dental
Resumen Antecedentes
Este estudio investigó la prevalencia de Enterococcus faecalis
, sus factores de virulencia y la susceptibilidad antimicrobiana en individuos con y sin enfermedades dentales. Un total de 159 muestras de enjuague bucal se recogieron de pacientes (n = 109) que sufren de enfermedades dentales y controles sanos (n = 50).
Resultados
E. faecalis
se detectó utilizando sólo la cultura en 8 /109 (7,3%) de los pacientes con diversos tipos de enfermedades dentales, mientras que no E. faecalis
se encontró en los controles sanos y tiempo por el uso de la cultura y PCR. caracterizaciones fenotipo de las 8 E. faecalis
aislamientos indicaron que 25% de los aislados producidos hemolisina y 37.5% de la gelatinasa producida. La mayoría de los genes de virulencia importantes; vinculante proteína colágeno (as
) y endocarditis antígeno (efaa
) estaban presentes en todas 8 E. faecalis
aislamientos, mientras gen activador de hemolisina (CYLA
) sólo se detectó en el 25% de los aislados, y todos los aislados fueron negativos para esp
gen. Todo E. faecalis
aislados fueron 100% sensibles a la ampicilina, cloranfenicol, ciprofloxacina, vancomicina, teicoplanina y, y, en menor medida a la eritromicina (62,5%).
Conclusión
Este estudio muestra que todos los faecalis E.
aislamientos fueron recuperados sólo de los pacientes con enfermedades dentales pulpas necróticas en especial, y todos los aislados llevan a proteínas y genes de antígenos endocarditis vinculante y altamente susceptibles al colágeno utilizado con frecuencia los medicamentos antimicrobianos en Jordania.
material complementario electrónica Francia El línea versión de este artículo (doi:. 10 1186 /1472-6831-8-17) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes ¿Cuántas estudios demostró que E. faecalis es
. con frecuencia se encuentra en pacientes que sufren de infecciones orales tales como la gingivitis, periodontitis, dientes con endodoncia fallado, así como lesiones de caries ácidos asociados con canales de la raíz infectados persistentemente. [1-4] Otros estudios demostraron la presencia frecuente de E. faecalis
en asociación con una amplia variedad de especies de bacterias aerobias y anaerobias implicadas en diversas enfermedades endodónticas y periodontitis apical crónica [4-7].
Factores virulentos de E. faecalis
asimismo el cumplimiento de tejido del huésped, la invasión y la formación de abscesos, la modulación de la respuesta inflamatoria de acogida, la secreción de diversos productos que mejora la formación de biopelículas [8-10]. Los datos sobre la prevalencia oral de E. faecalis
y sus factores de virulencia varían de un estudio a otro [1, 6, 7]. Por lo tanto, una mayor investigación sobre los posibles factores de virulencia de E. faecalis
sería útil en la comprensión de su papel en las infecciones dentales. Por otra parte, los aislados clínicos de E. faecalis
recuperados de infecciones del conducto radicular pueden expresar resistencia a los antimicrobianos a los regímenes de tratamiento convencionales recomendados para procedimientos dentales [11-13].
Este estudio tuvo como objetivo investigar la ocurrencia de E. faecalis
, sus factores de virulencia y susceptibilidad antimicrobiana en asociación con y sin algunas enfermedades dentales en una población jordano: resultados de la edad de los pacientes osciló entre 14 y 75 años (media, 36,4 años), y las personas de control fueron entre 20 y 69 años (media 28,3; año). La prevalencia de E. faecalis
aísla en muestras de enjuague bucal de los pacientes con enfermedades dentales se 8/109 (7,3%) utilizando tanto la cultura como las pruebas de PCR, mientras que todas las muestras de enjuague bucal obtenidos a partir de las 50 personas sanas de control fueron negativos para E . faecalis
utilizando ambos métodos. Todo el ADN extraído a partir de 8 E. faecalis
aislamientos fueron resultado ser positivo para faecalis
16s rRNA gen específico E.. La diferencia entre los resultados de los dos grupos es estadísticamente significativa (valor de p = 0,031). Además, hubo 2 E. avium
aislados (Tabla 1). El patrón de crecimiento de E. faecalis
aislado de casos positivos varió de unos pocos a numerosas colonias (2-50 × 10
3 colonias /ml). La distribución de 8 E. faecalis
aísla entre los pacientes en asociación de sexo, tabaquismo, la higiene oral y las enfermedades dentales se muestra en (Tabla 2). Detección de genes de factores de virulencia putativo entre 8 E. faecalis
aislamientos usando PCR fueron las siguientes; tanto as
y efaa
genes estaban presentes en todos los aislamientos (100%), mientras que se detectó CYLA
gen sólo en 2 aislados, y todos los aislados fueron negativos para esp
gen (Tabla 3, Figura 1). Todos 8 E. faecalis
aislados fueron 100% susceptibles a, ampicilina, cloranfenicol, ciprofloxacina, teicoplanina y vancomicina, mientras que 62,5% y 12,5% de los aislados fueron susceptibles a la eritromicina, imipenem, respectivamente, y todas fueron resistentes a la gentamicina, clindamicina y OxacillinTable 1 Detección de Enterococcus especies
en pacientes y controles
Características
la 109 pacientes con enfermedades dentales No. (%) guía empresas 50 Controles personas Nº (%)
Edad media (años) guía empresas 36,4 ± 13,98
28,3 ± 12,59
Sexo
|
Hombre
39 (36) guía empresas 24 (48) guía empresas
Mujer
70 (64) guía empresas 26 (52)
E. faecalis
8 (7.3)
0
E. avium
2 (1.8)
0
Tabla 2 Distribución de los 8 E. faecalis
aísla en asociación del sexo, el tabaquismo, la higiene oral y enfermedades dentales entre los 109 pacientes
Características
positiva E. faecalis
*
negativo E. faecalis
*
total No.
P-value***
Female
7
63
70
0.134
Male
1
38
39
|
Nonsmoker
7
83
90
0.228
Smoker
1
18
19
|
mala higiene bucal
7
68
75
0,222
buena higiene oral
1
33
34
|
gingivitis + ve
7
64
71
0,161
gingivitis -ve
1
37
38
|
pulpas necróticas
8 **
101
109
0
caries + ve
4 **
77
81
0.115
caries -ve
4
24
28
|
* recuento de colonias:. 2 - 50 × 103colonies /ml
** cada una paciente fue tratado con antibióticos durante el último mes.
*** No significativa entre E. faecalis positivo
y cada uno de sexo, tabaquismo, higiene oral, gingivitis, caries, pero significativa, con puples necróticas. sobre Table 3 Presencia del gen 16S rRNA y la prevalencia de ESP, CYLA, as, efaa
genes entre el 8 E. faecalis orales
aislados detectados por PCR.
Aislar Nº
16S rRNA
esp
CYLA
*
as
efaa
3
+
-
-
+
+
44
+
-
-
+
+
1
+
-
-
+
+
2
+
-
+
+
+
6
+
-
-
+
+
12
+
-
-
+
+
18
+
-
-
+
+
59
+
-
+
+
+
Total cepas No. (%) guía empresas 8 (100%) guía empresas 0 (0.0%)
2 (25%) guía empresas 8 (100%)
8 (100%)
* Dos cepas expresaron actividad hemolítica in vitro
Figura 1 Distribución de los genes efaa entre los 8 E. faecalis por vía oral. M, 100 pb marcador de ADN; Carril 1, efaa gratis (688 pb); control positivo (E. faecalis ATCC 29212
); Carril 2, efaa
control negativo; Carriles 3 a 10, de positivo a efaa Estar entre E. faecalis orales
aislamientos. Métodos
Un total de 159 sujetos que asistían a la clínica Dental /Hospital de la Universidad Jordan (JUH), Amman, Jordan fueron examinados para detectar la presencia de enfermedades dentales por dos dentistas (N. Dar-Odeh & amp; O. Abu Hammad) durante el período de estudio de 2005. los sujetos fueron divididos en dos grupos de acuerdo a la presencia o ausencia de enfermedades dentales. El grupo control consistió en 50 personas sanas que no tienen ninguna enfermedad dental obvia. Las enfermedades dentales investigados incluyen: la caries dental, gingivitis inducida por placa, y las enfermedades del conducto radicular. Los datos personales, historia de tabaquismo, presencia o ausencia de enfermedad clínica dental, higiene oral y el tratamiento con antibióticos durante el último mes se registraron para cada persona examinada. La caries dental y la gingivitis se registraron como presente /ausente. enfermedad del conducto radicular incluido: pulpitis irreversible, solamente pulpa necrótica, y la periodontitis periapical. La higiene oral fue considerado como pobre o bueno según el índice de placa. Todos los pacientes y de control de personas habían dado su consentimiento por escrito para su inclusión en el estudio. Se pidió a todos los pacientes y controles para enjuagar la boca durante 60 segundos con 10 ml de agua destilada estéril y se volvieron el enjuague oral a un recipiente estéril.
procesamiento de muestras
Todas las muestras fueron transferidas inmediatamente al Laboratorio de Investigación de Microbiología /Facultad de Medicina /Universidad de Jordania. especímenes enjuague oral se vertieron en tubo estéril y se centrifugaron durante 10 min a 10.000 g. Se desechó el sobrenadante y los sedimentos restantes fueron re-suspendido por vórtice en un ml de solución salina normal estéril al 0,9% [14].
Aislamiento de especies de Enterococcus
un bucle completo de los gránulos suspendidos (0,01 ml) se cultivó en bilis-esculina placas de agar para detectar y contar la presencia de gris a negro colonias de especies de Enterococcus.
El resto de las muestras en suspensión se almacenaron a -70 ° C para investigaciones posteriores. Al menos tres colonias cultivadas en placas de bilis-esculina se subcultivaron en placas de agar sangre para aislar especies de Enterococcus
(Oxoid, Inglaterra). Todos los cultivos realizados a través del estudio fueron incubadas en un frasco con vela (5% de CO 2) durante 24-48 horas a 37 ° C. crecimiento puro obtenido a partir de placas de agar sangre se inoculó de nuevo a la cisteína lactosa electrolito deficiente (CLED) placas de agar (Oxoid, Inglaterra), solución de NaCl al 6,5% y agar tubo bilis-esculina. Cada crecimiento que muestra cocos grampositivos, la bilis esculina-positivo, las pruebas positivas de NaCl 6,5%, catalasa-negativa y que aparece como en amarillo tamaño pequeño /mediano en agar CLED (Oxoid, Inglaterra) se registraron tentativamente como Enterococcus
aislamientos. E. faecalis ATCC 29212
se incluyó como control positivo durante todo el estudio.
Detección bioquímica de aislamientos de E. faecalis MyBestPlay Todos tentativa de Enterococcus
cepas se subcultivaron en placas de agar de infusión de cerebro y corazón (Oxoid, Inglaterra) y probado usando el sistema de Remel bioquímica (Rapid System ™ STR, EE.UU.) para confirmar su identidad como E. faecalis
.
hemolisina y actividades gelatinasa
E. faecalis
aislamientos fueron evaluados para la actividad hemolítica en agar de base de la sangre (Oxoid, Inglaterra) suplementado con 5% (v /v) de sangre humana. Una sola colonia se cultivó en placas de agar sangre y su actividad hemolítica se determinó por la presencia de zona clara alrededor de las colonias (beta hemólisis) según lo informado por Creti et al
. [15]. actividad de gelatinasa se evaluó mediante la inoculación de colonias individuales de cada aislamiento como forma de mancha en placas de gelatina al 12% (Defico, EE.UU.). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 48 hrs. actividad de la gelatinasa fue evidente por la presencia de la zona de licuado alrededor de las colonias. mercenses Serratia
ATCC 13880 fue utilizada como control positivo para la prueba de producción de gelatinasa.
prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Susceptibilidad de aislados de E. faecalis
a 9 agentes antimicrobianos se determinó mediante el método de difusión en disco de acuerdo a NCCLS ( ahora CLSI) directrices [16].
la detección de E. faecalis en la muestra de enjuague bucal mediante PCR
extracción de ADN se realizó mediante Asistente Kit purificación DNA genómico (Promega, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las extracciones de ADN se utilizaron para la detección de los genes 16S rRNA específicos de E. faecalis
en muestras de enjuague oral [17]. Las condiciones de PCR se llevaron a cabo por un termociclador PCR (MJ investigadores INC, EE.UU.), y fueron las siguientes: 15 min paso de desnaturalización inicial de activación de enzimas /ADN a 95 ° C seguido de 35 ciclos consecutivos a 94 ° C durante 20 s; 68 ° C durante 45 s; 72 ° C durante 15 s. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis usando 2% de gel de agarosa (Promega, EE.UU.) que contiene bromuro de etidio en 1 x tampón TBE, y una duración de 1 hora con 70 V, y se visualizaron por UV Trans-iluminador (UVP) y el Sistema de documentación de gel (UVP) . La misma reacción de PCR fue probado con cada cepa de control único de E. faecium y S. mutans
los cuales fueron aislados de otros especímenes clínicos en JUH, y mediante el uso de E. faecalis ATCC 29212.
la prueba de PCR utilizado, dio un resultado negativo con el ADN extraído de E. faecium y S. mutans
. Además, la extracción de ADN de recuperó e identificó E. faecalis
aislados se confirmaron usando el mismo procedimiento de extracción de ADN y PCR en las mismas condiciones usadas para las muestras de enjuague oral (Tabla 4) .Tabla 4 susceptibilidad antimicrobiana de 8 E. faecalis
por el método de difusión en disco
Los agentes antimicrobianos
No. (%) De las cepas susceptibles
Ampicilina
8 (100)
cloranfenicol
8 (100)
La ciprofloxacina
8 (100)
Teicoplanina
8 (100)
vancomicina
8 (100)
eritromicina
5 (62.5)*
Gentamycin
Null
Clindamycin
Null
Oxacillin
Null
Albergado única as
, efaa
genes.
La detección de E. faecalis genes de virulencia
ADN de E. faecalis
aislamientos fue preparada suspendiendo un bucle completo de las colonias de crecimiento durante la noche crecido en la sangre agar en un tubo que contenía 500 l de agua destilada estéril, seguido de ebullición durante 10 min y después se centrifugó a 12.000 g durante 6 min. Una alícuota del sobrenadante (5 l) se utilizó como la plantilla en un volumen final de 25 l mezcla de PCR [15]. la amplificación PCR para los siguientes genes: proteína de unión a colágeno (as
), endocarditis antígeno (EFAA
), activador de hemolisina (CYLA
), y una proteína de superficie (esp
) se prepararon como en uniplex un 25 l de volumen final de reacción. La Tabla 5 muestra los cebadores utilizados en el estudio [15, 17, 18] .table 5 E. faecalis
cebadores utilizados en el estudio
Gene
Secuencia
tamaño del producto (pb) guía empresas de referencia
E. faecalis
16S rRNA
Ef16SF 5 '- CCGAGTGCTTGCACTCAATTGG - 3'
138
17
Ef16SR 5 '- CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC - 3'
|
|
Esp
5'-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3 '
932
18
|
5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGA-3 '
|
|
CYLA
5'-GACTCGGGGATTGATAGGC-3 '
688
15
|
5'-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3'
|
|
as
5'-GGAATGACCGAGAACGATGGC-3 '
616
15
|
5'-GCTTGATGTTGGCCTGCTTCCG-3 '
|
|
efaa
5' -GCCAATTGGGACAGACCCTC-3 '
688
15
|
5'-CGCCTTCTGTTCCTTCTTTGGC-3'
|
|
muestras fueron amplificadas en un termociclador PCR (MJ investigadores INC, EE.UU.), por calentamiento durante 5 min a 95 ° C, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 60 s , 58 ° C durante 60 s (63 ° C para esp
) y 72 ° C durante 60 s, y una etapa final de 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se analizaron en electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (que contiene 0,5% de bromuro de etidio en 1 x tampón TBE) que se extienden por 50 minutos por 80 voltajes utilizando aparato de electroforesis horizontal, y se visualizaron por el sistema de documentación de geles (UVP, EE.UU.). E. faecalis ATCC 29212
se utilizó como control positivo en cada serie de PCR para detectar CYLA
, as
, EFAA
genes, y para probar ADN preparado a partir de ciertas cepas de E. faecalis
(EFS121, EFS87, EFS16, EFS27B, EFSU85, y EFS118) que se obtuvo del Dr. Roberta Creti (Dipartimeno di Malattie Infecttive, Parassitarie ED Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299 a 00161 Roma, Italia). Estas preparaciones de ADN fueron utilizados como control positivo para el gen esp
junto con 1 Kb /100 pb marcador Escalera (Promega, EE.UU.).
El análisis estadístico se utilizó la prueba
Z para comparar la prevalencia de E. faecalis
en pacientes grupo y el grupo de control de acuerdo con la siguiente ecuación:
Z = P 1 - P 2 /√P (1-P) (1 /n 1 + 1 /n 2). P & lt; .
0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Discusión Francia El presente estudio muestra que E. faecalis
aislamientos fueron recuperados de pacientes jordanos en asociación con una o más de las siguientes enfermedades dentales; caries, gingivitis, gingivitis inducida por placa, y de infección de endodoncia, y en una tasa significativa (7,3%; P = 0,031) en comparación con las personas sanas de control (cero). A pesar de que en general la PCR es más sensible que el método de cultivo en la detección de bacterias en muestras clínicas, este estudio no ha detectado ningún E. faecalis positivo
usando muestras de enjuague oral directo. Sedgley CM et al., 2005 (19) encontró que una cuantitativa en tiempo real PCR informó una mayor incidencia de E. faecalis Hoteles en muestras de enjuague bucal que las técnicas de cultivo y que ofrece una mayor sensibilidad. El estudio reveló que la mala higiene oral, gingivitis y pulpas necróticas parecen ser importantes factores predisponentes para la infección con E. faecalis gratis (Tabla 2). Un estudio similar reciente de EE.UU. ha aislado E. faecalis
del 11% de las muestras de enjuague bucal de los pacientes que recibieron un tratamiento de endodoncia, pero sólo el 1% de E. faecalis
se recuperó de los estudiantes de odontología sin antecedentes de tratamiento endodóntico [ ,,,0],14]. Los enterococos son capaces de colonizar la cavidad oral, especialmente en pacientes con periodontitis o infecciones del conducto radicular asociados con lesiones de la mucosa bucal y en los pacientes inmunocomprometidos [20, 21]. También, E. faecalis
es la especie más comúnmente aisladas a partir de muestras de canal radicular con insuficiencia endodoncia [2, 21, 22]. E. faecalis
ha sido frecuentemente aislado en cultivo puro o como un organismo predominante en los dientes previamente Raíz lleno de lesiones periapicales o periodontitis apical crónica [3, 19, 23, 24]. Por otra parte, se ha encontrado que este organismo con infección persistente del conducto radicular, donde la medicación hidróxido de calcio es ineficaz [25].
Este estudio muestra que la producción de hemolisina y gelatinasa como determinantes de virulencia no siempre se expresaron por E. faecalis
aislados en asociación con enfermedades dentales, ya que sólo 25% de los aislados faecalis
actividad gelatinasa hemolisina y 37,5% expresado E. in vitro, respectivamente. Dos estudios realizados por Sedgley et al
. [14, 23] informó de resultados diferentes con la producción de hemolisina, primer estudio ha demostrado que el 36% de las cepas de E. faecalis
recuperados de pacientes de endodoncia produjo hemolisina, mientras que el segundo no ha detectado producción de hemolisina en cualquier enterococos aislados de endodoncia casos. Además, Sedgley et al
. [22] encontró que el gen de la gelatinasa (gelE) se detectó en todos los aislamientos de endodoncia de E. faecalis
mientras expresado la actividad gelatinasa se observó en dos tercios de los aislados. Estos estudios concluyeron que la evidencia de los posibles factores de virulencia fueron identificados en endodoncia Enterococcus spp
., Específicamente la producción de gelatinasa y la respuesta a las feromonas. Otros estudios indican que la expresión del gen de la gelatinasa contribuyó al aumento de la difusión de E. faecalis Hoteles en entornos de alta densidad y se asoció con aumento de la adhesión de E. faecalis
a la dentina in vitro
[26, 27] . Francia El presente estudio ha demostrado que tanto as
y efaa
genes estaban presentes en todos los aislados de E. faecalis
, mientras que se detectó CYLA
gen sólo en dos aislados, y todos los aislados eran negativo para esp
gen que se encuentra principalmente en E. faecalis
cepas aisladas de infecciones del tracto urinario [18].
Un estudio basado en la molecular reciente indicó que la virulencia determinantes de efaa
y el as
genes se ha encontrado en todos los
E. faecalis aislados de los conductos radiculares de los pacientes de endodoncia, mientras esp
gen estaba presente en el (58%) y CYLA
gen en (19.4%) de los aislamientos [11] . Estos resultados están de acuerdo con nuestros resultados, excepto para esp
gen. En general, la expresión de la actividad hemolisina y gelatinasa o sus genes, junto con la aparición de otros genes de virulencia (esp
, CYLA
, as
, AAE un
) en E. faecalis
cepas variaron ampliamente de un estudio a otro y, probablemente, debido a la diferencia en sus orígenes geográficos y clínicos [5, 9, 11, 26-29]. Además, ni esp ni gelatinasa parecía ser necesarios para la formación de la biopelícula; tanto en E. faecalis y E. faecium
no mostraron una correlación entre la presencia de cualquiera de esp o la producción de gelatinasa y la formación de biopelículas [30]. Parece que muchos factores ambientales y genéticos pueden estar asociados con la producción de biofilm por E. faecalis
[31].
En los últimos años, los enterococos han recibido una atención creciente debido al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos antimicrobianos y su prevalencia común en las infecciones nosocomiales. enterococos resistentes a vancomicina (VRE) probablemente representan actualmente el reto más grave entre muchos microbios con resistencia a los antibióticos que causan infecciones en humanos [32]. Nuestros resultados mostraron que todos los E. faecalis
aislados fueron sensibles al cloranfenicol, ampicilina, vancomicina, ciprofloxacina, y teicoplanina, pero las cepas fueron mucho menos susceptibles a la eritromicina. Un estudio realizado por Pinheiro et. Al
. [12] mostró que E. faecalis
aísla a partir de muestras orales fueron completamente susceptibles in vitro
a la amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, vancomicina y, en menor medida susceptible a la eritromicina, la moxifloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, doxiciclina y ciprofloxacina . El resultado de la susceptibilidad a nuestro número limitado de cepas E. faecalis
indica una mayor frecuencia de las tasas de resistencia que las reportadas en estudios recientes de los países occidentales [11-13]. Por otra parte, nuestro resultado de susceptibilidad se correlacionan bien con la alta prevalencia de resistencia entre la comunidad clínica y Staphylococcus aureus aislados de
en Jordania [33].
En conclusión, este estudio muestra que todos los aislados E. faecalis
están asociados con pulpas de diversas enfermedades dentales especialmente necróticas en los pacientes y se realizan tanto en proteínas y endocarditis genes de antígenos de unión a colágeno.
Declaraciones
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado en parte por la subvención de la Facultad de Estudios de Posgrado de la Universidad de Jordania, Amman , Jordan. Los autores agradecen al Dr. Roberta Creti (Laboratorio de Bacteriología, Instituto de Higiene Especial, Universidad de La Sapienza, Roma, Italia) para el envío de ADN preparado a partir de ciertas cepas de E. faecalis
que se utilizó como control positivo de esp
gen.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 12903_2007_92_MOESM1_ESM.pdf autores archivo original para la figura 1 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Autores de las contribuciones
AAS y ND-O contribuyeron al diseño de todos los experimentos y la escritura del manuscrito . ND-O y la OAH examinaron todos los pacientes y de control de las personas y se recogieron las muestras orales. RS realizaron todas las pruebas de laboratorio y co-escribió el manuscrito.
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