Resumen Antecedentes
comunidades microbianas que habitan en la boca humana están asociados con la salud oral y la enfermedad. Estudios anteriores han indicado que la prevalencia general de la gingivitis adultos en China sea alta. El objetivo de este estudio fue caracterizar en profundidad la microbiota oral de los adultos chinos con o sin la gingivitis, mediante la definición de la diversidad filogenética y estructura de la comunidad mediante pirosecuenciación en paralelo altamente microbiana.
Métodos Seis
no fumadores chinos, tres y tres con y sin la gingivitis (rango de edad 21-39 años, 4 mujeres y 2 hombres) fueron incluidos en el estudio transversal presente. gingivales parámetros de inflamación y sangrado al sondaje se caracterizaron por un médico mediante el índice gingival Mazza (MGI). La placa (muestras por separado en cuatro sitios diferentes orales) y se obtuvieron muestras de saliva de cada sujeto. Las secuencias y la abundancia relativa de las bacterias 16 S rDNA PCR amplificados se determinaron mediante pirosecuenciación que produjo 400 lecturas pb de longitud. Los datos de secuencia se analizaron por medio de un cálculo de tuberías a medida para análisis microbioma oral humana. Por otra parte, las abundancias relativas de los grupos microbianos seleccionados fueron validados mediante PCR cuantitativa.
Resultados Empresas El microbioma orales de gingivitis y saludables sujetos podían distinguirse en base a las distintas estructuras de la comunidad de microbioma de placa, pero no el microbioma salivales. Las contribuciones de los miembros de la comunidad a la estructura de la comunidad divergencia se accedió estadísticamente en el filum, género y los niveles de especies similares. Ocho taxones predominante se encuentra asociado con la gingivitis: TM7, Leptotrichia
, Selenomonas
, Streptococcus
, veillonellas
, Prevotella
, Lautropia
, y Haemophilus
. Además, 98 especies de nivel OTU, se identificaron como la gingivitis asociada, que proporciona características microbianas de la gingivitis con una resolución especies. Por último, para los dos géneros Streptococcus seleccionado Opiniones y Fusobacterium
, PCR en tiempo real basado en la cuantificación de la abundancia relativa de bacterias validó los resultados basados en la pirosecuenciación.
Conclusiones
Este estudio sugiere que los métodos de muestras orales de esta población de pacientes de la gingivitis se puede caracterizar por medio de microbioma placa por pirosecuenciación los 16 genes S rDNA. Otros estudios que caracterizan muestras seriadas de los sujetos (diseño estudio longitudinal) con un tamaño de población de mayor tamaño pueden dar una idea de las características temporales y ecológicos de las comunidades microbianas orales en estados definidos clínicamente de la gingivitis.
Palabras clave
microbiota oral, gingivitis saliva pirosecuenciación placa electrónica material complementario
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-11-33) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Shi Huang, fang Yang. contribuyeron igualmente a este trabajo.
Antecedentes
técnicas Metagenomic recientemente han revolucionado nuestra comprensión de la gran cantidad de microbios que co-habitan en el cuerpo humano, conocidos colectivamente como el microbioma humano. Varios sitios del cuerpo (por ejemplo, la piel, los tractos gastrointestinal y vaginal y la cavidad oral) albergan comunidades distintas de microbios que varían entre los individuos de acogida, así como entre los nichos ecológicos dentro de cada parte del cuerpo [1]. Las interacciones entre la microbiota residente y entre la microbiota y el huésped humano subyacen a la salud humana y la enfermedad. Dentro de la cavidad bucal, la lengua, el paladar blando y duro, la mucosa bucal, superficies supragingival y subgingival de los dientes y la saliva puede representar diferentes nichos ecológicos o hábitats [2]. La composición y la diversidad de la microbiota en estos hábitats pueden contribuir a la salud oral [3-6] y las enfermedades bucales como la caries dental, la periodontitis y gingivitis [7, 8].
La gingivitis es una inflamación de los tejidos blandos de la encía que rodea a los dientes. Se cree que el resultado de la acumulación de placa [9] y las interacciones subsiguientes entre la microbiota placa y los tejidos del huésped [10, 11]. Estos tejidos se vuelven eritematosa y sangran al sondaje, pero sin migración apical del epitelio de unión se produce. Los estudios previos de placa gingival mostraron que a medida que se desarrolla la gingivitis, los constituyentes microbianos de cambio de placa subgingival de una población dominada por estreptococos Gram-positivo a uno con los niveles elevados de anaerobios Gram-negativas tales como Actinobacillus
, Capnocytophaga, Campylobacter, Eikenella, Fusobactrium Opiniones y Prevotella
[2, 12, 13]. Sin embargo, estos estudios se han basado en los métodos de cultivo y moleculares que se dirigen a un número limitado y parcial de microbios cultivables, un sesgo que puede ser superado por los enfoques de metagenómica. Durante la última década, los enfoques de secuenciación de alto rendimiento basado en 16 amplicones S rDNA se han utilizado para estudiar la diversidad de la microbiota oral humana en la salud y la enfermedad. En particular, estas técnicas revelan la diversidad microbiana dentro de la grieta gingival sana excede mucho más allá que se caracterizó previamente. Kroes et al.
Observó que menos de un cuarto (24%) de filotipos identificados con técnicas metagenomic podría ser recuperado por el cultivo y que casi la mitad de los filotipos subgingivales identificados con una combinación de técnicas moleculares y basada en el cultivo de no haber sido caracterizado previamente [14]. De hecho, otro estudio estima que en la cavidad oral humana aproximadamente el 68% de todos los taxones bacteriana aún estaban sin cultivar [6].
Aunque las técnicas moleculares se han utilizado para comparar las placas subgingivales en huéspedes sanos y aquellos con enfermedades bucales como la periodontitis [ ,,,0],15], pocos estudios han investigado en profundidad la microbiota bucal asociada con la gingivitis. Hay varias razones. En primer lugar
, la profundidad y amplitud de muestreo para la microbiota oral, han sido insuficientes en general, y los parámetros óptimos no determinado por el de los pacientes, en particular, la gingivitis. En segundo lugar
, con respecto a la selección de los sitios gingivales para el muestreo de la placa, que todavía no estaba claro si es o cuáles de los diferentes sitios son clínicamente relevantes (por ejemplo, los dientes anteriores o posteriores? Dientes de la placa supragingival o placa subgingival?). Esta ambigüedad limita seriamente el análisis de datos significativos y las comparaciones entre los estudios, y retrasa la traducción de los hallazgos clínicamente. De terceros, la mayoría de las encuestas microbiana oral que enumeran 16 secuencias de S-PCR amplicones de PCR han ignorado los artefactos potenciales [16-19]; como resultado, un paisaje completo y preciso del organismo de la mayoría de microbiomas orales, particularmente los relacionados con enfermedades, permaneció en gran parte difícil de alcanzar. Todos estos factores han confundido la evaluación de los factores microbianos asociados con la gingivitis.
El empleo de pirosecuenciación de 16 amplicones S rDNA, este artículo dilucidado la estructura y la diversidad de la población de la microbiota oral, la muestra, respectivamente, de cinco nichos ecológicos orales de cada uno de los tres adultos chinos con gingivitis y tres sin la enfermedad. Microbiota de la placa supragingival, placa subgingival, y la saliva se caracterizaron para comprobar si y cómo el microbioma de los diversos nichos ecológicos orales distinguidos huéspedes sanos y aquellos con la gingivitis. Nuestro estudio define una serie de organismos como posibles marcadores biológicos de la gingivitis, y proporcionado información importante para las estrategias de muestreo y análisis para desentrañar los factores de riesgo asociados a la gingivitis microbianas en las poblaciones humanas.
Resultados
Diseño del estudio
Los seis sujetos eran adultos sanos, no fumadores en la edad que van desde 21 a 39 años (Tabla 1). asignación de grupo se basa en la frecuencia de sangrado al sondaje (BOP). Tres sujetos fueron asignados al grupo sano (H) sobre la base de una frecuencia BOP ≤5 y tres sujetos al grupo poco saludable (gingivitis) (U) sobre la base de una frecuencia de BOP ≥ 20. Grupo H consistió de tres mujeres y Grupo U incluido dos hombres y una mujer. índices de sangrado de los sujetos individuales se muestran en la Tabla 1 1.Table Metadatos para los seis sujetos muestreados en este estudio.
Grupo
saludable (H) guía empresas no saludable (T)
Asunto ID
1
2
3
4
5
6
Gender
F
F
F
F
M
M
Age
22
23
21
39
25
25
Smoking
N
N
N
N
N
N
Chronic disease
N
N
N
N
N
N
BOP
5
1
1
24
37
25
MGI
1.1250
1.0357
1.0179
2.1346
2.6071
1.9286
Abreviaturas: BOP - El sangrado al sondaje; MGI - Mazza gingivales conjuntos de datos de secuencia Índices
cinco muestras (cada uno de un sitio diferente orales; ver Métodos) fueron recogidos y analizados de cada individuo. Con código de barras 16-S rDNA secuenciación de amplificación utilizando 454 titanio (longitud media de lectura de 400 pb) dió un total de 494.988 en bruto lee, lo que resulta en un conjunto de datos de 258.385 lee (después de estrictas medidas de evaluación y control de calidad; Métodos). El número de lecturas por muestra varió de 4.405 a cerca de 13.562, con un promedio de 8,612 (Tabla 2) .table 2 Estimaciones de la diversidad de especies para las muestras.
Host ID
muestra específica de sitio
ID de la muestra
de bajo nivel lee
Las lecturas analizadas
secuencia único
de una buena cobertura
UOT a 3% de diferencia
Ace
Chao 1
1
S
H1
18805
11580
3120
98.13%
687
902.15
944.54
A-sup
H2
18448
9764
2307
98.56%
464
603.62
634.17
|
A-sub
H3
15895
8035
2748
97.98%
597
740.87
775.64
|
P-sup
H4
13974
7467
2142
96.69%
684
966.39
925.12
|
P-sub
H5
14224
7730
2528
97.12%
702
932.10
923.01
2
S
H6
20982
11907
3264
98.35%
685
877.19
884.03
|
A-sup
H7
19416
10935
2415
98.99%
379
491.50
490.02
|
A-sub
H8
17295
9539
2060
98.66%
390
533.27
523.25
|
P-sup
H9
22178
10085
2653
97.98%
631
846.61
842.29
|
P-sub
H10
23105
10809
3160
98.06%
736
928.09
937.33
3
S
H11
19146
10970
3229
98.11%
612
847.56
878.51
|
A-sup
H12
12515
5476
1933
97.11%
515
672.34
680.37
|
A-sub
H13
13289
6581
1829
97.80%
466
608.60
631.71
|
P-sup
H14
13105
6615
1896
97.57%
494
657.40
661.27
|
P-sub
H15
12673
6456
1943
97.23%
539
728.34
757.23
4
S
U1
24258
13562
3929
98.50%
671
880.91
876.01
|
A-sup
U2
18719
9591
2190
98.20%
495
700.72
713.79
|
A-sub
U3
16282
7651
2636
97.56%
638
819.36
805.22
|
P-sup
U4
20539
10035
3045
98.33%
617
766.07
749.34
|
P-sub
U5
11515
5272
1963
96.47%
597
776.19
772.56
5
S
U6
20527
12890
3150
98.02%
722
1012.09
1001.18
|
A-sup
U7
14307
7813
2436
97.82%
589
746.85
748.61
|
A-sub
U8
14763
8078
2793
97.83%
621
785.67
781.26
|
P-sup
U9
14787
7268
2213
97.14%
589
818.53
828.20
|
P-sub
U10
16246
8916
2902
97.73%
656
858.40
934.10
6
S
U11
15739
8819
2569
97.74%
606
806.46
824.90
|
A-sup
U12
12849
5407
2013
96.10%
570
819.64
810.82
|
A-sub
U13
17990
8484
2844
97.15%
737
996.50
984.13
|
P-sup
U14
9112
4405
1330
95.87%
475
678.74
671.08
|
P-sub
U15
12305
6249
2189
96.13%
698
959.80
960.71
La riqueza y la diversidad de análisis basado en unidades taxonómicas operacionales
Clustering las secuencias únicas en unidades taxonómicas operacionales (Otus) a una distancia genética 3% resultaron en 464 ~ 737 diferentes especies filotipos "nivel" por microbioma (Tabla 2). Por todas las comunidades microbianas orales analizados, el número de OTU detectado era muy cercano al número total de OTU estimado por Chao1 de la ECA y los indicadores de riqueza. El nivel medio de cobertura de buena era más del 97% en todas las muestras, lo que indica que cerca de tres nuevos filotipos se esperaría que por cada 100 secuenciado adicional lee. Este nivel de cobertura sugirió que las 16 secuencias de ADNr S identificadas representan la mayoría de los miembros de bacterias presentes en muestras de saliva y placa en el estudio actual. Las curvas de rarefacción individuales mostraron un patrón similar de aumento de la diversidad que aún no ha alcanzado la saturación (Figura 1). Las comparaciones de las curvas de rarefacción en los sanos (H) y las poblaciones gingivitis (U) para los sitios incluidos en la muestra de saliva y la placa mostraron que los dos host-grupos muestran riqueza similar de UOT bacteriana a nivel de identidad 97%. Figura 1 Curvas de rarefacción de los grupos H y U en los sitios incluidos en la muestra de saliva y placa. Para ambos microbioma de la saliva de placa, H y U grupos mostraron la diversidad filogenética similar a nivel de identidad del 97% (basado en un máximo de 4.000 secuencias por muestra).
Las comparaciones de las estructuras de la comunidad
Para determinar si la microbiota de la saliva y placa distinguidos huéspedes sanos y aquellos con la gingivitis, se aplicaron análisis multivariados para comparar la estructura general de la microbiota de cada nicho ecológico oral basada en FastUnifrac derivados y matrices de distancia basados en thetaYC. FastUniFrac [20] permite comparaciones por pares de las distancias evolutivas entre las dos comunidades microbianas y las medidas de similitudes entre las estructuras de la comunidad microbiana. En el análisis PCoA, bajo un esquema de UniFrac ponderada, se observó la segregación entre los grupos H y U (p Hotel & lt; 0,001) en todas las muestras o cuando sólo se consideraron las muestras de placa, pero no sólo cuando las muestras de saliva fueron considerados (Figura 2A ). Por otra parte, independientemente de su afiliación acogida de grupos, la microbiota saliva formó una agrupación distinta de la microbiota de la placa (p = 0,034
) (Figura 2 B, C). El análisis basado en PCoA thetaYC mostró resultados consistentes (Figura 3A, B). Cuando sólo se consideraron las muestras de placa, la separación estructural entre los grupos de "U", "H" y fue más exigentes (p = 0,001
) (Figura 3C) que cuando todas las muestras fueron incluidos (p = 0,005
) (Figura 3A). Por lo tanto, gingivitis- y-gingival-microbioma saludables se pueden distinguir en función de las distintas estructuras de la comunidad de microbioma de placa, pero no el microbioma salivales. Figura 2 Las comparaciones de las estructuras de la comunidad bacteriana, medida por FastUniFrac. estructuras de la comunidad a partir de H y grupos U (A) o de diferentes localizaciones (B) fueron interrogados utilizando el análisis (PCoA) y el análisis de la agregación de la matriz de distancia UniFrac ponderada de coordenadas principales. Cada punto corresponde a una comunidad microbiana, con el color que indica su categoría. Los porcentajes de variación explicada por las coordenadas principales trazados fueron indicados en los ejes.
Figura 3 basado en el análisis de las estructuras comunitarias ThetaYC bacterianas. estructuras de la comunidad a partir de H y grupos U (A) o de diferentes localizaciones (B) fueron interrogados utilizando el análisis (PCoA) de la matriz de distancia thetaYC coordinar director. Cada punto corresponde a una comunidad microbiana, con el color que indica su categoría. Los porcentajes de variación explicada por las coordenadas principales trazados fueron indicados en los ejes.
Caracterización basada en la taxonomía de la microbiota bucal
fueron identificados y cuantificados mediante la asignación taxonómica con bases de datos de referencia utilizando MOTHUR phyla bacteriana y géneros, que revelan su abundancia relativa en toda la placa y microbiota saliva (Figura 4; se muestra sólo phyla). Se encontró que todas las secuencias distribuidos en 11 filos de bacterias que incluyen seis filos predominante se encuentra comúnmente en la cavidad oral: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacterias y TM7 [6, 21]. La abundancia relativa de todos los filos de placa detectada en cada uno de los dos grupos de hosts sugirió que no se encontraron diferencias significativas para la mayoría de los filos entre hosts con o sin la gingivitis, a excepción de Firmicutes, Proteobacteria y espiroquetas (Figura 5). Entre los phyla gingivitis asociada, Actinobacteria y Bacteroidetes eran gingivitis-agotado mientras que los cinco restantes eran phyla gingivitis enriquecida (Figura 5). Figura 4 predominante filotipos en cada muestra. Más del 90% de la diversidad en cada muestra fue aportado por los seis filos. Sin embargo, se encontraron variaciones en su abundancia relativa. Véanse los métodos para las abreviaturas.
Figura 5 Las comparaciones de perfiles taxonómicos bacterianos de los grupos H y U a nivel phylum basado en la base de datos por vía oral "núcleo". La abundancia relativa de cada taxón entre los grupos H y U se compararon mediante Metastats (*: 0,01 & lt; p & lt; 0,05
; **: p & lt; 0,01
, con una media ± SEM) Un
. total de 70 géneros fueron identificados en la microbiota bucal de los cinco sitios muestreados (archivo adicional 1). El más frecuentemente detectado taxones a nivel de género (los 12 géneros más abundantes que representa cada uno de al menos el 2% del microbioma oral) fueron Streptococcus, Neisseria
, Leptotrichia, Actinomyces, Prevotella
, veillonellas, Rothia, Fusobacterium
, Lautropia
, Selenomonas, Haemophilus, Granulicatella
.
estadísticamente, se encontraron 26 géneros diferencialmente distribuidos entre las placas gingivitis (Grupo U) y placas de goma-sana (Grupo H) (Tabla 3). Cinco géneros (Streptococcus, Veillonella, Prevotella
, Lautropia
y Haemophilus
) fueron significativamente más abundantes en las encías sanos-microbiota placa que los de la placa gingivitis, mientras que se encontraron los 21 géneros restantes para ser estadísticamente menos abundantes .table 3 géneros bacterianos distribuyen diferencialmente entre los grupos H y U con base en la base de datos por vía oral "núcleo".
Genera
H
T
Metastats valor p
Metastats valor q
|
abundancia media (%)
std.err
abundancia media (%) guía empresas std.err
|
|
Streptococcus
22.47% 1.91%
14.32% 1.98%
0,010989 0,0043
veillonellas
8.62% 1.90%
2,33% 0,77%
0.002997
0,0016
Prevotella
6,07% 1,75%
1,27% 0,44%
0.004995
0,0023
Lautropia
5.67% 2.00%
1.33% 0.31
%
0.013986
0,0051
Haemophilus
4.15% 1.39%
0,58%
0,21%
0,000999 0,0008
Leptotrichia
4.12%
0.91%
12.48%
2.44%
0.002997
0.001644
Selenomonas
1.73%
0.36%
6.71%
1.70%
0.002997
0.001644
Uncultured_Lachnospiraceae*
1.00%
0.27%
1.97%
0.25%
0.015984
0.0056366
Eubacterium
0.34%
0.08%
1.89%
0.34%
0.000999
0.000822
Cardiobacterium
0.60%
0.17%
1.19%
0.22%
0.038961
0.011658
Peptostreptococcus
0.19%
0.10%
1.42%
0.46%
0.002997
0.001644
Tannerella
0.20%
0.05%
1.36%
0.49%
0.000999
0.000822
Catonella
0.36%
0.10%
1.06%
0.25%
0.006993
0.003139
Synergistes
0.07%
0.03%
1.22%
0.49%
0.001998
0.001409
Filifactor
0.05%
0.04%
0.96%
0.28%
0.000999
0.000822
Peptococcus
0.12%
0.04%
0.49%
0.11%
0.004995
0.002349
Solobacterium
0.11%
0.03%
0.46%
0.22%
0.048951
0.01381
SR1
0.11%
0.04%
0.42%
0.08%
0.000999
0.000822
Syntrophomonas
0.00%
0.00%
0.17%
0.07%
0.000999
0.000822
Johnsonella
0.01%
0.01%
0.14%
0.05%
0.000999
0.000822
Choroflexus
0.01%
0.01%
0.12%
0.07%
0.030969
0.010172
Olsenella
0.01%
0.00%
0.05%
0.02%
0.041958
0.012185
Propionivibrio
0.00%
0.00%
0.05%
0.02%
0.032967
0.010172
Peptoniphilus
0.00%
0.00%
0.04%
0.02%
0.000999
0.000822
Desulfomicrobium
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
Pseudoramibacter
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
A nivel de género, se identificaron 26 taxones gingivitis asociada a la microbiota en la placa, que incluye cinco taxones gingivitis-empobrecido (negrita) y 21 taxones gingivitis enriquecida (sin negrita); *, No un género bien definido.
OTU de nivel de comparaciones de microbiota oral de
Como las comparaciones anteriores de la abundancia relativa de los taxones microbiana se deriva de sólo los lee con valor de confianza por encima de 0,8 (Métodos), esencialmente todo los lee sin ninguna asignación filogenéticos fiables (0,33 ~ 27,86% del total lee en cada muestra) se habían enmascarado. Por lo tanto, se compararon además, entre los dos receptores-grupos, la abundancia relativa de todas las especies a nivel de UOT en microbiota placa, independientemente de sus asignaciones de identidad filogenéticos. En total, 98 Otus (representó el 5,38% del total de UOT) se encontraron distribuidos diferencialmente en la importancia de corte de 0,05 (ambos p-valor y
q
-valor de Metastats) no sólo en cada uno de los cuatro placas sitios, pero en todos los sitios de la placa. Curiosamente, entre los 98 Otus, 36 de ellos eran la gingivitis-agotado y que las 62 restantes fueron enriquecidos con la gingivitis (archivo adicional 2). taxonomía consenso de la OTU fue interrogado por MOTHUR basado en "núcleo" 16 S rDNA gen de base de datos por vía oral (Métodos). Veinticuatro de los 36 gingivitis-Otus agotan mientras que el 57 fuera de la UOT enriquecido con la gingivitis 62 fueron apoyados por los resultados basados en la taxonomía-asignación. Por lo tanto los resultados de las dos metodologías son en gran medida constante. Estos gingivitis-agotado o la gingivitis enriquecida UOT representar un nuevo conjunto de potenciales marcadores orgánico para la evaluación y pronóstico de la gingivitis, aunque su validez y significación aún no se han probado aún más en las poblaciones humanas más grandes.
Correlación de cuantificaciones microbianas entre pirosecuenciación y cuantitativa PCR (qPCR) Francia el abundancias, en copias de genes por ng de DNA, de dos géneros (Streptococcus
y Fusobacterium
) en todas las muestras de placa y saliva se determinaron con qPCR. La abundancia relativa de estos dos géneros según lo determinado por pirosecuenciación mostró una correlación positiva a las copias de genes basados en qPCR por ng de ADN (Streptococcus
: r
= 0,554; p
& lt; 0,002; Fusobacterium
:. r = 0,813
; p Hotel & lt; 0,001) (archivo adicional 3)
Discusión
Este estudio empleó pirosecuenciación altamente en paralelo de 16 S rDNA para evaluar y comparar la estructura y la diversidad de la población microbiota asociada con la gingivitis en los adultos chinos. La diversidad microbiana en placa y saliva estimado en nuestro estudio, 464 ~ 737 UOT (97% de identidad de corte) en cada muestra, fue similar a la reportada por Zaura et al (saliva; [5]). El estudio Zaura empleó una estrategia de poda de lectura rigurosa y conservadora, donde sólo las lecturas presentes al menos cinco veces en una muestra se tuvieron en análisis. En nuestro análisis, basado en la calidad estrictos lectura recorte sugerido por MOTHUR se llevó a cabo, lo que requiere puntuación media de calidad de más de 35 años en una ventana móvil de 50 pb a lo largo de toda la lectura (Métodos). Este criterio de selección conservadora http:.. //Www mothur org /wiki /reduce significativamente el número de UOT de las estimaciones basadas en criterios alternativos de poda de lectura como la exigencia de promedio el nivel de calidad de base & gt; 25 (datos no presentados). Por lo tanto posibles artefactos de secuenciación pueden inflar la diversidad bacteriana observada. Por otra parte, la cobertura de la Buena estimado mostró que la mayoría de los filotipos bacterianas (& gt; 97%) en la saliva y la placa de estas personas sanas y gingivitis ya fueron identificados en este estudio. El estimador de riqueza de la ECA y Chao1 también sugirió que la mayoría de filotipos (& gt; 97%) ya estaban representadas por las secuencias en nuestro estudio
Nuestro estudio tuvo como objetivo evaluar en primer lugar si las comunidades de las poblaciones de acogida sanos y gingivitis asociada difieren. en cualquier sitio específico (s) de la cavidad oral. Tanto el análisis basado en FastUnifrac y basados en thetaYC mostró que las muestras de saliva y la placa representados microbiomas distintas en la cavidad oral. Independientemente del estado de la enfermedad, microbiota salival agrupado claramente de microbiota de placa, en cada una de las dos matrices de distancia probados. Esto probablemente refleja las diferentes condiciones ambientales que caracterizan a los dos hábitats. microbiota de placa residen en biopelículas sobre la superficie del esmalte de los dientes y se ven afectados por la composición de la dieta, las prácticas de higiene oral [22], las interacciones microbianas dentro del biofilm [8] y las interacciones entre microbios y células huésped epiteliales [10, 11, 23]. En contraste, el hábitat salival fue formada por flujo ingesta de alimentos, microbiota transitoria, mucinas, exudado seroso, desprendido células epiteliales, etc [3, 4, 24, 25]. Curiosamente, un estudio de la diversidad global del microbioma salivar humana en diez individuos de cada una de las doce ubicaciones geográficas en todo el mundo (incluyendo China) informó de una alta diversidad dentro y entre individuos de acogida, pero poca estructura geográfica en el microbioma de la saliva [26].
En segundo lugar, se identificaron los miembros de las comunidades bacterianas. Además, se evaluaron sus contribuciones a la segregación estructural de la microbiota placa entre las dos poblaciones de acogida. Cuando la microbiota de placa fueron considerados a nivel de phylum, Fusobacterias y TM7, dos de los filos predominante, fueron más abundantes en la microbiota asociada con la gingivitis, mientras Actinobacteria y Bacteroidetes fueron menos abundantes en microbioma gingivitis asociada. A nivel de género, varios géneros tales como Leptotrichia Opiniones y Selenomonas
fueron más abundantes en la placa gingivitis (21 tales géneros en total, Tabla 3), mientras que sólo cinco géneros, Streptococcus
, veillonellas
, Prevotella
, Lautropia
y Haemophilus
, eran menos abundantes. A nivel de especies, la filogenia-asignación comparación independiente de la abundancia relativa de UOT entre los anfitriones sanos y la gingivitis se realizó para no sólo cada uno de los cuatro sitios de placa, sino también todos los sitios de placa. En consonancia con las conclusiones anteriores, asociada a la gingivitis 98 (gingivitis-enriquecido y empobrecido en la gingivitis) UOT fueron localizados y se encontró distribuida en todos los sitios muestreados de la placa. Por otra parte, 58 Otus afiliados a los géneros de Leptotrichia gratis (16), Selenomonas gratis (12), Streptococcus gratis (7), veillonellas gratis (6), Prevotella gratis (6), Lautropia gratis (2), Haemophilus gratis (3) y la división TM7 candidato se encontraron (6) que se asocia con la gingivitis.
en particular, se conocen varios miembros de estos taxones gingivitis asociada a desempeñar un papel en la tanto para la salud oral y la enfermedad. La gingivitis enriquecida género Leptotrichia
, del phylum Fusobacterias y familiares Fusobacteriaceae, fueron Gram-negativos no sporing formador, anaeróbica, varillas sacarolíticas. Estaban entre la microbiota normal, en la cavidad bucal sana [27] y el intestino [28]. Leptotrichia buccalis
se encontró en alta prevalencia en un estudio de la grieta gingival de pacientes chinos con la gingivitis y la gingivitis ulcerosa necrosante [29]. En un modelo de gingivitis inducida experimentalmente, los niños albergaron de tres veces mayores proporciones de Leptotrichia
especies y 2,3 veces mayores proporciones de Selenomonas
especies en la placa subgingival que los adultos tratados de la misma manera [30]. Del mismo modo, Selenomonas
especies son anaerobios Gram negativos que normalmente se encuentran en la flora bucal y asociados con la gingivitis [31, 32] y periodontitis [33, 34]. TM7 es un filo de bacterias prominente de más de 200 representantes filotipos sin cultivadas [35-37] y que se encuentran en diversos hábitats ambientales (tales como el suelo, el agua dulce, en alta mar y las fuentes hidrotermales). Los miembros de la división candidato TM7 se han detectado recientemente en varios sitios del cuerpo humano [6, 38-40], y se asocia con la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias (periodontitis [41], la vaginosis [42] y las enfermedades inflamatorias del intestino [43]) . El I025 subgrupo se encontró en la placa subgingival principalmente en los sitios enfermos en los ejércitos periodontitis, lo que sugiere su posible papel en el proceso multifactorial que conduce a la periodontitis [41, 44].
Por otro lado, sólo se detectaron cinco géneros gingivitis-empobrecido en el estudio actual. Streptococcus
es uno de los géneros más predominante en la cavidad oral humana. Sin embargo, el "estreptococos orales" son un grupo muy heterogéneo genéticamente [45]. Aunque la mayoría son patógenos oportunistas y se han relacionado con una variedad de enfermedades orales [46-48], que también se consideran comensales. Similar a nuestros resultados, Streptococcus sanguinis
, así como Lautropia mirabilis y Haemophilus parainfluenza
, fueron recientemente asociado con la salud oral [34, 47]. El género veillonellas
representa un grupo de pequeños por lo general no fermentadores, el estricto anaeróbico, cocos Gram-negativas. Se encuentran en la cavidad humana oral, el tracto respiratorio superior, el intestino delgado y la vagina. En una encuesta de la placa subgingival de 22 sujetos, la mayoría de la subgingival veillonellas
aislamientos fueron identificados como Veillonella parvula
[49]. Prevotella
especies son parte de la microbiota oral humana normal y con frecuencia están aisladas de infecciones orales tales como periodontitis, caries dental y abscesos [15, 50, 51]. miembros de Prevotella
estaban asociadas con enfermedades orales negro-pigmentación. Consistentemente, en este estudio, la mayoría Prevotella
UOT detectado en personas sanas pertenecían a las especies excepto Prevotella tannerae
no pigmentación. Una vez validado en estudios más grandes, estos géneros gingivitis asociada, incluyendo tanto las gingivitis-enriquecido y empobrecido, puede representar biomarcadores valiosos para la gingivitis. Pyrosequencing técnicas
, como la empleada en este estudio, reveló gran diversidad filogenética y la variabilidad de comunidades bacterianas en el ecosistema oral humana [20, 52]. Caracterización y cuantificación de los componentes de la comunidad permitido distinciones en la estructura de la comunidad entre los estados sanos y enfermos que deben explorarse para biomarcadores de la enfermedad y el tratamiento específico de microbios-dirigida. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio del organismo de la microbiota asociada a la gingivitis mediante técnicas de secuenciación profunda. Nuestros resultados preliminares formular la base para otros estudios que cuentan con un diseño longitudinal, e incluyen un mayor número de sujetos. mejoras técnicas en curso sobre la amplificación filogenético-marcador (como las que apuntan sesgo de extracción de ADN, la secuencia de quimerismo causados por PCR, el sesgo de amplificación por PCR, la secuencia de errores, la amplificación desigual de los miembros de la comunidad y las variaciones normalmente desconocidos en el número de copias de rDNA-gen entre diferentes residentes [16-19, 53]) y el aumento de la cobertura de 16 bases de datos de referencia S rDNA orales [54] deben permitir la disección de los factores microbianos gingivitis asociada al aún mayor sensibilidad y resolución.
Conclusiones Este estudio
reveló que, primero, la microbiota de los cuatro lugares de muestreo para la placa (la placa supragingival y la placa subgingival de los dientes anteriores; placa supragingival y la placa subgingival de los dientes posteriores; Métodos) eran similares entre sí, sin embargo, eran distinguibles de microbiota salival. En segundo lugar, las estructuras de la comunidad de microbiota de la placa, pero no microbiota saliva, se pueden utilizar para distinguir gingivitis. De este modo la placa debe servir de punto de muestreo de la opción de proporcionar un punto de vista microbiano para la enfermedad. En tercer lugar, se identificaron una serie de organismos como la gingivitis asociada (con varios géneros de baja abundancia-gingivitis específicos detectados, Tabla 3), que pueden servir como biomarcadores potenciales. Estos resultados tienen implicaciones importantes en las estrategias de muestreo y análisis de exploración de los factores de riesgo asociados a la gingivitis microbiana. Nuestros resultados permiten ahora a los nuevos estudios que examinan el desarrollo temporal y la epidemiología de los factores de riesgo microbianas detrás de la gingivitis. 0,05; Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
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