oral de células escamosas no metastásico
Resumen Antecedentes
carcinoma oral de células escamosas (COCE) se asocia con una baja tasa de supervivencia a los 5 años. En general, los pacientes diagnosticados con tumores pequeños tienen un pronóstico bastante buena, pero algunos tumores pequeños tienen un comportamiento agresivo que conduce a una muerte temprana. Existen en la actualidad no hay biomarcadores pronósticos fiables para los cánceres orales. Por lo tanto, para optimizar el tratamiento para el paciente individual, hay una necesidad de biomarcadores que pueden predecir el comportamiento del tumor.
Método
En el presente estudio el valor pronóstico potencial de plectina se evaluó mediante un microarray de tejido (TMA) inmunohistoquímico basado el análisis del tejido tumoral primario obtenido a partir de una cohorte de Noruega Norte de 115 pacientes diagnosticados de CEI. La expresión de plectina se comparó con las variables clinicopatológicas y supervivencia de 5 años.
Resultados Francia El análisis estadístico reveló que la baja expresión de plectina en las células tumorales predijo un resultado favorable para los pacientes con enfermedad no metastásica (p
= 0,008). Por otra parte, se encontró que la expresión de plectina correlacionar (p = 0,01
) con la expresión de uPAR, que hemos encontrado previamente a ser un marcador pronóstico potencial de tumores T1N0.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que baja expresión de plectina predice, por tanto, un resultado favorable para los pacientes con COCE no metastásico y el nivel de expresión de plectina puede ser utilizado en la estratificación de tratamiento para los pacientes con enfermedad en estadio temprano.
Antecedentes
el carcinoma de células escamosas (SCC) por más de 90% de las neoplasias malignas de la región de cabeza y cuello [1, 2]. Cabeza y cuello SCC (CECC) tienen una tasa de supervivencia a 5 años de aproximadamente 50%, [3, 4] y se clasificó como la octava causa de muerte por cáncer en todo el mundo [5].
CCCA incluye tumores localizados en el móvil lengua, piso de la boca, mucosa bucal, borde gingival y el paladar duro y blando. La clasificación del sistema más utilizado es el de la CCCA-TNM sistema por la Unión Internacional contra el Cáncer [6]. Este sistema se utiliza para describir la extensión anatómica de la enfermedad en el diagnóstico basado en el tamaño del tumor primario y la extensión del crecimiento del tumor (T), los ganglios linfáticos regionales metástasis (N) y la metástasis distante (M), y es la base para la etapa de agrupar estos pacientes [7, 8]. Por valoración morfológica, los tumores se clasifican así, moderado y pobremente diferenciado [1]. La TNM-clasificación, y en menor medida, el grado de diferenciación, a menudo se utilizan como predictores de resultado. Sin embargo, OSCCs son molecularmente heterogénea y tumores con idéntica TNM-clasificación y grado de diferenciación pueden diferir en la agresividad y la respuesta al tratamiento [7, 9]. Este comportamiento impredecible plantea la necesidad de una herramienta de diagnóstico que puede proporcionar información de pronóstico más fiable.
Un modelo de riesgo basada en el análisis histológico de los tumores se ha propuesto [10-12]. Sin embargo, en un estudio reciente este modelo no predijo el resultado de los pacientes con SCC lengua [13]. Varios informes anteriores han propuesto diferentes biomarcadores, tales como p53, EGFR, Ki67 y E-cadherina como marcadores pronósticos de la CCCA, [14-16], aunque ninguno de ellos ha sido implementado en la práctica clínica. En un intento de encontrar nuevos marcadores de pronóstico y mejor que tenemos en este estudio se centró en plectina plectina es una gran proteína intracelular citoesqueleto enlazador (& gt; 500 kDa) que se ha encontrado para ser importante en la organización de la red del citoesqueleto. Se expresa en la piel normal y en el revestimiento epitelial del tracto gastrointestinal del tracto, las células musculares y las células endoteliales de los vasos, [17], así como en el cáncer de esófago, estómago, pulmón, páncreas y la cavidad oral [17, 18]. Plectina se localiza en el lado interno de la membrana plasmática donde se asocia con los filamentos intermedios (IF), microtúbulos y microfilamentos [19]. En hemidesmosomas, plectina interactúa con la cola citoplasmática de la subunidad de la integrina β4. Los defectos en el gen plectina se han encontrado en la severa, hereditaria, ampollas en la piel hereditaria la enfermedad epidermólisis bullosa simple, haciendo hincapié en la importancia de la proteína en las células epiteliales normales [20]. Plectina afecta a las propiedades mecánicas, así como dinámicas del citoesqueleto, y (al menos en los queratinocitos) se ha demostrado plectina por deficiencia de que produzca un aumento tasas de migración probablemente a través de la activación de la Erk1 /2 vía [21]. En un estudio de investigación de CECC, Katada et al. encontró que la tasa de supervivencia de los pacientes con alta expresión plectina en sus células cancerosas se redujo significativamente, y la frecuencia de las recidivas se incrementó significativamente, en comparación con los pacientes con expresión plectina baja [22].
En un estudio reciente se demostró que la uroquinasa receptor del activador de plasminógeno (uPAR) y activador de plasminógeno inhibidor-1 (PAI-1) puede ser marcadores de pronóstico en etapa temprana OSCC [23]. uPAR es un constituyente del sistema activador de plasminógeno (PA), y tanto del activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) y uPAR están vinculados a un aumento de la actividad proteolítica y la migración de células cancerosas. UPA convierte el plasminógeno en plasmina la serina proteasa activa, una proteasa de amplio espectro que puede degradar muchos tipos diferentes de proteínas de matriz extracelular, además de activar los factores de crecimiento y metaloproteasas de la matriz [24, 25] latente. Por fijación de uPA a uPAR, las células cancerosas pueden dirigir la actividad proteolítica a la superficie celular [26]. Al igual que con plectina, el aumento de la expresión de uPAR se ha relacionado con la transición fenómeno epitelial-mesenquimal (EMT) [27-29].
En este estudio basado en la TMA, se encontró que la baja expresión de plectina a ser un marcador de una pronóstico favorable en COCE no metastásico. Plectina y uPAR mostraron patrones de tinción similares en los tumores y había una correlación significativa entre plectina y uPAR expresión.
Métodos Las muestras
Este fue un estudio retrospectivo utilizando formol fija, muestras tumorales incluidas en parafina de 115 pacientes con histológicamente verificado CCCA primaria en el período 1986-2002 recogidos de los archivos del Departamento de Patología clínica, hospital de la Universidad del Norte de Noruega. Para asegurar una cohorte homogénea, se excluyeron los tumores con patrones de crecimiento verrugosas, así como los tumores de pacientes con cáncer anterior, o radioterapia antes de la zona de la cabeza y el cuello. Todos los pacientes presentaron enfermedad primaria localizada en la cavidad oral, incluyendo la lengua móvil, piso de la boca, mucosa bucal, encías y el paladar duro y blando. datos clínicos relevantes y clasificación TNM-fueron recuperados de los archivos de los pacientes, incluyendo los informes de patología, Estadísticas de Noruega y la causa de la muerte del Registro. Los estados de N y M se determinaron por examen clínico y radiológico. El tejido mucosa lengua normal se obtiene a partir de tejido adyacente al tejido tumoral. El estudio fue aprobado por los Comités Regionales de Medicina y Salud Ética de la Investigación, el norte de Noruega (Nº 22/2007). La información del paciente se des-identificarse antes del análisis. El comité de ética, no era necesario obtener el consentimiento escrito o verbal de los pacientes participantes. Microarrays
tisular (TMA)
Se identificó una región morfológicamente representante de cada tumor en un hematoxilina y eosina (HE) de diapositivas teñidas, y núcleos para el TMA fueron cosechadas a partir del bloque de tejido correspondiente usando un Arrayer tejido Beecher Instrumentos Micro. Ocho núcleos de 0,6 mm fueron tomadas de las regiones seleccionadas del bloque donante de cada tumor y se insertan en los bloques de parafina de microarrays destinatario. Cuatro micras de grosor de la, embebidos en parafina de tejido TMA fijo se cortaron con un microtomo y se colocaron en portaobjetos Superfrost. HE-tinción inmunohistoquímica y citoqueratina-tinción se realizó para verificar la presencia de tejido tumoral.
Hemos experimentado una pérdida de 16,5% de los núcleos durante la preparación, y de los núcleos conservados, 8,4% contenían muy pocas células tumorales para ser evaluados . Esta pérdida debido a problemas técnicos es moderada en comparación con otros informes [30, 31]. De cada paciente una media de 3,82 núcleos teñidos y evaluadas para la expresión plectina.
Evalúa a partir de cada paciente fue de 3,82.
Inmunohistoquímica (IHC)
Todas las diapositivas se deparaffinised y rehidratada. La recuperación de antígeno plectina se mejoró por ebullición en un sistema presurizado con tampón citrato 10 mM (pH 7,0). Además, los portaobjetos se incubaron 30 min con 3% de H
2O 2 para bloquear la actividad peroxidasa endógena, y se incubaron una hora con 10% de suero de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) en tampón fosfato salino (PBS) ( Dako, Glostrup, Dinamarca) para reducir la tinción no específica. Rabbit anticuerpo monoclonal primario contra plectina (ab32528, Abcam, Cambridge, MA) se diluyó 1: 200 en diluyente de anticuerpo Dako (S3022, Dako, Glostrup, Dinamarca), y se incubó durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando el sistema anti-conejo Envision Plus (K4011, Dako, Glostrup, Dinamarca). Los portaobjetos se lavaron en PBS w /0,1% de Tween-20 con altas concentraciones de sal (0,4 M NaCl) y pH 6,0 (PBSTS6) después de la incubación con anticuerpos primarios y secundarios.
El anticuerpo anti-plectina (ab32528 ) ha sido previamente descrito y validado como un buen marcador para el adenocarcinoma de páncreas [18]. Como control negativo, tejido de carcinoma de páncreas se trató según el mismo protocolo de tinción, pero se omitió el anticuerpo primario. No se observó tinción que indica que el anticuerpo secundario no dio tinción no específica en el tejido (datos no mostrados).
La tinción de la mucosa oral normal mostró una tinción específica y fuerte del tejido muscular en los vasos sanguíneos, que sirve como control positivo.
la tinción uPAR se realizó de acuerdo a los protocolos anterior describe [23].
inmunohistoquímico de puntuación
Todos los núcleos fueron examinadas por un patólogo experimentado (SES) y un cirujano de cabeza y cuello entrenados (O) y sin conocimiento de los resultados clínicos. La puntuación fue semi-cuantitativa, [32, 33] y el índice de tinción (SI) calcula como un producto de la intensidad de la tinción (ninguno (0), débil (1), moderada (2) o fuerte (3)) y la proporción de las células tumorales positivas (sin tinción (0), & lt; 10% (1), 10 a 50% (2), 51-80% (3) o & gt; 80% (4)). Por lo tanto, la IS para cada núcleo difería de un valor mínimo de cero hasta un máximo de 12, y el resultado final del paciente fue la media de todos los núcleos SI evaluados. Los tumores con puntuación por encima de la mediana fueron clasificados como altos expresadores ', mientras que los de la partida según el valor de la mediana fueron clasificados como teniendo una baja expresión del biomarcador.
Inmunofluorescencia (IF) Opiniones de si el análisis de los portaobjetos se trataron previamente como se describe en el protocolo de IHC para plectina. Un anticuerpo anti-plectina policlonal de conejo (ab83497, Abcam, Cambridge, MA) se utilizó recomendado para IF. El anticuerpo se diluyó 1:10 en diluyente Dako anticuerpo (S3022, Dako, Glostrup, Dinamarca) y se incubó durante 3 h a temperatura ambiente. Después los portaobjetos se había lavado con PBSTS6, se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo uPAR anti-humano monoclonal de ratón (# 3936, Sekisui Diagnostica, Stamford, CT, EE.UU.) a una dilución 1:10 en un tampón de 10 suero de cabra% (Dako América del Norte, Carpintera, CA, EE.UU.) en PBS con 1% de BSA y 0,3% de Tween-20, pH 6,0. Después de la incubación los portaobjetos se lavaron con PBSTS6. Los anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488, conejo de cabra-anti, A11034 y Alexa Fluor 647, ratón de cabra-anti, A21236, Invitrogen, Carlsbad, CA) se mezclaron y se diluyeron 1: 200 en PBS. Los portaobjetos se montaron y de contraste con DAPI antifade (DAPI en Fluorgard, 0,5 g /ml, Insitus, Albuquerque, NM) y sellados con esmalte de uñas. Se observaron y fotografiaron las diapositivas utilizando Leica TCS microscopio láser confocal SP5 con el software Leica Application Suite avanzada de fluorescencia (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Alemania). México La especificidad del anticuerpo policlonal anti-plectina (ab83497) utilizados en la tinción de inmunofluorescencia se ensayó por tinción adenocarcinoma de páncreas. Similar al anticuerpo monoclonal anti-plectina, el anticuerpo anti-plectina policlonal tiñeron específicamente a las células de cáncer de páncreas. Además, la transferencia Western de lisado de células de músculo entero
mostró que el anticuerpo dio una banda de los aproximadamente 500 kDa correspondiente al tamaño de plectina (datos no mostrados). Estadísticas
se tabularon Todos los datos y se analizaron usando el IMB SPSS Estadísticas (Chicago, IL), versión 21. las asociaciones entre las diferentes variables categóricas se evaluaron mediante la prueba de chi-cuadrado Pearson`s. El análisis univariado de influencia de las diferentes variables "en el momento de la supervivencia específica de la enfermedad se realizaron utilizando el método de Kaplan-Meier, y la significación estadística entre las categorías se estimó mediante la prueba de log-rank. Los valores estadísticamente significativos de los análisis univariado de Cox se introdujeron en un análisis multivariante mediante regresión de Cox por pasos hacia atrás. la muerte específica de la enfermedad (DDS) se definió como pacientes que mueren forma CCCA y no de condiciones no relacionadas. Estos datos se obtuvieron de la "Causa de Muerte Registro en Noruega. Correlación entre bivariados se calculó con rho de Spearman. El punto de corte de baja y alta expresión para cada biomarcador se fijó en el valor de la mediana de la puntuación final del paciente, y fue 5.60 por plectina y 5,63 para uPAR. Todos los resultados se consideraron significativos si p Hotel & lt; 0,05, e indicará con arreglo a las directrices de observación de McShane et al. [34] El punto de partida se define como el momento del diagnóstico, y el último día del seguimiento el 1º de enero er, 2012.
Resultados
En el presente estudio se evaluó el valor pronóstico de plectina en COCE por un análisis inmunohistoquímico a base de TMA de tejido tumoral primario obtenido a partir de una cohorte de Noruega Norte de 115 pacientes. La cohorte consistió en 64 hombres y 51 mujeres, con una edad media de 65,2 años (hombres 64,4 /66,0 las mujeres) al momento del diagnóstico [23]. La mayoría de los casos presentados con tumores pequeños (T1, 34% o T2, 37%), no de los ganglios linfáticos metástasis (N0, 63%) y un tumor bien o moderadamente diferenciado (90%). Como era de esperar, el tamaño del tumor (T) y la presencia de metástasis de ganglios linfáticos (N +) se correlacionó significativamente con la enfermedad de mortalidad específica (DDS), mientras que el grado de diferenciación no lo hizo.
Patrón de tinción inmunohistológica
plectina lengua normales apenas manchado mucosa que sirvió como material de control, mientras que los vasos sanguíneos en el estroma subyacente muestran tinción más fuerte (Fig. 1a). En OSSC plectina-positivo tumores la tinción fue relativamente homogénea en todo el tumor (Fig. 1b). Las células cancerosas fueron altamente positivos mientras que la matriz extracelular adyacente mostró menor reactividad. La tinción de las células cancerosas se limita principalmente a la membrana plasmática (Fig. 2), pero tinción citoplásmica también se observó en una proporción relativamente grande de los núcleos. Higo. 1 Tinción inmunohistoquímica para plectina de mucosa lengua normal (a) y el carcinoma de células escamosas oral (b). La mucosa normal mostró sólo tinción débil mientras que los vasos sanguíneos en el estroma fueron fuertemente manchadas. La tinción de las células tumorales positivas plectina era fuerte, y el estroma casi no mostró tinción
Fig. 2 immunhistochemical patrón de tinción en los núcleos de TMA de carcinoma oral de células escamosas. Plectina tinción fue principalmente en la membrana plasmática, pero también algo de tinción citoplasmática fue visto
Supervivencia
Para los pacientes sin metástasis a los ganglios linfáticos (N0), en cualquier estadio T, el riesgo de morir de la enfermedad dentro de los 5 años fue disminuido significativamente en los pacientes con tumores de bajo plectina expresar en comparación con aquellos con la expresión plectina alta (p = 0,008
) (Tabla 1 y Fig 3). Además, para los pacientes con tumores T1-e independientes de la N-estado, los análisis estadísticos revelaron una reducción significativa del riesgo de DSD en los que tenían tumores con expresión plectina baja (p = 0,031
). Como era de esperar, dados los resultados anteriores, los pacientes con tumores T1N0 con baja expresión plectina tuvieron un resultado excelente ya que todos estos pacientes seguían vivos después de 5 años (p Restaurant & lt; 0,001). En un análisis multivariado de los casos N0-incluyendo plectina y el tamaño del tumor (T1 vs T2-4), solamente una expresión de alto plectina fue un predictor independiente significativo del aumento de la DSD (p = 0,014
, HR 3,674, IC del 95% 1.305- 10.344) .Tabla 1 Expresión de plectina en toda la cohorte, el N0, T1 y T1N0 pacientes al momento del diagnóstico. El número de pacientes con una enfermedad específica de muerte de 5 años (DDS) se da en los números y también como porcentaje del total de cada grupo de total de cada grupo
plectina
baja expresión
alta expresión
DSDP
Todo pacientesa
N (% del total)
55
56
5 años DSD
19 (35%)
25 (45%)
0,198
N0-casesb
N (% del total)
36
32
5 años DSD
5 (14%) guía empresas 13 (41%)
0,008 *
T1 -casesc
N (% del total)
23
16
5 años DSD
2 (9%)
6 (38%)
0,031 *
T1N0-casesd
N (% del total)
página 19
9
5 años DSD
0
4 (44%)
& lt; 0,001 *
número atotal de pacientes incluidos en el análisis fue de 111
número btotal de pacientes incluidos en el análisis fue 68
número Ctotal de pacientes incluidos en el análisis se 39
número dtotal de pacientes incluidos en el análisis fue de 28
p * Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo, y se destaca en boldsface cuando está presente
Fig. 3 gráfico de Kaplan-Meier. La figura ilustra la diferencia en la supervivencia entre los pacientes con N0-alta y baja expresión de plectina respectivamente
Correlación de plectina y uPAR expresión
Recientemente hemos demostrado que los pacientes con tumores T1N0 expresar bajos niveles de uPAR tienen un reducido significativamente DSD en comparación con aquellos con una expresión uPAR superior. Para investigar la distribución de la expresión de uPAR y plectina en los tumores que hicimos una prueba de chi-cuadrado, y se encontró que un número significativo de los tumores que eran altos expresadores de uPAR también eran altos expresadores de plectina, y aquellos con baja expresión de uPAR generalmente eran bajos expresadores de plectina. Esta correlación fue significativa con un coeficiente de correlación de 0,769 (p = 0,01
) como se muestra en un gráfico de dispersión en la Fig. 4. Doble tinción de inmunofluorescencia se realizó en algunos tumores seleccionados para investigar si plectina y uPAR fueron co-localizados dentro de las mismas células, co-expresada por las mismas células, o encuentra a las mismas regiones del tumor. La inmunofluorescencia mostró que el plectina y tinción uPAR se localizó en las mismas áreas del tumor (Fig. 5). Como era de esperar, la tinción de inmunofluorescencia confirmó que plectina se encuentra principalmente en la membrana plasmática, mientras que uPAR fue localizada principalmente en el citoplasma. Higo. parcela 4 Dispersión de uPAR y la puntuación plectina para toda la cohorte. Hubo una correlación significativa (p = 0,01
) entre el plectina y la puntuación uPAR. Las líneas de color gris claro en la figura representan el intervalo de confianza del 95%
Fig. 5 Inmunofluorescencia La tinción de tejido de carcinoma de células escamosas oral. La mayoría de las células fueron positivas tanto para plectina y uPAR. Plectina (verde) se encuentra principalmente en la membrana plasmática y la periferia de la célula, mientras que uPAR (rojo) es más prominente en la parte citoplásmica de las células. Plectina es altamente expresado en la pared de los vasos sanguíneos (asterisco
)
Discusión
La cirugía es el tratamiento primario para el cáncer en la cavidad oral, y con frecuencia se combina con radioterapia a medida que la quimioterapia se aplica más a menudo como tratamiento paliativo en la última fase del tratamiento [35-37]. Los efectos secundarios del tratamiento para el cáncer oral pueden ser devastadores para la calidad de vida del paciente, [38], por lo que es importante evitar el sobretratamiento perjudiciales con radioterapia de los pacientes con tumores pequeños con pronóstico favorable. Las decisiones relativas a la extensión del tratamiento de los pacientes con COCE etapa temprana son a menudo difíciles. Aún así, la elección del tratamiento se basa principalmente en TNM-etapa, que no discrimina entre los tumores agresivos y más indolente. Varios estudios sobre biomarcadores potenciales para la estratificación del tratamiento han mostrado resultados prometedores, pero hasta el momento no hay tales biomarcadores se han aplicado en la práctica clínica. En el presente estudio hemos investigado el papel potencial de plectina como un biomarcador pronóstico. A nuestro entender, el valor pronóstico de plectina en OSCCs que hasta ahora sólo ha estudiado por Katada et al. que investigó una cohorte de 62 HNSCC, entre ellos 23 de la cavidad oral [22]. Aunque la cohorte era pequeña y heterogénea, encontraron que la supervivencia se redujo significativamente cuando las células tumorales expresan altos niveles de plectina. Nuestra cohorte es más grande y compuesto solamente de los tumores de la cavidad oral y por lo tanto más homogéneo. De acuerdo con los resultados de Katada et al., Se encontró que la baja expresión de plectina en las células tumorales predice un resultado favorable, pero sólo en los pacientes con enfermedad en estadio temprano.
Hemos encontrado previamente que la baja expresión de uPAR correlacionado con DSD reducida para los pacientes con tumores T1N0 CCCA, y que, por tanto, uPAR podría ser un marcador pronóstico adecuado para este subgrupo de pacientes [23]. En el presente estudio se encontró una correlación altamente significativa entre la expresión de plectina y uPAR. Sin embargo, en contraste con uPAR, la alta expresión de plectina correlacionó significativamente con DSD en todos los pacientes con enfermedad no metastásica, y no sólo el subgrupo T1N0.
Mayoría de las células tumorales que expresaban plectina también expresó uPAR. Previamente se ha sugerido que el aumento de expresión de uPAR en las células tumorales se asocia con EMT [27, 29, 39]. Poco se sabe sobre plectina y EMT, pero la formación de podosomes contiene plectina-ha sido propuesta como un primer paso hacia la EMT en CCCA [40].
Conclusión Francia El presente estudio ha demostrado que la baja expresión de plectina predecir una resultado favorable para los pacientes con enfermedad no metastásica. Además, todos los pacientes con enfermedad T1N0 y baja expresión de plectina, sobrevivieron durante más de 5 años. Aunque los resultados deben ser validados en las cohortes más grandes, sugieren plectina como un biomarcador pronóstico prometedor, que puede utilizarse para guiar la estratificación de tratamiento para los pacientes con COCE no metastásico
abreviaciones
DSD:.
Enfermedad de mortalidad específica
EMT:.
transición epitelio-mesenquimal
CECC:
cabeza y el carcinoma escamoso de cuello
CCCA:
oral carcinoma de células escamosas
TMA:
Tissue microarrays
TNM: sistema de clasificación
para evaluar la extensión de la metástasis de ganglios linfáticos regionales tumor primario y la metástasis distante
uPAR:
uroquinasa receptor activador del plasminógeno
Declaraciones
Agradecimientos agradecemos
Bente Mortensen, Eli Berg y Magnus Persson por su excelente asistencia técnica, e Inger Sperstad para obtener ayuda con el diseño de la base de datos. Además agradecemos a Bodil Fadnes para obtener ayuda con la tinción de inmunofluorescencia y cuestiones técnicas. Este trabajo fue apoyado Los del norte de Noruega Autoridades Sanitarias Regionales y UiT La Universidad Ártico de Noruega, ambas organizaciones sin ánimo de lucro que son
acceso abierto Este artículo se distribuye bajo los términos de la Licencia Internacional 4.0 Creative Commons Reconocimiento (http:. //creativecommons. org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que le dan el crédito correspondiente al autor (s) original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http:. //Creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
de la competencia. intereses
los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores
OGR recogido el material, lleva a cabo la tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, interpretado los datos, el análisis estadístico realizado, y redactó el manuscrito. SNM llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica, interpreta los datos y redactó el manuscrito. Gs y EHO participado en el diseño del estudio, contribuyeron a la interpretación de los datos, y la revisión crítica del manuscrito. LUH concebido el diseño del estudio, contribuyó a la interpretación de los datos, y la revisión crítica del manuscrito. SES participó en el diseño del estudio, contribuyó a la interpretación de los datos, el análisis estadístico, y revisó el manuscrito de gravedad. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
