Resumen Antecedentes
Porphyromonas gingivalis
se ha demostrado a invadir los osteoblastos e inhibir su diferenciación y mineralización in vitro. Sin embargo, no está claro si P. gingivalis
pueden invadir los osteoblastos in vivo y cómo esto afectaría la dinámica de osteoblastos /osteoclastos alveolares. Este estudio tiene como objetivo dar respuesta a estas preguntas utilizando un modelo de ratón bajo la periodontitis P. gingivalis repetitivas
inoculaciones.
Métodos Opiniones de 3 meses de edad, los ratones hembra BALB /cByJ, 10
9 UFC de P. gingivalis
fueron inoculadas en el margen gingival de los molares superiores, 4 veces a intervalos de 2 días. Después de 2 semanas, se aplicaron otros 4 inoculaciones a intervalos de 2 días. Calceína se inyectó 7 y 2 días antes de sacrificar los animales para etiquetar el hueso de nueva formación. Cuatro semanas después de la inoculación final, los ratones se sacrificaron y se recogieron maxilar. La inmunohistoquímica, micro-CT, y la histomorfometría ósea se realizaron sobre las muestras. infección simulada con el único vehículo fue el control.
Resultados
P. gingivalis
se encuentran a invadir el epitelio gingival, los fibroblastos del ligamento periodontal, y los osteoblastos alveolares. Micro-CT mostró la resorción ósea alveolar y la reducción significativa de la densidad mineral ósea y el contenido en los ratones infectados en comparación con los controles. histomorfometría ósea mostró una disminución en los osteoblastos, un incremento en los osteoclastos y la resorción ósea, y una formación ósea osteoblástica sorprendentemente aumentado en los ratones infectados en comparación con los controles.
Conclusiones
P. gingivalis
invade osteoblastos alveolares en el periodontitis modelo de ratón y causar la pérdida de hueso alveolar. Aunque P. gingivalis
parece suprimir la piscina de osteoblastos y mejorar la resorción ósea osteoclástica, la capacidad de formación de hueso se eleva temporalmente en los ratones infectados, posiblemente a través de algunos mecanismos compensatoria anti-microbianos.
Palabras clave
osteoblastos P. gingivalis material complementario
invasión micro-CT Bone histomorfometrıa Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-89) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados <. br> Antecedentes
la periodontitis afecta hasta el 20% de la población mundial [1]. Es una indicación de la mala salud oral y se vincula a la mala salud general y una calidad de vida en peligro, sobre todo en la población geriátrica [2]. El sello distintivo de la periodontitis es la pérdida de la conectividad entre el diente, tejidos periodontales, y el hueso alveolar. La destrucción del tejido y la resorción de hueso resultados en la formación de la bolsa periodontal, un espacio subgingival ampliada que es un hábitat de protección para los microorganismos periodontales. El desarrollo de la periodontitis es un proceso multifactorial que gira alrededor de complejas interacciones huésped-microorganismo [3]. P. gingivalis
es un anaerobio pigmentado negro gram-negativa que coloniza la grieta subgingival, y ha sido identificado como uno de los principales agentes patógenos periodontales. Cuenta con múltiples factores de virulencia conocidos que contribuyen a su supervivencia en el medio oral, tales como fimbrias, gingipains, lipopolisacáridos (LPS), cápsula, y hemaglutininas [4].
Existen pruebas suficientes de que los múltiples componentes de P. gingivalis
puede actuar sobre los osteoblastos para inhibir la formación de hueso alveolar. P. gingivalis
LPS, lípidos, productos metabólicos y extractos sometidos a ultrasonidos pueden inhibir la diferenciación de los osteoblastos y la osteogénesis [5-10], y modulan RANKL (activador del receptor del ligando del factor nuclear-kappaB) y OPG expresión /o (osteoprotegerina) en osteoblastos para estimular indirectamente la osteoclastogénesis [11-14]. Recientemente, nuestro laboratorio ha establecido que P. gingivalis
pueden invadir los osteoblastos e inhibir su maduración y mineralización in vitro [15], y fimbrias desempeñar un papel importante en la mediación del proceso invasivo inicial [16].
Patógenos periodontales tienen ha demostrado que una intrusión en la superficie alveolar y ocupar lagunas vacías en pacientes con periodontitis severa [17]. No está claro si P. gingivalis
pueden invadir los osteoblastos in vivo, y si es así, cómo podría influir en la homeostasis ósea en los sitios infectados. Los ratones no tienen P. gingivalis
como parte de su microflora oral endógena [18]. Sin embargo, la periodontitis y la pérdida de hueso alveolar han sido inducidos con éxito en ratones por inoculación intraoral de vida P. gingivalis
[19-21]. El objetivo del presente estudio es investigar la invasión de los osteoblastos alveolares de P. gingivalis
, y cómo acoplamiento osteoblastos osteoclastos se ve afectado por una infección bacteriana en un modelo de ratón bajo la periodontitis P. gingivalis repetitivas
inoculaciones. Se encontró que P. gingivalis
fue capaz de invadir las células periodontales y perturbar la homeostasis de los osteoblastos y los osteoclastos, que en última instancia contribuye a la pérdida de hueso alveolar.
Métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
P. gingivalis
cepa ATCC 33277 se cultivó anaeróbicamente a 37 ° C en una cámara anaeróbica Coy bajo una atmósfera de 86% de nitrógeno: 10% de dióxido de carbono: 4% de hidrógeno. El medio de cultivo era caldo de soja Trypticase (TSBY) suplementado con extracto de levadura 5%, bicarbonato de sodio al 2%, hemina 7,5 M y 3 M menadiona. placas de agar sangre TSB (BAP) se realizaron con la adición de la sangre 5% de oveja y 1,5% de agar. Las bacterias se inocularon de BAP en 5 ml de TSBY y se cultivaron anaeróbicamente durante 18 a 24 horas a 37 ° C, después se diluyó en TSBY y crecer hasta la fase log temprana. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a baja velocidad, se lavaron, y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La concentración de bacterias se determinó con un espectrofotómetro a una densidad óptica de 600 nm (OD = 1 10 9P. Gingivalis
por ml). 10 9 UFC de P. gingivalis en vivo
se recogió y se sedimentaron por centrifugación a baja velocidad, a continuación, se volvió a suspender en 20 l de PBS con 2% de carboximetilcelulosa. La suspensión bacteriana se aplica a la margen gingival de los molares superiores de ratón como se detalla a continuación.
Inoculaciones bacterianas
un modelo de ratón periodontitis se estableció con una ligera modificación del método descrito anteriormente [22]. Brevemente, 10 a 12 semanas de edad, los ratones hembra BALB /cByJ se mantuvieron en ambiente libre de patógenos específicos. Recibieron kanamicina a 1 mg /ml en agua desionizada agua ad libitum durante 7 días. Tres días después del tratamiento con antibióticos, los ratones se sometieron a una breve anestesia con isoflurano, y 10 9 UFC de P. gingivalis en vivo
en 20 l de PBS con 2% de carboximetilcelulosa se aplicó al margen gingival de los molares superiores ratón cuatro veces, 2 días de diferencia. Los ratones fueron impedidos de alimentos y la ingesta de agua durante 1 hora después de la inoculación. Se utilizó una concentración de inoculación de 1 x 10 9 CFU, ya que nuestro estudio preliminar mostró que esta concentración era suficiente para inducir P. gingivalis
invasión de periodonto y la pérdida ósea alveolar. grupo infectado Sham recibió 20 l de PBS con 2% de carboximetilcelulosa solo. Dos semanas más tarde, otros cuatro dosis (2 días de diferencia) se aplicaron a los ratones. Cuatro semanas después de la segunda desafío oral, los ratones se sacrificaron, y se recogieron las muestras maxilares para micro-CT y estudios histomorfometría ósea. Para P. gingivalis
estudio invasión, inmunohistoquímica se realizó en muestras recogidas maxilar 3 días después de tres veces de inoculaciones bacterianas. Diez animales cada uno se incluyeron para ambos grupos infectados y simuladas para los estudios antes mencionados. Todos los experimentos relacionados con animales fueron aprobados por el Centro de Medicina de Laboratorio Animal Care y en la Universidad de Texas Health Science Center en Houston (animal protocolo aprobado HSC-AWC-10-145).
Inmunohistoquímica
Ratones especímenes fueron superiores aislado, se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra, descalcificadas en 3,4% de formiato de sodio /ácido fórmico 15%, y embebidos en parafina. La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando HCl 4 N durante 10 minutos a 37 ° C. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de 10 minutos con 3% de H 2O 2. proteínas no específicos se bloquearon con el bloque de proteína DAKO (Dako, Carpinteria, CA) durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Las secciones se incubaron a TA durante 1 h con 1: 4000 de conejo anti- P. gingivalis
anticuerpo policlonal. anticuerpo secundario y tinción sustrato se realizaron con Dako LSAB + kit y DAB + líquido sistema de sustrato-cromógeno (Dako). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina. El número de osteoblastos con la invasión bacteriana se contó manualmente. Por tanto P. gingivalis
grupos infectados y de control, se analizaron 10 muestras. Se contó el número total de osteoblastos que revisten la superficie del hueso alveolar en la sección. La fórmula para cacluate porcentaje de tinción positiva fue: (número de osteoblastos manchado marrón /número total de osteoblastos contado) × 100
micro-CT
Cuatro semanas después de la inoculación final, se recogieron y fotografiada con el maxilar ratón. un Scanco micro-CT 40 (Scanco médico, Brüttisellen, Suiza) a una resolución de 12 micras. Las imágenes de micro-CT fueron adquiridas en el Colegio Baylor de Medicina Fondo para micro-CT Core y reconstruidas usando un método modificado Feldkamp [23]. Los datos de imagen se analizaron similar a lo que fue descrito por Park et al. [24]. En resumen, todas las imágenes se reorientaron de tal manera que la unión cemento-esmalte (CEJ) y el ápice de la raíz (RA) aparecen en el mismo segmento. La región de interés (ROI) se ha elaborado de forma manual en los planos axiales, entre la superficie de la raíz medial del primer molar y la superficie de la raíz distal del tercer molar. Los contornos se extrajeron de forma continua cada 5 planos de datos desde el techo de la furcación todo el camino hasta el ápice de la raíz, hasta una (3D) ROI tridimensional se genera (Figura 1). Todos los volúmenes de raíz fueron excluidos de la ROI para calcular el volumen total (TV). Los parámetros analizados para cada muestra incluyen fracción ósea volumen (BVF = BV /TV), la densidad mineral ósea (BMD, normalizada a un fantasma hidroxilapatita), y el contenido mineral óseo (BMC = BMDX BV). Figura 1 Los métodos para generar ROI 3D (región de interés) que se utiliza en el análisis de micro-CT del hueso alveolar. Bidimensionales contornos se dibujan manualmente cada cinco aviones de datos en la vista axial, desde el techo de la furca en el ápice de la raíz. área de superficie de la raíz fue excluido de la superficie del hueso en cada plano medido. Un ROI 3D fue creado después de que todos los contornos 2D fueron extraídas. volumen de hueso alveolar se calculó como el volumen total de la raíz ROI menos. Bone Histomorphometry
Cuatro semanas después de la inoculación final, se recogieron y se corta en dos mitades para el análisis de histomorfometría estática y dinámica, respectivamente maxilar ratón. Para la histomorfometría dinámica, los ratones recibieron 10 mg /kg de peso corporal de calceína en 2% por vía intraperitoneal NaHCO3 7 y 2 días antes de sacrificar a etiquetar el hueso de nueva formación. Maxilar fueron disecados libre de los tejidos y las coronas de los dientes suaves fueron amputados a lo largo de la superficie del hueso alveolar. Las muestras fueron fijadas en etanol al 70% durante 3-5 días, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, despejado en xileno, y embebidos sin descalcificar en metacrilato de metilo. Cinco secciones gruesas micrómetro se cortaron en paralelo con el eje largo de los molares, y las secciones de cerca del centro de las cámaras de pasta se montaron sin mancha para la visualización de la superficie de mineralización bajo luz UV con un filtro de I3. Para la medición estática, maxilar superior se fijó en paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante 2-5 días. Los huesos fueron descalcificadas en EDTA /NH 3OH durante otros 2-5 días y se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, despejado en xileno, y embebidos en parafina. Los huesos incrustados se cortaron en paralelo con el eje largo de los molares, y se montaron secciones cerca del centro de las cámaras de pasta. secciones consecutivas se tiñeron con azul de toluidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, Sigma-Aldrich) para la visualización de los osteoblastos y los osteoclastos, respectivamente. Los tipos de células fueron validados por su morfología característica, como cúbico de osteoblastos y osteoclastos multinucleados para. Todos los osteoblastos y osteoclastos sobre toda la sección se contaron, para evitar las variaciones espaciales en sus distribuciones. mediciones histomorfométricos se hicieron en una forma ciega, no sesgada, y la terminología y las unidades utilizadas fueron las recomendadas por el Comité de Nomenclatura La histomorfometría de la Sociedad Americana de Investigación Ósea y Mineral [25]. Todos los análisis de histomorfometría ósea se llevó a cabo en la Universidad de Texas MD Anderson instalación de centro de cáncer de hueso histomorfometría Core utilizando el sistema Bioquant Osteo II de imagen por ordenador de análisis (BIOQUANT Image Analysis Corporation, Nashville, TN) en interfase con una Leica DM 1000 microscopio (Leica Microsystems, Wetzlar , Alemania). estadísticas
P. gingivalis
infectado con grupos sham y tener 10 animales cada uno para todos los experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de la t de Student para determinar la significación entre los grupos (p & lt; 0,05).
Resultados
P. gingivalis
invade las células epiteliales gingivales, las células del ligamento periodontal (PDL), y los osteoblastos alveolares en el periodontitis ratón modelo
tres días después de tres veces de provocación oral con P. gingivalis
, inmunohistoquímica mostró tinción positiva para P. gingivalis
en las células epiteliales gingivales, fibroblastos, osteoblastos PDL que recubren la superficie alveolar y osteocitos incrustado en la matriz ósea en el grupo infectado, pero no se detectó tinción en el grupo infectado con tratamiento simulado de control (Figura 2). Aproximadamente el 17,6 ± 2,1% de los osteoblastos alveolares tenía P. gingivalis
invasión basado en el conteo manual. Teñidos positivamente (marrón) fibroblastos periodontales se distribuyeron de manera uniforme dentro del tejido conectivo. Este resultado demuestra que P. gingivalis de
invade con éxito profunda periodonto en nuestro modelo animal periodontitis. Figura 2 P. gingivalis invaden los tejidos blandos y duros periodontales después de inoculaciones repetitivas, como se muestra mediante inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica se realizó tres días después de tres veces de P. gingivalis
inoculaciones. A. Control Sham-infectada. Anti-P. gingivalis
anticuerpo primario se aplicó en el ensayo. El azul es contratinción de hematoxilina. Note que no hay tinción positiva marrón para P. gingivalis
en el periodonto. B. P. gingivalis
animales infectados, con anti-P. gingivalis
anticuerpo primario excluidos del ensayo, que no muestra tinción positiva en el periodonto. Esto demostró que no había tinción inespecífica de anticuerpos y /o sustrato secundario. C. P. gingivalis
animales infectados, con anti-P. gingivalis
anticuerpo primario incluido en el ensayo. Extensas manchas para P. gingivalis
se observó en las células epiteliales gingivales, fibroblastos y osteoblastos, PDL alveolares. D. vista ampliada en C. Positivo P. gingivalis
tinción se detectó en los fibroblastos (indicado por las flechas rojas) en el espacio del ligamento periodontal, los osteoblastos que recubren la superficie del hueso alveolar (denotados por flechas negras), y en un osteocitos incrustado en el la matriz del hueso alveolar (denotado por la cabeza de flecha negro). Abreviaturas: CT, el control, el tratamiento simulado infectados; PG, P. gingivalis
infectado; Ab, anticuerpo; R, raíz; E, células epiteliales gingivales; PDL, ligamento periodontal; B, hueso alveolar; barra de escala = 20 micras.
P. gingivalis
infección causa la pérdida de volumen de hueso alveolar y la densidad
Cuatro semanas después de la inoculación oral final con P. gingivalis
, se recogieron muestras y la imagen con el ratón maxilar escáner micro-CT. Las imágenes Micro-CT muestran una disminución de la altura del hueso alveolar y la resorción de bifurcación de los molares de ratón (Figura 3A), y disminución de la densidad mineral del hueso alveolar en especial en el margen gingival en los ratones infectados en comparación con el control simulado (Figura 3B). La cuantificación de los resultados de micro-CT demuestra una reducción significativa de la fracción de volumen de hueso alveolar, la densidad mineral ósea y el contenido mineral de los huesos de los animales infectados en comparación con los controles (Figura 3C-E). Figura 3 la infección por P. gingivalis causa la pérdida de volumen de hueso alveolar y la densidad como se demuestra por micro-CT. análisis de micro-CT se realizó cuatro semanas después de un total de ocho inoculaciones bacterianas. La disminución de la altura del hueso alveolar y la implicación de la furcación (A) y disminución de la densidad mineral en la superficie alveolar (B) se observó en los animales infectados. En el panel A, flechas rojas apuntan a la implicación de la furca. En el panel B, el color más oscuro rojo púrpura indica las regiones de menor densidad mineral. La cuantificación de la micro-CT datos muestran que P. gingivalis repetitivas
infección causó una reducción significativa en la fracción alveolar de hueso (C), la densidad mineral ósea (D), y el contenido mineral óseo (E) en comparación con los controles. Abreviaturas: CT, el control, el tratamiento simulado infectados; PG, P. gingivalis
infectado; % BV /TV, restante volumen de hueso alveolar sobre volumen total; DMO, la densidad mineral ósea (normalizó al fantasma hidroxilapatita); BMC, el contenido mineral óseo (= BMD X BV); *, Denota P & lt; 0,05 en comparación con los controles.
P. gingivalis
resultados infección en un aumento de la resorción ósea osteoclástica y un aumento compensatoria en la formación ósea osteoblástica
Para evaluar la forma de acoplamiento de osteoblastos /osteoclastos se vio afectada por P. gingivalis
, el análisis de histomorfometría ósea se llevó a cabo en las muestras maxilar. La infección bacteriana causó una disminución en el número de osteoblastos (Figura 4A, D, y E), un aumento del número de osteoclastos (Figura 4B, D, y E) y la resorción ósea alveolar elevada (Figura 4F). la formación de hueso inesperado, osteoblástica fue estimulado por P. gingivalis
, como se demuestra por MS significativamente mayores /BS% (por ciento de la superficie de mineralización de superficie ósea total medida, Figura 4C y F), MAR (tasa de aposición mineral, Figura 4C y G), y BFR /BS (tasa de formación de hueso, la Figura 4C y G) en el grupo infectado en comparación con los controles. Figura 4 P. gingivalis infección resulta en aumento de la resorción ósea osteoclástica y el aumento de la formación ósea osteoblástica como se muestra por análisis histomorfométrico del hueso. histomorfometría ósea se realiza cuatro semanas después de un total de ocho inoculaciones bacterianas. A. toluidina tinción con azul de osteoblastos. Las flechas indican los osteoblastos en contacto con la superficie del hueso alveolar. B. tinción TRAP de los osteoclastos, que son células multinucleadas teñidas de rojo. C. calceína etiquetado doblar para mostrar el hueso recién formado. El área entre las líneas dobles de color verde brillante es donde se forma el nuevo hueso. D-G, los datos histomorfometría ósea cuantificados. Una disminución significativa del número de osteoblastos (D y E), aumento del número de osteoclastos (D y E), y se observó un aumento de la resorción ósea osteoclástica (F) en los animales infectados. Sorprendentemente, la formación ósea osteoblástica se elevó en gran medida en los osteoblastos restantes (F y G). Abreviaturas: CT, el control, el tratamiento simulado infectados; PG, P. gingivalis
infectado; B, hueso alveolar; R, raíz; PDL, ligamento periodontal; Ob.S% /BS, superficie ósea ciento alinea con los osteoblastos; Oc.S% /BS, superficie ósea cubierta por ciento con los osteoclastos; N.Ob /B. Pm, el número de osteoblastos por el perímetro del hueso; N. Oc /B. Pm, el número de osteoclastos por el perímetro del hueso; MS /BS%, de la superficie de mineralización por ciento de la superficie ósea total medido; ES% /BS, superficie ciento erosión ósea por los osteoclastos; MAR, tasa de aposición mineral; BFR /BS, la tasa de formación de hueso; *, Denota P & lt; 0,05 en comparación con los controles. Barra de escala = 20 micras.
Discusión En este estudio, se investigó la invasión del periodonto por P. gingivalis
y cómo la infección bacteriana influencias dinámicas hueso alveolar, utilizando un modelo de ratón periodontitis. Los modelos murinos se han utilizado ampliamente para explorar la patogénesis de las enfermedades periodontales y desarrollar modalidades de tratamiento, debido a la anatomía periodontal y la histopatología de las lesiones periodontales en ratones son similares a los encontrados en los seres humanos [26]. Además, bajo coste, facilidad de manejo, la genética conocidos, un sistema inmune bien definido, y microflora oral controlables favorecen murino sobre otras especies de animales en los estudios periodontales [27, 28]. Diferentes métodos han sido presentados en la literatura para la entrega de los patógenos periodontales a la cavidad oral de los animales de experimentación, como con la dieta, la ligadura bacterias empapado, sonda, o la aplicación directa de la suspensión bacteriana a la encía [18, 21, 26, 29, 30 ]. Para lograr una infección específica del sitio y evitar el daño gingival de ligadura, suspendimos vivo P. gingivalis
en solución ligeramente viscosa (carboximetilcelulosa al 2% en PBS) y se aplica directamente sobre el margen gingival de los molares superiores ratón.
nuestro modelo de ratón de la periodontitis es una simulación muy simplificada de la periodontitis clínicos observados en la población de pacientes. Utilizamos individuales P. gingivalis
infección sobre todo para ver si pueden invadir periodonto in vivo y causar la pérdida de hueso periodontal. Desde surco gingival humano es un habitante de la microflora altamente diversificadas orales [31], otros estudios con periodontitis polimicrobiana modelos animales proporcionarían información adicional sobre el mecanismo patogénico de la enfermedad periodontal.
Estudios in vitro han demostrado que P. gingivalis
puede infiltrarse humano transformado y las células epiteliales gingivales primarias, así como de bolsillo de múltiples capas de células epiteliales [32-35]. Utilizando un modelo de mucosa oral humana por ingeniería compuesta de células normales humanas epiteliales y fibroblastos y un modelo de membrana basal reconstituida (Matrigel), P. gingivalis
se ha demostrado para infiltrarse en las células epiteliales de varias capas, migrar a través de la membrana basal, y llegar a la subyacente tejido conectivo [36]. Estudios in vivo han demostrado la invasión de crevicular humano y las células epiteliales bucales [37-39], y la invasión de tejidos de muestras de biopsia gingival por P. gingivalis
[40, 41]. Estos resultados sugieren que los patógenos periodontales pueden penetrar en los tejidos periodontales profundas in vivo. Nuestro estudio inmunohistoquímico muestra invasión de las células epiteliales gingivales, fibroblastos, osteoblastos revestimiento de hueso alveolar, y osteocitos incrustados por P. gingivalis
en los sitios infectados 3 días después de múltiples inoculaciones orales. Este es el primer estudio en demostrar que este patógeno periodontal es capaz de invadir los osteoblastos alveolares in vivo. Múltiples factores de virulencia de P. gingivalis
, especialmente fimbrias y gingipains, pueden desempeñar un papel importante en la facilitación de la invasión intracelular y extracelular avería y, en última instancia, la progresión y la expansión de los daños periodontales [4, 42, 43]. Nuestro estudio anterior in vitro demuestra que las fimbrias son esenciales para la invasión inicial de P. gingivalis
en osteoblastos, pero puede no ser tan importante para la persistencia de bacterias dentro de las células de acogida [16].
Para demostrar la colonización /infección inicial de P. gingivalis en la cavidad oral
ratón, se realizó un estudio de inmunohistoquímica a corto plazo para evaluar la invasión de las células periodontales por P. gingivalis
tres días después de tres veces de inoculaciones bacterianas. Esta primera fase fue elegido porque queríamos demostrar que la presencia de P. gingivalis
en el interior de las células periodontales se debió principalmente a la invasión en lugar de la multiplicación intracelular de la bacteria. La tinción inmunohistoquímica demostró la entrada de P. gingivalis
en diferentes células periodontales. Sin embargo, dentro de este período de tiempo breve, no se observó la migración apical del epitelio apreciable de la formación y el bolsillo de unión. pérdida de hueso alveolar aparente no se detectó hasta mucho más tarde, que fue de 4 semanas después de un total de 8 inoculaciones. No hay signos evidentes histológicas de la inflamación, tales como la infiltración de inflamatoria (leucocitos polimorfonucleares, linfocitos) células en el tejido conectivo, se demostró en nuestro estudio de inmunohistoquímica fase temprana. Esto probablemente se debió a la escasa capacidad intrínseca de P. gingivalis
para estimular el sistema inmune /respuesta inflamatoria de acogida [44-47]. extractos de la pared celular y los componentes celulares purificadas de P. gingivalis
tienen comparativamente débil actividad inmunoestimulante de acogida [44-47]. P. gingivalis
pueden inhibir activamente la secreción de neutrófilos quimioatrayente de interleucina (IL) -8, IL-1β, IL-18 y [48, 49]. Tal vez, la supresión de la innata del huésped inmune & amp; respuestas inflamatorias por P. gingivalis
podrían facilitar el mantenimiento del estado crónico de la infección durante las enfermedades periodontales. Las bacterias distintas de P. gingivalis
en la flora oral polimicrobianas parecen ser capaces de mediar anfitrión muy robusto inmune & amp; respuestas inflamatorias [30, 49]. Nuestros resultados demuestran que la invasión directa de P. gingivalis
en osteoblastos suprimen la piscina de osteoblastos e interrumpieron los osteoblastos hemostasia /osteoclastos que resulta en una pérdida neta de hueso. Sin embargo, la destrucción del hueso alveolar debido a la acogida respuesta inflamatoria frente a P. gingivalis
no se puede descartar.
P. gingivalis
invasión de las células periodontales se demostró tinción marrón intracelular como específicos para las bacterias, que estaba ausente en los grupos de control. Toluidina tinción azul en secciones de tejido consecutivos confirma que las células con forma de cúbicas en la superficie del hueso alveolar eran verdaderamente osteoblastos (datos no mostrados). Con el poder del microscopio de luz que hemos utilizado para capturar las imágenes, bacteria individual no puede ser resuelto. En cambio, las células con la invasión bacteriana demostraron puntuar o difusa tinción citoplásmica de color marrón. Future estudio de microscopía electrónica de transmisión puede determinar aún más la localización subcelular de las bacterias.
Nuestro estudio micro-CT demuestra redujo significativamente el volumen óseo y mineral densidad alveolar residual en los P. gingivalis
animales infectados en comparación con el simulacro infectadas controles, lo cual es coherente con los informes anteriores [30, 50]. La densidad del hueso alveolar pareció disminuir más en el margen gingival que el resto de la zona en los animales infectados (Figura 3B), probablemente debido a la proximidad de las bacterias y sus factores de virulencia secretados en estas superficies. México La análisis de histomorfometría ósea revelado elevado número de osteoclastos y la resorción ósea osteoclástica en los animales infectados en comparación con los controles, que es similar a otros hallazgos [50]. Curiosamente, para los parámetros de osteoblastos, disminuyó significativamente el número de osteoblastos pero aumentó significativamente la actividad de formación ósea se observó en los animales infectados. Nuestro estudio anterior in vitro demuestra que P. gingivalis
inicialmente pero luego suprime promueve la apoptosis de osteoblastos sobre las inoculaciones repetidas [51]. Teniendo en cuenta la evolución en el tiempo del estudio in vivo, el número de osteoblastos disminución podría ser debido a un aumento de la apoptosis y /o la inhibición de la osteoblastogénesis por las bacterias. En el punto de tiempo examinado, aunque se redujo el número total de los osteoblastos, parecía que una fracción más grande de los osteoblastos residuales se estimuló a poner activamente el hueso en comparación con los controles, posible debido a algunos mecanismos compensatoria en respuesta a la exposición bacteriana. Sin embargo, el aumento de la formación de hueso se ve compensado por el aumento de la resorción ósea, por lo tanto, se observó una pérdida neta de hueso en los animales infectados. Parece ser que la reacción del hueso alveolar a este patógeno periodontal es complicado, y el análisis histomorfométrico más longitudinal del hueso sería útil para desentrañar mejor el mecanismo de la enfermedad.
En términos de lo que son los efectos intracelulares reales de P. gingivalis
en osteoblastos /osteoclastos, nuestro estudio anterior in vitro demuestra que la invasión de P. gingivalis
no afectan a la proliferación de osteoblastos, pero inhibe su diferenciación y mineralización, parcialmente a través de una inhibición de la transcripción regulador diferenciación factores de Cbfa-1 y osterix [15 ]. Otro estudio in vitro encuentra que la unión entre la P. gingivalis
fimbrias y osteoblastos integrinas alph5beta1 resultados en la condensación periferia de la actina y la activación de la vía JNK en los osteoblastos infectados [51]. Nuestro estudio cocultivo de osteoblastos-osteoclastos preliminar demuestra el aumento de RANKL y la disminución de las concentraciones de OPG en P. gingivalis
cocultivos infectadas en comparación con el control, lo que resulta en una ración de RANKL /OPG mucho más alto que puede estimular la osteoclastogénesis y la reabsorción ósea posterior (datos no publicados). Al parecer, se necesitan estudios más exhaustivos para identificar moléculas interactivas huésped-patógeno adicionales (adhesinas, citoquinas, et al.) En la periodontitis, para facilitar el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para prevenir la pérdida ósea periodontal y /o para estimular la regeneración del hueso alveolar.
Conclusiones
en resumen, los datos presentados en este documento demuestran que P. gingivalis
pueden invadir los osteoblastos alveolares, causar una disminución en los osteoblastos, un incremento en los osteoclastos y la resorción ósea y un aumento inesperado en la formación de hueso en el ratones infectados en comparación con los controles. La resorción ósea supera la formación de hueso nuevo, por tanto, los ratones infectados demuestran un volumen alveolar reducida total del hueso y la densidad. Tener una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos de la periodontitis puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias preventivas o terapéuticas contra esta enfermedad refractaria
abreviaciones
P. gingivalis
:.
Porphyromonas gingivalis
UFC:
unidad formadora de colonias
LPS:
lipopolisacáridos
< DFN> RANKL:
activador del receptor del ligando del factor nuclear-kappaB
OPG:
osteoprotegerina
TSBY:
Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
