madre mesenquimales humanas
Resumen Antecedentes
desbridamiento y desinfección del sistema de conductos radiculares es un paso crucial en tratamientos de endodoncia. La eficacia de la irrigación se basa tanto en la acción de lavado mecánico y la capacidad de los irrigantes para disolver el tejido y matar las bacterias. El objetivo del presente estudio es evaluar y comparar la citotoxicidad de QMix ™ conducto radicular solución de irrigación en las células madre mesenquimales de médula ósea humana inmortalizadas (hTERT-MSC-C1) y compararla con la de hipoclorito de sodio (NaOCl).
Métodos
inmortalizado humanos de médula ósea madre mesenquimales (MSC-hTERT) fueron expuestos a QMix ™ y NaOCl. La viabilidad celular se evaluó mediante la 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) y alamarBlue ensayos. La morfología celular se estudió después de dos horas de exposición a QMix ™ y NaOCl. microscopía electrónica de barrido (SEM) los análisis se llevaron a cabo después de periodos de incubación de 2 y 4 horas. Por último, de etidio naranja bromuro /acridina (EB /AO) tinción fluorescente se aplicó a las células en los portaobjetos de 8 cámaras después de que se incubaron con los agentes de prueba durante 2 horas para detectar las células vivas y muertas. Las observaciones se tabularon y se analizaron estadísticamente.
Resultados
QMix ™ exposición dio lugar a un porcentaje significativamente mayor de la viabilidad celular de NaOCl en el MTT y ensayos de alamarBlue en tres puntos de tiempo en comparación con el control. El análisis SEM demostró cambios morfológicos mínimos asociados con las células que fueron expuestas a la solución QMix ™, con poca contracción y fragmentación de la pared celular. El análisis en vivo /muerto mostró que el número de células vivas después de la exposición a QMix ™ fue similar a la del control no tratado. No estructura celular se pudo observar con el grupo de NaOCl, indicando lisis celular.
Conclusión
soluciones Tanto el QMix ™ y NaOCl eran tóxicos para las MSC de médula ósea humana. Cada solución podría haber inducido la muerte celular de una manera diferente como se evidencia en la viabilidad celular, SEM y los estudios fluorescentes. Por consiguiente, la muerte celular inducida por el lento QMix ™ podría ser menos agresivos y más aceptable para los tejidos vivos.
Palabras clave
citotoxicidad hipoclorito de sodio células madre mesenquimales QMix ™ Raíz del canal irrigantes material complementario Electrónico
la versión en línea de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-27) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes Francia el éxito del tratamiento endodóntico depende de la erradicación de microbios del conducto radicular. sistema y la subsiguiente prevención de la reinfección. la irrigación del conducto radicular tiene un papel clave en el éxito del tratamiento endodóntico. Durante y después de la instrumentación, irrigantes facilitar la eliminación de microorganismos, restos de tejido, y las virutas de dentina de la canal de la raíz a través de un mecanismo de descarga [1, 2].
Una solución irrigante canal de la raíz ideal debe ser no tóxico, con un amplio espectro antimicrobiano y la capacidad de disolver tejido pulpar necrótico, endotoxinas de inactivación, y, o bien a prevenir la formación de una capa de barrillo o disolverla [3, 4]. En la actualidad, hay una solución única es capaz de alcanzar estas metas, y el uso combinado, concomitante o secuencial de dos o más soluciones de irrigación por lo tanto se requiere [5]. El hipoclorito de sodio (NaOCl) y digluconato de clorhexidina (CHX) son dos agentes antibacterianos comunes utilizados como irrigantes del conducto radicular [5-7].
Actualmente, el hipoclorito de sodio (NaOCl) (0,5 a 6,15%) y EDTA (15-17% ) son los dos irrigantes intracanal más utilizados [5, 8]. Aunque el hipoclorito de sodio tiene la mayoría de las propiedades deseables, sino que también puede producir citotoxicidad y reacciones inflamatorias severas [9, 10]. ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es eficaz para eliminar el componente inorgánico de la capa de frotis [11].
Sin embargo, debido a resultados no deseados, una combinación de estos irrigantes no es aconsejable [12-15]. Por lo tanto, el uso secuencial de EDTA, CHX y NaOCl ha sido defendida por muchos investigadores para producir resultados óptimos de irrigación del conducto radicular [16-18]. Es imperativo que los irrigantes del conducto radicular no deben obstaculizar el proceso de curación de la región apical. La biocompatibilidad de estos materiales es importante, ya que entran en contacto con los tejidos peri-radiculares.
QMix ™ es una solución de 2-in-1 que contiene un agente antimicrobiano bisbiguanida (2% CHX) y una de quelación de calcio de ácido poliaminocarboxılico agente (17% EDTA) [19]. QMix ™ fue encontrado para ser eficaz en la eliminación de la capa de barrillo y también tiene propiedades antimicrobianas sustanciales [19-22]. Sin embargo, los datos respecto a la citotoxicidad de este agente no están disponibles. Por lo tanto, el presente estudio se realizó para evaluar y comparar la citotoxicidad de la solución de irrigación QMix ™ en las células inmortalizadas de hueso humano madre mesenquimales de médula (hTERT-MSC-C1) mediante ensayos de viabilidad celular, la evaluación de la morfología celular y microscopía de luz de fluorescencia; 5.2% NaOCl se utilizó para la comparación.
Métodos Francia El estudio fue aprobado por la junta de revisión departamental del Colegio de Centro de Investigación de Odontología de la Universidad Rey Saud, Riad.
Soluciones de ensayo
QMix ™ 2-in -1 (Dentsply Tulsa Dental, OK, EE.UU.) y NaOCl al 5,25% (Clorox Co., Oakland, CA, EE.UU.) se utilizaron en este estudio. cultivo de células
células madre mesenquimales de médula ósea humana inmortalizadas (hTERT- MSC-C1), en la 25
º paso, se utilizaron para todos los experimentos en este estudio. El protocolo de Simbula et al. [23] se utilizó en este estudio, con algunas modificaciones. Las células madre mesenquimales de médula ósea humana fueron proporcionados por el profesor Moustapha Kassem en el Hospital Universitario de Odense, Dinamarca [24]. Las células crioconservadas se descongelaron rápidamente, se transfirió a un matraz T-75 (BD Falcon ™, NJ, EE.UU.) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco®), que fue suplementado con glutamina (Gibco®), 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco®), suero bovino fetal al 10% (FBS Gibco®), y aminoácidos no esenciales al 1% (HyClone®), en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2/95% de O 2 en 37 ° C. Al 70% de confluencia, el medio se aspiró, y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. Tres mililitros de pre-calentado se añadió 0,05% de tripsina /EDTA (Gibco®) al matraz, y se incubaron las células durante 1 minuto. Después de golpecitos suaves, el desprendimiento de células se observa bajo un microscopio de luz invertida (Observador A1, Zeiss, Göttingen, Alemania), y después se añadieron 12 ml de medio de cultivo en el matraz para neutralizar el efecto enzimática de la tripsina. Para el recuento celular, se tomaron dos muestras (10 l) de la suspensión celular después de la mezcla apropiada. Las muestras se colocaron en las cámaras superior e inferior de una cámara de recuento Neubauer hemocitómetro (Paul Marienfeld GmbH & amp; Co. KG, Lauda-Königshofen, Alemania), y las células se contaron manualmente bajo un microscopio invertido (10X aumentos). Las células se sembraron en placas diferentes y diapositivas, como veremos a continuación, para cada parte del estudio. Todos los procedimientos se realizaron bajo una clase II campana de flujo laminar (LabGard ES 425 Cabina de seguridad biológica, NuAire®).
Ensayo de viabilidad celular MTT
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (, fondo plano claro, poliestireno TC- tratada microplacas de 96 pocillos) a una concentración de 1 × 10 4 células /pocillo y después se incubaron durante 24 horas para permitir la adherencia de las células al fondo de los pocillos. Los medios de cultivo fueron luego aspirados de cada pocillo y se reemplazaron con 150 l de solución estéril (QMix ™ o NaOCl). Se utilizaron ocho pozos como replica para cada grupo
Cada subgrupo se incubó durante los siguientes períodos:. 2, 4, o 24 horas. A continuación, se añadieron 10 l de reactivo MTT (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EE.UU.) a cada pocillo. A partir de entonces, placas de 96 pocillos se incubaron adicionalmente durante 3 horas a 37 ° C. Por último, se aspiró la solución de cada pocillo, y se añadieron 150 l de agente disolvente para disolver el precipitado de formazán. La absorbancia de cada muestra se midió con un lector de microplacas (Epoch microplacas Espectrofotómetro, BioTek®) a una longitud de onda de 570 nm. Los datos se recogieron mediante Gen5 Software de Análisis de Datos (BioTek®, EE.UU.). El experimento se repitió dos veces para cada grupo en cada intervalo.
Ensayo de alamarBlue (AB) la viabilidad celular
Los mismos grupos que se utilizaron para el ensayo de MTT (mencionado anteriormente) se utilizaron para el ensayo de AB con los mismos intervalos. Los agentes de ensayo se añadieron a cada pocillo. Después de períodos de incubación de 2, 4, y 24 horas, reactivo AB 10% (Serotec®, Oxford, Reino Unido) se añadió a cada pocillo. Después las placas se incubaron adicionalmente durante 4 horas, la fluorescencia de cada pocillo se midió a longitudes de onda de 530/25 y 590/35 nm excitación /emisión usando un lector de fluorescencia (BioTek®). Los datos fueron recogidos usando el software de análisis de datos Gen5 (BioTek®, EE.UU.). El experimento se repitió dos veces para cada grupo en cada intervalo.
Evaluación morfología de la célula
morfología celular se evaluó con SEM después de 2 y 4 horas de exposición a las soluciones de ensayo. En pocas palabras, 8 × 10 4 células /pocillo se sembraron en portaobjetos de cubierta de vidrio (1 × 1,5 cm) en placas de 6 pocillos (CellStar®, Carrollton, TX) durante la noche. El día siguiente, las células se expusieron a las soluciones de ensayo. Dos mililitros de cada solución de irrigación estéril se añadió a los portaobjetos en cada pocillo. las células no tratadas de control se mantuvieron en medio de cultivo. Inmediatamente después se añadieron las soluciones de ensayo, se examinaron las células bajo un LM invertida (aumento de 10x). Al final de los períodos de incubación (2 y 4 horas), se aspiraron las soluciones en cada pocillo. Los portaobjetos se lavaron con PBS y después se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en tampón cacodilato 0,1 M Na (pH 7,2) a temperatura ambiente. A partir de entonces, las muestras se lavaron con tampón cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2).
Después de la fijación, las muestras se trataron con 1% de tetróxido de osmio durante 1 hora. Entonces, se lavaron con agua destilada y se deshidrataron utilizando alcohol etílico graduada, en concentraciones de 50%, 70%, 80%, 90% (5 minutos cada uno), 95% (dos veces, 15 minutos cada uno), y finalmente, 100% alcohol absoluto (dos veces, 30 minutos cada uno). Las muestras se secaron usando un secador de punto crítico con CO 2 (SADRI-PVT-3B). Los portaobjetos se montaron en los trozos de cobre con cinta adhesiva doble y eran entonces el oro bombardeo iónico recubierto con un espesor de 5-7 micras. Las muestras fueron luego observados y fotografiados utilizando un microscopio electrónico de barrido JSM LV-6360.
Dos evaluadores evaluaron las microfotografías. La morfología celular se describe de acuerdo con los siguientes criterios: la forma de la célula (normal o anormal en comparación con el control), el apego a la subsuperficie, la unión a otras células, extensiones de superficie citoplásmica (pústulas o microvellosidades), y la integridad de la pared celular. Redondez de las células, la presencia de ampollas o desprendimiento de las células indica un mayor daño celular [25, 26]. Análisis FODA vivo /muerto
Se seleccionaron dos soluciones para el análisis en vivo /muerto. se utilizó medio de Eagle modificado A (MEM) sin rojo de fenol (Gibco®, Gaithersburg, MD) para este experimento. Brevemente, las células fueron sembradas en tres portaobjetos de 8 cámaras (Lab-Tek®) a una concentración de 1,5 × 10 4 células /pocillo y se incubaron a continuación durante 24 horas para permitir la adhesión celular que se produzca. El medio de cultivo en cada pocillo se reemplazó con 300 l de cada solución y después se incubó durante 2 horas. Finalmente, se añadieron 10 l de colorante fluorescente EB /AO a cada cámara, y la fluorescencia de las células se analizaron con un microscopio fluorescente invertido (ECLIPSE Ti, Nikon, Tokio, Japón), con un aumento de 10X. Las imágenes fueron capturadas con el software de imagen (NIS-Elements, Nikon, Tokio, Japón). El colorante fluorescente EB /AO se preparó mezclando naranja de acridina 15 mg con 50 mg de bromuro de etidio en polvo que se disolvió primero en 1 ml 95% de etanol y después se diluyó en 49 ml de agua destilada (dH 2O).
las imágenes fueron evaluados por dos evaluadores de acuerdo con criterios previamente descritos. Bajo el filtro verde, un núcleo verde intacto, que es comparable con el control, indica una célula viable, mientras que un núcleo fragmentado verde indica apoptosis temprana. Un núcleo rojo indica una ruptura de la pared celular, mientras que un núcleo intacto rojo indica necrosis, y un núcleo rojo fragmentada indica apoptosis tarde bajo el filtro rojo [27, 28].
Datos y análisis estadístico
Los resultados del MTT y los ensayos de alamarBlue se calcularon como porcentajes relativos al control (100% = sin toxicidad). Los datos fueron analizados con el programa SPSS versión 21.0 PC + software estadístico. La estadística descriptiva (media y desviación estándar) fueron utilizados para describir las variables de resultado continuas. t de Student
-test para muestras independientes se utilizó para comparar los valores medios de los dos grupos. Un análisis de varianza de una sola vía, seguido por una prueba de comparación múltiple de Tukey, se utilizó para comparar los valores medios de los tres grupos. Un valor de p & lt; = 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
ensayo MTT Francia El ensayo MTT se llevó a cabo en tres grupos (el grupo QMix ™, NaOCl grupo, y el grupo control) con hTERT-MSC cultivadas en placas de 96 pocillos . Cada grupo se incubó durante 2, 4 y 24 horas. La viabilidad de las células para cada grupo se presenta como porcentaje del grupo de control en cada punto de tiempo. El porcentaje de viabilidad celular de cada solución se ilustra en la figura 1. Cuando las células se expusieron a soluciones de 2, 4 y 24 horas, la viabilidad celular disminuyó con el tiempo. La viabilidad de las células expuestas NaOCl fue significativamente menor que el de las células expuestas a QMix ™ en todos los intervalos de tiempo (P & lt; 0,05). Figura 1 El porcentaje de viabilidad celular de soluciones de NaOCl y QMix a los 2, 4 y 24 horas después de la exposición usando el ensayo de MTT.
ensayo alamarBlue Francia El ensayo se llevó a cabo AB para los grupos usando cultivaron hTERT-MSC en placas de 96 pocillos QMix ™, NaOCl y Control. La viabilidad de las células para cada grupo se presenta como el porcentaje del grupo de control. El porcentaje de viabilidad de células de cada solución se ilustra en la Figura 2. Cuando las células se incubaron durante 2 o 4 h, la viabilidad de las células del grupo de NaOCl fue significativamente menor que la del grupo QMix ™ (P & lt; 0,05). Figura 2 La viabilidad celular de soluciones tanto NaOCl y QMix ™ usando el ensayo de alamarBlue a los 2, 4 y 24 horas de exposición. La morfología celular
células de control negativos sin tratar mostraron formas variables, incluyendo romboidal, triangular, formas ovales y de cabezal, como se ilustra por LM microscopía de luz (figura 3) Las células se une entre sí y al sustrato. La pared celular aparecía lisa e intacta, con algunas extensiones microvellosidades y de superficie. Según la investigación LM, el efecto tóxico de las soluciones de ensayo fue evidente inmediatamente después de su aplicación a las MSC de médula ósea humana cultivadas, y la morfología normal de las células se alteró de forma diferente en cada grupo (Figura 3). Una alta concentración (0,5 mg /ml) de NaOCl causó la vacuolización del citoplasma (Figura 3B), mientras que QMix ™ a la misma concentración produjo pocas alteraciones en la pared celular y no vacuolización (Figura 3C). Figura 3 médula ósea hTERT-MSC humanas bajo LM invertida después de la adición de los agentes de ensayo (X10). Las células no tratadas A-, B - Las células expuestas a (0,5) solución Qmix ™ (la forma de la célula se mantuvo con pocas modificaciones), las células expuestas a la C- (0,5) NaOCl; vacuolización fue evidente en el citoplasma.
Según el análisis SEM, el número de células disminuyó en relación con el control después de una exposición de 2 horas a 0,5 mg /ml NaOCl. Las células restantes eran más pequeños, con una forma filiforme o redonda (Figura 4). Las células se habían desprendido del subsuelo, y se perdieron los archivos adjuntos de célula a célula. Se observaron secreciones lisosomales que salen de la célula, y el núcleo se extruyó a través de la pared celular roto. La Figura 4 de la médula ósea de hTERT-MSC humanas expuestas durante 2 horas a QMix y NaOCl. A - QMix ™ (x100), B - QMix ™ (x1000), C - NaOCl (x100, tenga en cuenta la ronda o filiforme forma de las células remanentes), D- NaOCl (x1000, la pared celular roto y el núcleo extruido ).
Después de una exposición de 2 horas a QMix ™, el número de células y forma de la célula fueron similares a los del control, a excepción de la presencia de un esquema de celda mal definida. Sin embargo, las células todavía estaban unidos a las células adyacentes y al sustrato (Figura 4). En algunas áreas, se observaron restos de procesos celulares. El principal cambio dramático en la morfología de las células era en la pared celular, que tenía una apariencia similar a una malla (Figura 4B), lo que indica la desintegración. Después de 4 horas, la alteración de la morfología celular fue más significativa: la apariencia similar a una malla de las células se hizo más intensa, con una forma mal definida y un esquema de la decoloración, y se observaron rotos archivos adjuntos de célula a célula. Sin embargo, la unión al sustrato se mantuvo por algunas células (Figura 5). Figura 5 de la médula ósea hTERT-MSC humanas se expusieron durante 4 horas a QMix ™ y NaOCl. A- QMix ™ (x100), B-QMix ™ (x1000), C - NaOCl (x100), D- NaOCl (x1000): perfil del análisis en vivo /muerto con EB /AO tinción
cultivadas de hTERT de la médula ósea humana. -MSCs fueron expuestos a 0,5 mg /ml de QMix ™ y NaOCl durante 2 horas. La mancha EB /AO se aplicó a las células, que fueron examinados bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Las imágenes de cada grupo se muestran en las células vivas y muertas células verdes en rojo. Las células no tratadas tenían, núcleos bien definidos intactas, que eran verde bajo el filtro verde, como se muestra en la Figura 6A. Bajo el filtro rojo, sólo la superficie celular mostró fluorescencia roja, y no el núcleo, lo que indica una pared celular intacta (Figura 6B). Cuando las células se expusieron a QMix ™, el número de células fue similar a la del grupo de control, y los núcleos eran verdes, que era similar a la apariencia de las células de control. La única diferencia era que algunas de estas células tenían la cromatina condensada, la cual fue evidente en el marco del filtro rojo (Figura 6 C, D). Cuando las células se expusieron a NaOCl, no hay estructuras celulares, tales como el núcleo o membrana de la célula, se observaron; lisis de células era evidente, y el material remanente fue positivo tanto para verde y rojo de fluorescencia (Figura 6E, F). Figura 6 /análisis muertos médula ósea humana hTERT-MSC vivir bajo un microscopio de fluorescencia (X10). 6A, 6B - Las células no tratadas con el filtro verde, el núcleo parece intacto, lo que indica una célula viable. 6B-con el filtro rojo, el núcleo apareció oscura, y sólo la superficie externa de las células era de color rojo, lo que indica que la pared celular está intacta. 6C, 6D- tratados con QMix ™ bajo un microscopio de fluorescencia (X10), 6E, 6F- tratada con NaOCl bajo un microscopio de fluorescencia (X10).
Discusión
in vitro
estudio se realizó para evaluar la la citotoxicidad de la solución de irrigación QMix ™ en las MSC de médula ósea humana. MSCs se han sugerido como un buen modelo para ensayos toxicológicos [29]. Las MSCs que se utilizaron en este estudio fueron inmortalizados por la expresión ectópica de la telomerasa humana de la transcriptasa (h-de TERT), lo que aumentó la duración de la vida de las células [24] y se mantiene sus propiedades madre-como [30] inversa. Estudios anteriores han informado de que las células inmortalizadas se pueden utilizar como un modelo de prueba para materiales dentales [31].
Las observaciones del estudio mostraron que ambas soluciones (QMix ™ y NaOCl) son tóxicos para las MSC de médula ósea humana y causan daño celular . Esto es consistente con los resultados de estudios anteriores que informaron sobre la toxicidad NaOCl [23, 32, 33]. toxicidad NaOCl se puede atribuir a su alto pH (acción de iones hidroxilo), que interfiere con la integridad de la membrana citoplasmática [34]. Además, nuestros resultados están de acuerdo con los de un anterior in vivo
estudio, que encontró que QMix ™ es tóxica y puede inducir una respuesta inflamatoria [35]. CHX es un agente tóxico que se une a la membrana plasmática de la célula y aumenta su permeabilidad, lo que permite la fuga de enzimas lisosomales [36]. EDTA, que es el segundo componente QMix ™, también se sabe que es citotóxico, tal vez debido a su efecto quelante y la caída acentuado en el pH que causa [11].
La viabilidad celular se redujo significativamente cuando las células fueron expuestas a NaOCl para todos los períodos de tiempo examinado. La viabilidad celular se redujo significativamente después de ser expuesto a la solución QMix ™ para 2 o 4 horas. Por otra parte, después de 24 horas, la viabilidad celular se redujo significativamente en comparación con las 2 y 4 horas de exposición. Estos resultados muestran que el efecto tóxico de un agente aumenta gradualmente con el tiempo. Esta observación está de acuerdo con los de estudios anteriores, lo que confirma que la toxicidad es dependiente del tiempo [37]. Por el contrario, los resultados del ensayo MTT demostraron una disminución significativa en la viabilidad celular de las células que fueron expuestos a NaOCl en todos los períodos de tiempo examinados. En comparación con las células ™ -exposed QMix, NaOCl disminución de la viabilidad a las 2 y 4 horas.
Estudios previos han informado que el ensayo de AB es ligeramente más sensible que el ensayo de MTT. Sin embargo, ambos ensayos se basan en el metabolismo enzimático, que pueden ser inhibidos o inducida por el agente de prueba, produciendo de este modo un resultado de falso positivo o falso negativo. Por lo tanto, siempre se recomienda una cuidadosa interpretación de los resultados [38]. Nuestras observaciones sugieren que el ensayo de AB es una mejor elección para las pruebas de viabilidad de la célula, ya que es fácil de realizar, más consistente que el ensayo de MTT, y recomendado por los estudios anteriores [38, 39]. Sin embargo, siempre se recomienda utilizar más de un ensayo para evaluar la citotoxicidad. Por lo tanto, los estudios anteriores que se basaban exclusivamente en el ensayo MTT se deben volver a evaluar e interpretar con precaución.
Investigaciones morfológicas microscópicas son necesarios para confirmar la toxicidad celular [40]. Esto se debe a una célula puede sufrir cambios tóxicos, tales como desprendimiento, mientras que todavía continua para metabolizar MTT a formazán, que resulta en una estimación sobre la viabilidad celular en el ensayo de MTT en comparación con el ensayo de AB [38]. Por lo tanto, las características morfológicas celulares fueron investigados para ambas soluciones.
Las células que fueron expuestos a QMix ™ muestran un menor número de alteraciones morfológicas. Esta observación está de acuerdo con Faria et al., Que informaron de que las concentraciones más altas de CHX preservarían la forma de las células L929 [41] debido a su efecto de fijación de células [42].
Las imágenes de SEM para el grupo QMix ™ mostraron contracción citoplasmática con paredes celulares parcialmente fragmentadas pero intactas. Estas características son típicas de la apoptosis, como se informó anteriormente [40]. Además, la tinción EB /AO mostró brillantes núcleos fragmentados verde, indicando apoptosis temprana [27]. Las células expuestas a NaOCl tenían contracción citoplasmática o ruptura de membranas, que son características típicas de necrosis [43]. La tinción EB /AO del grupo NaOCl representada rojo y verde, lo que refleja el material remanente que pueden ser el resultado de la lisis celular, y no la estructura celular se pudo observar. El análisis global de estos resultados sugiere que las células en los grupos QMix ™ están en las primeras etapas de la apoptosis, pero aún no están muertas, en contraste con el grupo de NaOCl. Tanto NaOCl y QMix ™ son citotóxicos; sin embargo, parece que su modo de muerte celular difiere como resultado de sus diferentes composiciones. Según Galluzzi et al. [44], la muerte celular se pueden clasificar en cuatro tipos diferentes en función de las características morfológicas de las células que mueren: la apoptosis (Tipo 1), la autofagia (tipo 2), necrosis (oncosis, Tipo 3), y la catástrofe mitótica. Cada modo de la muerte celular tiene su propia función; necrosis induce una respuesta inflamatoria cuando se necesita, mientras que las células apoptóticas in vivo
son fagocitados rápidamente sin inducir una respuesta inflamatoria, que se considera un mecanismo para evitar la activación inmune. De acuerdo con nuestros resultados, este modo de muerte celular podría estar asociada con una exposición alta concentración de NaOCl.
La apoptosis es una forma activa de muerte celular conocida como muerte celular programada, y se caracteriza por la retracción celular y la condensación de la cromatina nuclear seguido por la fragmentación nuclear, con el aspecto morfológico normal de orgánulos citoplásmicos y el mantenimiento de una membrana plasmática intacta [44]. De acuerdo con nuestros resultados, este modo de la muerte celular podría estar asociada con la exposición QMix ™. Sin embargo marcadores adicionales tales como la detección de las caspasas, los sustratos escindidos, reguladores e inhibidores son necesarios para fundamentar este modo de muerte celular especuló con QMix ™ [45]. La muerte celular por apoptosis se sabe que ocurre a través de dos vías principales: una vía extrínseca que implica los receptores de muerte, y una vía intrínseca que es modulada por los miembros de la familia Bcl-2 [46], que consta de componentes de la membrana mitocondrial exterior [47] . Por lo tanto, las mitocondrias se consideran orgánulos clave en las vías de la muerte celular, además de su actividad metabólica normal [48, 49]. Sin embargo, estas proteínas pueden funcionar también en algunas vías metabólicas normales. Por lo tanto, las investigaciones actividad metabólica mitocondrial, tales como el ensayo de MTT, deben tener en cuenta estos posibles solapamientos entre la actividad de células pre-apoptótica y el metabolismo normal de las células [40]. Esta superposición podría explicar los resultados contradictorios de los ensayos AB y MTT.
In vitro de citotoxicidad
investigaciones informado de que CHX tenía una mayor toxicidad en cultivos de células de NaOCl [33, 41]. Sin embargo, in vivo
estudios sugieren que CHX o QMix ™ es menos agresivo que el NaOCl [35, 50]. Esta diferencia podría atribuirse a la sede de los mecanismos de defensa que operan en el entorno in vivo
Nuestro estudio in vitro
en cuenta las siguientes limitaciones:. Que se llevó a cabo en células cultivadas, y los resultados representan solamente la respuesta de estas células de forma aislada, sin tener en cuenta el mecanismo de defensa del huésped para la desintoxicación. Además, en un entorno clínico, las soluciones siempre se entregan a los canales radiculares, que están rodeados por la dentina, y luego se extruyen a la zona periapical. Estudios previos han informado que el efecto citotóxico de irrigantes puede ser neutralizado por la dentina [33, 51]. Colocamos las soluciones directamente sobre las células, y no se hicieron intentos para entregar estas soluciones a través de los conductos radiculares para imitar el escenario clínico.
Conclusiones
Dentro de las limitaciones de este estudio, se puede concluir que tanto el NaOCl y soluciones QMix ™ son tóxicos para las MSC de médula ósea humana. La solución QMix ™, que induce la muerte celular lenta, parece ser más biocompatible que la solución de NaOCl. archivos originales presentados, por lo tanto, sobre la base de estas observaciones, se puede concluir que el QMix ™ es una solución de irrigación del conducto radicular relativamente seguro en comparación con NaOCl.
Declaraciones
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autores de las contribuciones
AK, SMA, AM y MAE llevaron a cabo el estudio, los procedimientos de laboratorio y evaluación de los resultados. SA, AK y AMA involucrado en el desarrollo del concepto, diseño del estudio, la revisión del manuscrito y el análisis estadístico. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
