Resumen Antecedentes
superficies mucosas están recubiertos con capas de gel de moco que protegen los tejidos subyacentes y promueven la colonización por parte de los miembros de la microflora comensal. Lactobacillus fermentum
es un habitante común de la cavidad oral, gastrointestinal y tractos reproductivos y es uno de los más importantes de bacterias del ácido láctico que contribuyen a la formación de un saludable microflora intestinal. Hemos investigado la actividad proteolítica en L. fermentum
en respuesta a las interacciones con el MUC5B mucina, que es un componente principal de los geles de moco en los sitios colonizados por este microorganismo.
Métodos
Biofilms de Lactobacillus fermentum
se establecieron en células mini-flujo en la presencia o ausencia de saliva humana MUC5B. La actividad proteolítica de las células del biofilm se examinó en un microscopio láser confocal de barrido con un sustrato de proteasa fluorescente. La degradación de MUC5B por L. fermentum
se analizó mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western con antisueros producidos contra el péptido MUC5B. proteínas de superficie celular expresadas differentialy en un entorno rico en MUC5B se identificaron con ayuda de la electroforesis bidimensional comparativo seguida por LC-MS /MS.
Resultados
Lactobacillus fermentum
adhiere bien a las superficies recubiertas con mucina MUC5B y en las biopelículas de L. fermentum
forman en un entorno de MUC5B, la proporción de células proteolíticamente activas (47 ± 0,6% de la población), como se muestra por la escisión de un sustrato de caseína fluorescente, fue significativamente mayor (p & lt; 0,01 ) que en las biopelículas formadas en caldo nutriente (0,4 ± 0,04% de la población). Por lo tanto, la presencia de mucinas MUC5B mejorada actividad de la proteasa bacteriana. Este efecto se debió principalmente al contacto con las mucinas asociadas a la superficie en lugar de los presentes en la fase fluida. Las biopelículas de L. fermentum
eran capaces de degradar MUC5B lo que sugiere que esta glicoproteína compleja puede ser explotado como una fuente de nutrientes por las bacterias.
Comparación de los proteomas de superficie de las células del biofilm de L. fermentum
en una ambiente MUC5B con los de caldo nutriente usando electroforesis bidimensional y espectrometría de masas, mostró que la actividad proteolítica mejorada se asoció con el aumento de expresión de un glicoproteasa; O-
sialoglicoproteína endopeptidasa, así como proteínas chaperonas tales como DnaK y el factor de disparo.
Conclusiones
adhesión a la mucina recubiertos de superficies conduce a un cambio hacia un fenotipo más proteasa activa dentro de L. fermentum
biofilms y proteasas producidas dentro de los biofilms pueden degradar MUC5B. La actividad proteolítica mejorada se asoció con un aumento de O-
endopeptidasa sialoglicoproteína en la superficie celular. Proponemos que la regulación por incremento de proteínas chaperonas en el entorno de mucina puede contribuir al fenotipo proteasa activa a través de la activación de la glicopeptidasa. Esto representaría una forma para que los comensales por ejemplo lactobacilos L. fermentum
para explotar sustratos complejos en su entorno local con el fin de sobrevivir en las superficies mucosas
material complementario Palabras clave
lactobacilos La actividad proteolítica La proteólisis moco glicoproteína Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi.: 10. 1186 /1472-6831-13-43) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes
superficies mucosas del cuerpo están colonizados por un gran número de especies de bacterias comensales que coexisten en una relación mutualista con su huésped humano. Estas comunidades microbianas, o biopelículas, se piensa que constituyen la primera línea de defensa contra la infección por inhibición competitiva de organismos no indígenas que pueden causar enfermedades. En el intestino, se ha propuesto la flora comensal tener una influencia importante en el desarrollo, la inmunidad y la nutrición (para una revisión ver [1-3]). A pesar de su importancia, es sorprendente que poco se sabe acerca de cómo los miembros de estas comunidades sobreviven en el entorno de la mucosa e interactúan unos con otros, y el anfitrión, para formar un ecosistema dinámico. Lactobacillus
representa el grupo más numeroso y diverso entre las bacterias del ácido láctico que habitan en las superficies mucosas en los seres humanos, incluyendo el tracto gastrointestinal [4], el tracto reproductor femenino [5] y la cavidad oral [6]. Los lactobacilos son generalmente vistos como que confiere efectos biológicos beneficiosos para el anfitrión. Por ejemplo, en el tracto gastrointestinal, los lactobacilos promover la estimulación inmunitaria y el refuerzo de defensa de la mucosa [7]. Entre los lactobacilos, Lactobacillus fermentum
es un habitante común del tracto gastrointestinal [8], incluyendo la cavidad oral [9, 10]. En contraste con el papel beneficioso en el intestino, Lactobacilli en la cavidad oral se asocian a menudo con la enfermedad cariosa [6] y Lactobacillus fermentum
frecuencia está aislado de las lesiones de caries de dentina en los niños, lo que implica un papel en el proceso de la caries [11] .
superficies mucosas están protegidos por una capa de gel mucoso derivada de células productoras de mucina en el epitelio subyacentes. geles de moco se componen de glicoproteínas grandes, poliméricos formadores de gel que pertenecen a la familia de proteínas de mucina y de las especies de mucina que comprenden estos geles sobre diferentes superficies de la mucosa puede variar. Por ejemplo, MUC5B es una mucina predominante en la cavidad oral, el tracto reproductivo femenino y las vías respiratorias [12] mientras MUC5AC, MUC6 y MUC2 se encuentran en diferentes sitios a lo largo del tracto gastrointestinal [13]. Las grandes mucinas poliméricas se componen de subunidades unidas por enlaces disulfuro, y dentro de cada subunidad de tramos desnudos alternativa esqueleto de la proteína con regiones altamente glicosiladas que contienen un gran número de cadenas laterales de oligosacáridos [14]. bind Lactobacilli a ambos mucinas gástricos e intestinales [15] y una proteína de unión a la mucina (32-Mmubp), que es un componente del sistema de transportador de ABC, se ha identificado en L. fermentum
[16]. Las interacciones con mucinas más probable permiten lactobacilos para ser retenido dentro de la capa de moco en los que contribuyen a la formación de biopelículas de especies múltiples.
En la actualidad, los mecanismos que regulan la supervivencia y el crecimiento de los lactobacilos en las superficies mucosas son en gran parte sin resolver. Sin embargo, ya que las bacterias del ácido láctico sólo son capaces de asumir péptidos cortos a través de los sistemas de transporte, que son específicos para los oligopéptidos (OPP) y di-tripéptidos (DTPT) [17], el crecimiento y la supervivencia en los biofilms en entornos de moco muy probablemente dependerá de la capacidad de las bacterias para degradar sustratos complejos tales como mucinas. La capacidad de las bacterias para utilizar mucinas como su fuente de nutrientes única ha sido demostrada para Akkermansia muciniphilia
que se aisló de una muestra fecal de un adulto sano [18]. estudios Bioinformática revelan que el genoma de L. fermentum
cepa 28-3-CHN codifica al menos 10 proteasas. De estos, varios se prevé que ser extracelular y por lo tanto tienen el potencial de desempeñar un papel en la generación de los nutrientes de mucinas en las superficies mucosas. En el presente estudio investigamos cómo la actividad proteolítica en las biopelículas de L. fermentum
se relacionan con el medio ambiente que rodea a las bacterias; un entorno de mucina-rico o medio de caldo nutriente rico en proteínas, así como si grandes mucinas formadoras de gel pueden ser degradados por L. fermentum
como una fuente potencial de nutrientes. Además, se examinaron los cambios en la expresión de la proteína de la superficie celular asociado con el aumento de la actividad proteolítica.
Métodos Cepa bacteriana
el fin de investigar las interacciones que ocurren de forma natural entre MUC5B y Lactobacillus fermentum,
una clínica cepa conocida para ser capaces de sobrevivir y crecer en un ambiente rico en moco se aisló de la placa dental. La cepa, que se originó a partir de la placa supragingival proximal de un adulto de 30 años de edad, España fue identificado por el crecimiento selectivo en Rogosa medianas y fermentación pruebas utilizando el sistema API CHL-50 (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia ). Identificación como L. fermentum
se confirmó por secuenciación de los pheS
gen [19]. Las bacterias fueron almacenadas a -80 ° Cy subcultivaron dos veces en agar sangre en una atmósfera de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C durante 48 horas antes de su uso.
Aislamiento de la saliva humana MUC5B
Humano salival mucina MUC5B se aisló como se describe anteriormente [20]. Whole saliva se recogió en hielo a partir de ocho voluntarios, se juntaron y luego se mezcla con un volumen igual de 0,2 M NaCl y se agitó durante la noche a 4 ° C. Después de la centrifugación suave (4400 g durante 30 min a 4 ° C), el sobrenadante se sometió a centrifugación en gradiente de densidad isopícnica en CsCl /0,1 M NaCl (Beckman Optima LE-80 K, rotor 50.2Ti, 36.000 rpm, 96 h, 15 ° C, se inicia densidad de 1,45 g /ml; Beckman, se recogieron Fullerton, CA, EE.UU.) y 22 fracciones. Las fracciones que contienen MUC5B-se agruparon, se dializaron contra PBS (0,15 M NaCl, 5 mM NaH 2 PO 4, pH 7) y se almacena a -20 ° C hasta su uso. Para determinar la concentración de MUC5B, se combinaron alícuotas de las fracciones MUC5B que contienen, se dializaron frente a agua, se liofilizaron, y se pesaron (0,3 mg ml -1). La piscina de MUC5B se sometió a electroforesis de dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), para examinar si las proteínas de bajo peso molecular asociados con la red de gel contaminada la preparación.
La formación de biopelículas
L. fermentum
colonias de agar sangre se suspendieron en caldo nutritivo [caldo Todd-Hewitt (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.)] o en una solución MUC5B en PBS para dar DO 600 valores de 0,4 ± 0,01 (que corresponde a aproximadamente 1 × 10 6 células ml -1). Las biopelículas se establecieron en los teléfonos mini-flujo ibidi mu-slides (Integrated Bio Diagnostics, Martinsried, Alemania) mediante la inoculación de 120 l de la suspensión en los canales e incubando en humidificado 5% de CO 2 en el aire a 37 ° C durante 24 horas. Los canales se aclararon con PBS para eliminar las células no adherentes. En algunos casos, los portaobjetos se pre-acondicionado con 100 l de MUC5B + 10 l mM CaCl 10 2 durante la noche en humidificado 5% de CO 2 en el aire a 37 ° C para obtener un revestimiento MUC5B. Los portaobjetos se enjuagaron con PBS antes de la formación de biopelículas. La formación de biopelículas fue confirmada por tinción con el ™ VIVO BacLight /kit de DEAD (Molecular Probes Inc., Oregón, EE.UU.) y la visualización usando una Nikon Eclipse TE2000 microscopio invertido láser confocal de barrido (CSLM).
La actividad proteolítica
Para investigar la actividad proteolítica de las células planctónicas, L. fermentum
células fueron examinados con el kit de ensayo de proteasa fluorescente QuantiCleave ™ (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las células se incubaron durante 1 hora a 37 ° C con el FITC etiquetados sustrato de caseína a una concentración de 10 mg ml -1 en Tris 25 mM con NaCl 150 mM y se ajustó a pH 7,2. Las alícuotas se introducen después en-celda de flujo de mini-ibidi mu diapositivas y de contraste con el rojo SYTO62® colorante fluorescente de ADN-tinción (Molecular Probes Inc., Oregón, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para las células del biofilm, el sustrato fluorescente y contratinción se introdujeron directamente en las células mini-flujo en el que los biofilms fueron creciendo. Las células fueron visualizadas usando CSLM y 20 imágenes al azar de cada diapositiva biofilm fueron capturados utilizando una estación motorizado conectado al software Nikon del microscopio. Cada imagen contiene más de 1000 células bacterianas y la proporción de glóbulos rojos y verdes para cada diapositiva de biopelículas, que corresponde a aproximadamente 20.000 células, se analizaron mediante el paquete de software bio
Image_L [22]. Los experimentos se repitieron tres veces y se calculó el valor de porcentaje medio de células proteolíticamente activos. Los resultados fueron luego analizados mediante la prueba de Mann-Whitney U
valores de prueba y de p de menos del 5% se consideraron como significativos.
Análisis de la degradación de MUC5B por L. fermentum
biopelículas
Mini Flow cámaras fueron pre-condicionados con células MUC5B y L. fermentum
luego inoculadas en caldo nutritivo. Después de 24 horas, se retiró el medio y MUC5B suspendidas en PBS se añadieron a la biopelícula durante 24 horas adicionales. Después de este tiempo, el fluido en la celda de flujo se recogió con una pipeta y se centrifugó para eliminar las células bacterianas (10.000 g, 5 min, 4 ° C). El sobrenadante que contiene mucina, así como un control (MUC5B incubaron durante 24 horas a 37 ° C, pero no expuestos a L. fermentum
) se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones de desnaturalización seguido por transferencia Western. Las muestras (15 l del sobrenadante) se mezclaron con 5 l de tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se ejecutan en NuPAGE 4-12% geles Bis (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 180 V durante 1 hora. Los geles se-borrados electro a membranas de PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, EE.UU.) durante la noche utilizando una transferencia de células Mini Trans-Blot electroforética (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y las membranas luego se bloquearon con 5% (w /v) de leche en polvo en TBST (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, 0,05% de Tween 20) durante 1 hora. MUC5B se detectaron usando un antisuero (LUM5B-14), contra un péptido sintético con la CRAENYPEVSIDQVGQVL secuencia presente en el tercer dominio Cys del péptido MUC5B, diluido 1: 1000 en 5% de BSA /TBST. Las membranas se incubaron entonces (1 hora) con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dako, p0448, Glostrup, Dinamarca) diluido 1: 2500 en 5% de leche descremada /TBST, y las bandas se visualizaron utilizando la detección ECL Western kit (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
2DE, LC-MS /MS y transferencia Western de las proteínas de la superficie celular comentario El fase en masa que rodea las células del biofilm crecen en un MUC5B- o un entorno de nutrientes Hermano, fue eliminado con una pipeta de las células de flujo y se reemplaza con 50 l de tampón de extracción que consiste en 5 M de urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% sulfobetaína caprililo, 2 mM de tributilo fosfina, 0,5-2% IPG y Tris 40 mM base de ajustar a pH 9,5. Con el fin de solubilizar las proteínas de superficie de las células del biofilm restantes, las células de flujo se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente y el tampón de extracción luego se retira y se centrifuga durante 10 minutos (6000 g
). Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes resultantes se determinaron utilizando un kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK). Los sobrenadantes se diluyeron con tampón de rehidratación que contiene 8 M urea, 2% CHAPS, DTT 10 mM, 2% de inmobilina (IPG) tampón (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) para dar una concentración final de proteína de 20 g en 200 l. Estas muestras se colocaron en la re-hinchazón cassettes con 11 cm tiras IPG, rango de pH 4-7, en la parte superior y la rehidratación se llevó a cabo bajo aceite a temperatura ambiente durante 30 horas. El enfoque isoeléctrico se llevó a cabo esencialmente como se describe por Davies et al.
[23], utilizando el Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), durante 85 horas, 500 voltios. Las tiras se equilibraron y luego incorporados en la parte superior del 14% geles de poliacrilamida. SDS-PAGE se realizó a una corriente constante de 15 mA /gel, 10 ° C, durante la noche en una celda xi Protean II (Bio-Rad, Hercules, CA) con los estándares de peso molecular de gama alta del arco iris (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) en el lado ácido de las tiras IPG. Los geles se tiñeron con plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante o coloidal Coomassie Brilliant Blue G para la identificación de proteínas. Los geles fueron analizados utilizando el software Delta2D (Decodon GmbH, Greifswald, Alemania). Después de la identificación de los límites del punto, se determinaron los valores de densidad óptica integrada (IOD) y se expresaron como un porcentaje de la intensidad total por gel. Spots que muestran más de una diferencia de tres veces fueron cortadas de los geles teñidos con Coomassie, se sometió a digestión tríptica en gel y se analizaron por LC-MS /MS como se describe [23]. Para la detección de O-
endopeptidasa sialoglicoproteína, geles 2DE fueron electro-transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, EE.UU.) durante la noche utilizando una célula de transferencia Mini Trans-Blot electroforética (Bio-Rad , Hercules, CA, EE.UU.) y las membranas a continuación se bloquearon con 5% (w /v) de leche en polvo en TBST (Tris 20, NaCl 137 mM, 0,05% de Tween 20) durante 1 hora. La proteína se detectó utilizando un antisuero policlonal MOB-LFGE-2 generado contra un péptido sintético con la secuencia (CDAAGEAYDKVGRV) (Innovagen AB, Lund, Suecia), diluido 1: 1000 en 5% de BSA /TBST. Las membranas se incubaron entonces (1 hora) con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante y las bandas se visualizaron usando el kit de detección ECL Western como se describe anteriormente.
Resultados
Comparación de la actividad proteolítica en células planctónicas y biofilm de L. fermentum
para investigar el efecto de MUC5B sobre la actividad proteolítica en células planctónicas de L. fermentum
, las células fueron expuestas a MUC5B en la fase fluida. caldo de nutrientes se utilizó como control. La proporción de células proteolíticamente activas se evaluó utilizando CLSM después de la incubación con FITC-caseína. Esto reveló ninguna diferencia entre la proporción de células proteolíticamente activas en caldo nutritivo a los de MUC5B en suspensión en PBS, y en ambos casos la actividad en la población fue menor que 4% (Figura 1). No se observó diferencia en el nivel de actividad de la población de células en suspensión en MUC5B en PBS y que suspendido en PBS solo (control) (datos no mostrados). Para comparar la actividad proteolítica de las células planctónicas con la de las células del biofilm de L. fermentum,
bacterias se les permite formar biofilms en condiciones estáticas en un sistema de cámara de mini-flujo durante 24 horas en un ambiente MUC5B (en superficies recubiertas con MUC5B y MUC5B en la fase de líquido) o un entorno de caldo nutriente. La proporción de células proteolíticamente activas en las biopelículas en el entorno MUC5B era diez veces mayor (47 ± 0,6%) que por sus homólogos planctónicas (Figura 1b), mientras que dicho aumento se observó en los biofilms formados en presencia de caldo nutritivo. Obtención de imágenes de los biofilms mostró que L. fermentum
células adheridas tanto a la no recubierta y las superficies recubiertas con MUC5B y biopelículas formadas (Figura 2). En el entorno de MUC5B, las células proteolíticamente activas se distribuyen uniformemente a través del biofilm (Figura 2a), mientras que la actividad en el medio ambiente caldo nutritivo fue baja (Figura 2b). Estos datos indican que la actividad proteolítica se mejora en las células del biofilm de L. fermentum
en un entorno rico en mucina. El efecto no se ve cuando planctónicas L. fermentum
células se exponen a los mismos mucinas en la fase fluida o en presencia de caldo nutriente. Figura 1 Proporción de células Lactobacillus fermentum proteolíticamente activas en planctónicos y biofilm cultura. Gráficos que muestran el porcentaje de células proteolíticamente activas en las poblaciones de (a) planctónicos o (b) células del biofilm de L. fermentum
en un caldo de nutrientes con el medio MUC5B- o como se revela el uso de un sustrato fluorescente combinado con CSLM. Las barras representan el valor medio de tres experimentos independientes ± SE (** p & lt; 0,01).
Figura 2 las actividades proteolíticas de las poblaciones de biopelícula Lactobacillus fermentum en presencia o ausencia de MUC5B. imágenes CSLM que muestran las células del biofilm que crecen en (a) la presencia de un entorno MUC5B o (b) un entorno de caldo nutriente. La actividad proteolítica se visualizó por incubación con un sustrato de caseína conjugado con FITC (verde) durante 1 hora. Las células fueron counterstained utilizando Syto 24 (rojo). La barra representa 20 micras y los insertos muestran ampliaciones de cuatro veces de los principales micrografías. La actividad proteolítica Hoteles en las células del biofilm de L. fermentum
está influenciada por la superficie asociada MUC5B
Para determinar si el aumento de la proteolítica la actividad en el L. fermentum
población de biopelículas en el entorno MUC5B se debió principalmente a las mucinas asociadas a la superficie o los de la fase en masa, los efectos de estos fueron investigados por separado. Las biopelículas de L. fermentum
fueron, por tanto, tampoco establecieron en superficies recubiertas con MUC5B con caldo nutritivo en la fase fluida, o sobre superficies recubiertas con MUC5B en la fase fluida. En presencia de MUC5B asociada a la superficie, análisis de imágenes reveló que 13 ± 3% de la población era proteolíticamente activa (Figura 3), mientras que en las células expuestas a MUC5B en la fase de líquido sólo, la actividad fue muy baja (0,3 ± 0,02%). Por lo tanto, estos datos muestran que la presencia de mucinas en la superficie era importante para la mejora de la actividad proteolítica. Sin embargo, la proporción de células activas en las mucinas asociadas a la superficie por sí sola fue significativamente menor que la observada en el medio ambiente MUC5B, donde mucinas también estaban presentes en la fase a granel. Esto sugiere que la adhesión a MUC5B asociada a la superficie puede haber 'cebado' las células que les permite responder a la presencia de MUC5B en la fase fluida. Figura 3 actividades proteolíticas de las poblaciones de biopelícula Lactobacillus fermentum en presencia de (a) (b) MUC5B de fase líquido-superficie asociado o. CSLM imágenes que muestran las células del biofilm crecen en (a) la presencia de una superficie de capa de MUC5B o (b) en presencia de MUC5B en la fase fluida. La actividad proteolítica se visualizó por incubación con un sustrato de caseína conjugado con FITC (verde) durante 1 hora. Las células fueron counterstained utilizando Syto 24 (rojo). La barra representa 20 micras y los insertos muestran ampliaciones de cuatro veces de los principales micrografías.
La degradación de MUC5B por L. fermentum
Para determinar si las mucinas en el entorno de mucina ricos son degradados por las proteasas producidas dentro de la L. fermentum
biofilms, MUC5B que había estado en contacto con las biopelículas de 24 horas se sometieron a SDS-PAGE seguido de transferencia Western con un antisuero anti-MUC5B (Figura 4). mucinas de control, que no había estado en contacto con las bacterias, se visualizaron como una única banda en la parte superior del gel que muestra que eran de alto peso molecular (& gt; 300 kDa). Sin embargo, cuando las mucinas se habían incubado con L. fermentum
biofilms, una banda adicional apareció en la región superior del gel de gradiente 4 a 12% lo que indica que parte de las mucinas había sufrido cierta degradación que permitió MUC5B a migrar en el gel. Así, estos datos confirman que las poblaciones de biopelícula proteolíticamente activas de L. fermentum
pueden degradar MUC5B. Figura 4 La degradación de la cadena principal del polipéptido MUC5B por las proteasas de las biopelículas de L. fermentum. Una muestra de control de MUC5B (a) y MUC5B que había estado en contacto con las células del biofilm durante 24 horas (B) se sometieron a SDS-PAGE en geles al 4-12%. Después de electro-transferencia sobre membranas de PVDF, MUC5B se detectó utilizando el antisuero LUM5B-14. El fondo del pozo se indica.
Expresión de proteínas de la superficie de L. fermentum
Desde MUC5B fueron degradadas por las células del biofilm de L. fermentum
, la base de datos del genoma fue analizado en busca de proteasas capaces de glicoproteínas degradantes. Usando este enfoque, una proteasa, O-
sialoglicoproteína endopeptidasa, con un peso molecular de aproximadamente 35 kDa, fue seleccionado como un posible candidato. transferencia de Western de geles de 2DE de proteínas de la superficie de L. fermentum
células del biofilm con un antisuero policlonal contra un péptido en la secuencia de la glicopeptidasa identificado un lugar en 32 kDa, que corresponde a O-
endopeptidasa sialoglicoproteína (véase la figura 5a). Para investigar si esta proteína se expresa de forma diferente en la superficie de L. fermentum
células del biofilm en los diferentes ambientes, proteínas de superficie de las células del biofilm en un ambiente MUC5B se compararon con los de las células en un caldo de cultivo con el medio nutriente utilizando 2D- electroforesis en gel. El análisis de imágenes de geles teñidos con plata reveló que la expresión de la O-
endopeptidasa sialoglicoproteína se mejoró 2,7 veces en la presencia de MUC5B, en comparación con un caldo nutriente. Además, un número de puntos en el intervalo de 52 a 76 kDa mostró mayores niveles de expresión en el MUC5B- que en nutrientes de caldo-medio ambiente (véase la Figura 6 y la Tabla 1). Estos se cortaron a partir de un gel teñido con Coomassie correspondiente (véase la figura 5b), se sometieron a LC-MS /MS y las proteínas a continuación, identificados por comparación de los fragmentos trípticos con la base de datos Mascot. Esto reveló cuatro proteínas con más de tres veces sobre regulación en el MUC5B- en comparación con los nutrientes de caldo-ambientes, correspondiente a las proteínas chaperonas; factor desencadenante (aumento de 25 veces), DnaK (aumento de 9 veces), EF-G (aumento de 6 veces) y GroEL (aumento de 3 veces). Así, estos datos muestran que, además de la regulación de la glicoproteasa, aumento de la actividad proteolítica en la población se asocia con un aumento en la superficie de la expresión de las proteínas chaperonas DnaK, GroEL y el factor de disparo. Figura 5 proteínas superficiales identificadas en las células del biofilm de L. fermentum. (A) transferencia de Western de electroforesis bidimensional (2DE) de proteínas de superficie. Las muestras se sometieron a IEF en un gradiente de pH 4-7, seguido de SDS-PAGE en 14% de geles. Después de la electrotransferencia sobre membranas de PVDF, GPR, se detectó
endopeptidasa O-sialoglicoproteína utilizando el antisuero policlonal MOB-LFGE-2. (B) gel teñido con azul brillante de Coomassie después de la Eco-2D de proteínas de superficie. Las manchas se escindieron del gel teñido, se sometió a digestión y proteínas tríptica en gel identificado por análisis LC-MS /MS. Las proteínas identificadas fueron: arg
, arginina deiminasa; ATPasa
, ATP sintasa piruvato deshidrogenasa; DnaK
; EF-G
, factor de elongación G; EF-Tu
, factor de elongación Tu; fum
, fumarato hidratasa; Groel
; LDH
, lactato deshidrogenasa; KET
, fosfocetolasa; orn
, carbamoiltransferasa ornitina; PDH
, piruvato deshidrogenasa y ppc
, hidratasa phophopyruvate.
Figura 6 bidimensional en gel de electroforesis de proteínas de superficie de Lactobacillus fermentum. Las proteínas aisladas de bacterias en un medio ambiente MUC5B-(izquierda) o un entorno de caldo nutriente (derecha) se sometieron a IEF en un gradiente de pH 4-7, seguido de SDS-PAGE en 14% de geles. Los geles se tiñeron con plata y análisis de imágenes de las proteínas expresadas de forma diferente realizaron utilizando el software Delta 2D.
Tabla 1 Identificación de las proteínas de superficie en las biopelículas fermentum L. mejoradas más de 2,0 veces en el medio ambiente MUC5B en comparación con un entorno de caldo nutritivo a
proteína
IOD%
Doblar changeb
MUC5B
caldo nutritivo
gatillo factor
3.53
0.14
25.2
DnaK
2.57
0.29
8.9
Elongation factor G
2.91
0.46
6.3
GroEL
5.66
1.84
3.1
O-sialoglycoprotein endopeptidasa
3,31
1,24
2,7
piruvato deshidrogenasa
3,04
1,22
2,5
aDatos obtenido a partir del análisis de los geles teñidos con plata 2DE que se muestran en la Figura 6.
cambio bFold calculado como el porcentaje del valor de la densidad óptica integrada (IOD) de las proteínas en Discusión del MUC5B contra el medio ambiente caldo nutritivo.
en sus entornos naturales en la cavidad oral, el tracto gastrointestinal y el tracto reproductor femenino, los lactobacilos se encuentran en las biopelículas de múltiples especies dentro de las capas de moco adherente sobre el anfitrión las superficies mucosas. La supervivencia y el crecimiento en estos sitios es dependiente de la capacidad de las bacterias para unirse a las capas mucosas, así como para degradar sustratos complejos tales como glicoproteínas mucosas para generar pequeños péptidos y sacáridos como una fuente de nutrición. En este estudio, L. fermentum
era capaz de unirse y formar biopelículas en el entorno MUC5B, de acuerdo con la expresión de la proteína de unión a mucina, 32-Mmubp por esta especie [16]. El MUC5B mucina es un componente principal de las capas de moco adherente en la cavidad oral y el tracto reproductor femenino, los dos sitios en los que se conoce L. fermentum
para colonizar [10, 24].
La proporción de proteolíticamente activo las células dentro de las poblaciones de biopelículas de L. fermentum
fue significativamente mayor en un entorno de mucina ricos en que en la presencia de caldo nutriente lo que sugiere que la presencia de mucinas promueve la actividad proteolítica en L. fermentum
. La capacidad de MUC5B para inducir la actividad proteolítica anteriormente se ha demostrado en la bacteria comensal oral, Streptococcus mitis
[25] y sobre regulación de la actividad proteolítica también se ha demostrado en el patógeno fúngico Aspergillus fumigatus
creciente en gástrico mucinas [26]. Para determinar los papeles relativos de las mucinas asociadas a la superficie y de la fase de fluido en la mediación de esta actividad mejorada, se les permitió L. fermentum
células para adherirse a las superficies recubiertas con mucinas o para formar biofilms en superficies no-mucina recubierto donde estaban expuesto a mucinas de fase líquido solo. Esto reveló que la exposición a las mucinas de fase líquido solo no tuvo ningún efecto up-regulador sobre la actividad proteolítica en las biopelículas. Del mismo modo, la actividad proteolítica no se mejoró en células planctónicas expuestos a mucinas en solución, lo que indica que la presencia de mucinas en la fase de fluido no hasta de regular la actividad proteolítica en L. fermentum
. Por el contrario, el contacto de las células con las mucinas asociadas a la superficie causó un aumento significativo en la actividad proteolítica dentro de la población lo que sugiere que las mucinas desempeñan un papel fundamental en la regulación del efecto y que las moléculas asociadas a la superficie son de particular importancia. Los mecanismos que subyacen a esta observación Actualmente no se conocen, pero es posible que los epítopos dentro de las mucinas, revelaron como resultado de la unión a una superficie, son necesarios para la regulación de la actividad proteolítica. Curiosamente, el nivel de actividad proteolítica en las células del biofilm en mucinas asociadas a la superficie (13 ± 0,4%) fue menor que la observada cuando las mucinas estaban presentes tanto en la superficie y en la fase de fluido (47 ± 0,6%), lo que sugiere que las células Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
