previos en los últimos la Escuela de Medicina Dental de la Universidad de las Vegas de (SDM) durante el período 2009-2010. Las muestras de saliva de un estudio previo de los adolescentes (14-15 años de edad) se obtuvieron a partir de una muestra de escuelas seleccionadas dentro del Condado de Clark, Nevada School District (CCSD; n = 48); obtenido originalmente para el propósito de la topografía niveles de bacterias cariogénicas orales. Las muestras de saliva de los niños pequeños (2-11 años de edad) se obtuvieron a partir de una muestra de conveniencia dentro de la clínica dental pediátrica UNLV-SDM (n = 70); obtenido originalmente para el propósito de la revisión de metales pesados (plomo o Pb) carga. En resumen, para las colecciones originales de la muestra de saliva en CCSD y UNLV-SDM, los padres y los sujetos fueron reclutados en el sitio. Criterios de inclusión: Se requiere permiso de Consentimiento Informado /Padre y llevó a cabo en el lugar, así como un asentimiento a participar en la investigación para todos los niños mayores de siete que eran capaces de leer. Criterios de exclusión: los sujetos menores de siete años de edad, los sujetos que se negaron a participar, y los sujetos con los padres que se negaron a participar. Cada muestra se le asigna un número único, generado de forma aleatoria para evitar el sesgo de la investigación, con la única información demográfica con respecto a las muestras de saliva: sexo, edad y origen étnico de los participantes del estudio original. Este proyecto actual es un análisis retrospectivo de estas dos colecciones de muestras de saliva; el tamaño de la muestra combinada total de este estudio fue n = 118. La saliva
protocolo de recogida de
En resumen, los sujetos que aceptaron participar se les dio una pequeña, recipiente de recogida de saliva estéril, 50 ml tubo de polipropileno estéril (Fisher Scientific: Fair Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.). Los participantes se les pidió que masticar en un pequeño trozo de cera de parafina durante un minuto y después de expectorar, de acuerdo con el protocolo del estudio piloto previo [42]; volúmenes de muestra variaron de aproximadamente 50 l a 2,5 l. Las muestras se almacenaron en hielo hasta su transporte a un laboratorio para el análisis biomédico. Cada muestra de saliva se le asigna un número único, generado de forma aleatoria para evitar el sesgo de la investigación. La información demográfica sobre la muestra fue recogida al mismo tiempo, que consistía en edad, género, y etnicidad solamente. conteo
celular y aislamiento de ADN
Todas las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 2100 g (RCF) y el sedimento celular se lavó con solución salina amortiguada con fosfato 1X (PBS) (Hyclone: Logan, Utah, EE.UU.) y se resuspendieron en 5 ml de 1X PBS. El número de células se determinó utilizando azul de tripano (Fisher Scientific: Fair Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.) utilizando un microscopio invertido Zeiss Axiovert 40 (Carl Ziess, Inc: Thornwood, Nueva York, EE.UU.) y un hemocitómetro (Fisher Scientific: Fair Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.). Para determinar si las muestras albergaban el virus VPH, se aisló el ADN de la muestra de saliva utilizando un mínimo de 3,5 x 10 5 células utilizando el kit de aislamiento de ADN GenomicPrep (Amersham Biosciences: Buckinghamshire, Reino Unido), utilizando el procedimiento recomendado por el el fabricante como se describe anteriormente [12, 42, 78, 79]. pureza del ADN se calculó utilizando mediciones de la relación de absorbancia a 260 y 280 nm (relación A260 /A280 entre 1,7 y 2,0). A continuación, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
ADN de cada muestra para llevar a cabo PCR con el Fisher exACTGene completo kit de PCR (Fisher Scientific: Fair Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.) y un gradiente termociclador Mastercycler (Eppendorf: Hamburgo, Alemania) usando los siguientes cebadores para HPV16 [12, 78], HPV18 [12, 78, 79], y glyceraldehyde- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) [80] (SeqWright: Houston, Texas, EE.UU.):.
HPV16 cebador directo, ATGTTTCAGGACCCACAGGA;
HPV16 cebador inverso, CCTCACGTCGCAGTAACTGT
HPV18 cebador directo, ATGGCGCGCTTTGAGGATCC;
HPV18 imprimación, GCATGCGGTATACTGTCTCT inversa;
GAPDH cebador directo, ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH cebador inverso, ACCACTGACACGTTGGCAGT; se utilizó
Uno g de ADN plantilla para cada reacción. El primer paso de desnaturalización corrió durante tres minutos a 94 ° C. se realizaron un total de 30 ciclos de amplificación, que consta de 30 segundos de desnaturalización a 94 ° C, 60 segundos de hibridación a 58 ° C, y 30 segundos de extensión a 72 ° C. La extensión final se realizó durante cinco minutos a 72 ° C. Los productos de reacción de PCR se separaron por electroforesis en gel usando Reliant 4% NuSieve® 3: 1 geles de agarosa Plus (Lonza: Rockland, Maine, EE.UU.). Las bandas se visualizaron por iluminación UV de bromuro de etidio-geles teñidos y capturaron utilizando un sistema de imagen 100 y 1D Image Analysis Software Kodak Gel Lógica (Eastman Kodak: Rochester, Nueva York, EE.UU.)
PCR cuantitativa (qPCR) muestras de ADN fueron luego procesados mediante qPCR para proporcionar una cuantificación más específico y sensible. Los cebadores y sondas fueron diseñados utilizando software de biblioteca Roche sonda universal (UPL) diseño de ensayo para amplificar la región de superposición E6 y E7 secuencia del gen de HPV16 (GenBank adhesión no. K02718) y la limpieza de genes β-actina humana (GenBank adhesión no. M10277) . Estos cebadores fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE.UU.) y las sondas de Roche Applied Science (Indianapolis, Indiana, EE.UU.).
HPV16 E6 /E7 cebador directo 5'-CAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA-3 ', HPV16 E6 /E7 cebador inverso 5'-CCAGCTGGACCATCTATTTCA-3 ', HPV16 E6 /E7 hidrólisis "Taqman" sonda 5' - se utilizó (FAM) -AGGAGGAG- (oscuro tinte desactivador) -3 '(UPL sonda # 63) para amplificar el 73 par de bases (pb) región entre la posición 535 nucelotide (nt) y 607 nt posición. HPV18 E7 cebador directo 5'-GACTCAGAGGAAGGAAAACGATGAAA, HPV18 E7 cebador inverso 5'-GTGACGTTGTGGTTCGGCT; HPV18 E7 sonda 5'-TGGAGTTAATCATCAACATTTACCA se utilizó para amplificar la región de 25 pb entre la posición 715 y 739 nt. β-actina humana cebador directo 5'-3-GTGGGGTCCTGTGGTGTG sonda 5 ', β-actina humana 5'-GAAGGGGACAGGCAGTGA-3', "Taqman" humana hidrólisis β-actina '- (FAM) -GGGAGCTG- (oscuro tinte desactivador) - 3 '(UPL sonda # 24) amplificó la región de 61 pb entre 2642 posición nt y 2702 nt posición.
el tiempo real mezcla de reacción se preparó en un LightCycler® 480 placa de múltiples pocillos 96 que contiene 1x LightCycler® 480 Sondas Master (Roche Ciencias Aplicadas: Indianapolis, Indiana, EE.UU.), 1 M de cada conjunto de cebadores respectiva (adelante y atrás), 0,2 M de la sonda respectiva, y 2 l de molde de ADN; en un volumen de reacción final 20 l. La mezcla de sondas maestro contenida tampón de reacción, mezcla de dNTP (incluyendo dUTP en lugar de dTTP), MgCl 3,2 mM 2, y Taq ADN polimerasa
. El ensayo de PCR en tiempo real se realizó en un sistema LightCycler 480 (Roche Ciencias Aplicadas: Indianapolis, Indiana, EE.UU.) con los siguientes parámetros de ciclo: pre-incubación de la activación de la enzima inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos (velocidad de rampa 4,4 ° C /segundo), 60 ° C durante 30 segundos (velocidad de rampa de 2,2 ° C /segundo) y 72 ° C durante 1 segundo (velocidad de rampa 4,4 ° C /segundo). Después de la fase de amplificación, una etapa de enfriamiento se realizó a 40 ° C durante 30 segundos (velocidad de rampa de 2,2 ° C /segundo). Adquisición de la señal de fluorescencia se realizó mediante el establecimiento (465 a 510 nm) después de la 72 ° C fase de extensión de cada ciclo de Mono La hidrólisis de la sonda. Todas las muestras se llevaron a cabo por triplicado Francia El CaSki (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EE.UU.). Línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino fue utilizado para desarrollar las curvas de calibración tanto para el HPV16 (600 copias /genoma) y GAPDH (2 copias /genoma) genes. La GH354 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EE.UU.) línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino fue utilizado para desarrollar las curvas de calibración para HPV18 (200 copias /genoma). ADN extraído de células CaSki y GH354 se diluyeron en serie de diez veces a partir de 50 ng a 0,0005 ng [81] La cuantificación se consigue utilizando ciclo umbral (C T) medida con la segunda derivada máxima método (LightCycler 480 Software versión 1.5.0.39; Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, EE.UU.). Las muestras de saliva & gt; 0.001 copias /genoma del VPH fueron considerados positivos. análisis de la especificidad se realizó en qPCR ensayo contra el VPH 18 y se encontró que el 100% específico (datos no mostrados)
Evaluación estadística
sensibilidad y la especificidad se calcula como la proporción de verdaderos positivos y verdaderos negativos (valor de corte & gt;. 0.001 copias /genoma), respectivamente. Tras la adquisición de muestras de saliva y los resultados de detección de VPH, la información demográfica de las muestras se compararon con el perfil demográfico general de la población local mediante una prueba de chi-cuadrado (χ2), para determinar si alguna característica (género, raza, edad) se diferente de lo esperado entre los sujetos evaluados en este estudio (n = 118). Un nivel de probabilidad de alfa (α) = 0,05 se utilizó para determinar la significación estadística
abreviaciones
VPH:.
Virus del papiloma humano
ADN:
El ácido desoxirribonucleico
EEUU:
Estados Unidos
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
OPRS:
Oficina para la Protección de Sujetos Humanos de Investigación
CCSD:
del Condado de Clark Nevada - Distrito Escolar
< DFN> UNLV-SDM:
Universidad de Nevada Las Vegas - Escuela de Medicina Dental
RCF:
fuerza centrífuga relativa
PBS:
Tampón fosfato salino
GAPDH:
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
qPCR:
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
pb:
pares de bases
nt:
de nucleótidos
dNTP:
desoxirribonucleótidos trifosfato
dUTP: página 2-desoxiuridina trifosfato
dTTP:
desoxitimidina trifosfato .
Declaraciones
Agradecimientos
los autores desean agradecer a la Facultad de Ciencias de la Universidad de las Vegas Salud de la Comunidad y Departamento de Ciencias Biomédicas de la UNLV-SDM, Oficina de Investigación y Programa de Educación avanzada en Pediatric odontología para proporcionar los insumos y reactivos para este estudio piloto inicial.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original de la figura 1 12903_2012_246_MOESM2_ESM.pdf autores 12903_2012_246_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original de la figura 2 Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
autores
KK y CF concibieron, monitoreados, y coordinó el diseño experimental. KH, EE, JA y AH fueron responsables de la contratación de los sujetos, consentimiento informado, la toma de muestras, y algunos análisis biomédico. CF, EE, JA, y AH llevó a cabo la extracción de ADN, análisis de PCR y qPCR. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
