epitelio gingival humano
Resumen Antecedentes
receptores activados por proteasa (PAR) son G-receptores acoplados a proteínas con un papel activo en la mediación de la inflamación, el dolor y la otras funciones. El patógeno oral de Porphyromonas gingivalis gratis (P. gingivalis
) segrega proteasas que activan PAR. El objetivo de este estudio fue determinar el papel de los PAR en la patogénesis de la periodontitis crónica por el análisis de la expresión de PAR en las células humanas epiteliales gingivales (GECS) antes y después de P. gingivalis
tratamiento sobrenadantes.
Métodos
GECS fueron aisladas de muestras de tejidos gingivales humanos sanos. La expresión de PAR en GECS se determinó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y citometría de flujo. El efecto de P. gingivalis
proteasas fue investigado por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (QRT-PCR) y citometría de flujo.
Resultados
PAR-1, PAR-2, y PAR-3 se expresaron en GECS. PAR-4 no se encontró por tanto RT-PCR y citometría de flujo. Análisis de la expresión génica utilizando QRT-PCR mostró una regulación de PAR-2 mRNA en comparación con las células control no tratadas (P
& lt; 0,05). Por el contrario, las expresiones de ARNm de PAR-1 y PAR-3 fueron significativamente las reguladas (P Hotel & gt; 0,05) en respuesta a P. gingivalis
sobrenadante en comparación con la de las células de control no estimuladas. Este efecto ha sido abrogada por la TLCK inhibidor de la proteasa (P Hotel & lt; 0,05). Los resultados de citometría de flujo indican los niveles de proteína PAR consistentes con los niveles de mRNA en los resultados de QRT-PCR.
Conclusiones
Nuestro estudio muestra que el PAR-1, PAR-2 y PAR-3 se expresan en GECS. P. gingivalis
proteasas juegan un papel en la regulación de la respuesta inmune innata en GECS. GECS utilizar PAR reconocer P. gingivalis
y mediar respuestas de las células implicadas en la inmunidad innata.
Del receptor Palabras clave
proteasa activa-células epiteliales gingivales humanos Porphyromonas gingivalis P
roteases Antecedentes
receptores activados por proteasa (PAR) son una subfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) con cuatro miembros, PAR-1, PAR-2, PAR-3 y PAR-4, que desempeñan un papel crítico en la hemostasia, trombosis, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la inflamación y la progresión del cáncer [1]. La activación de PAR se produce por un mecanismo único que implicaba la escisión proteolítica específica de la secuencia extracelular N-terminal por una proteasa. Esta escisión desenmascara una nueva secuencia N-terminal, que actúa como un ligando de atado que se une al receptor para iniciar múltiples cascadas de señalización [2-4]. Aunque comparten el mismo mecanismo de acción, se ha demostrado que los diferentes PARs se caracterizan por diferentes distribuciones y acciones biológicas y pueden ser activados por diferentes proteasas [5]. La trombina es un activador importante de PAR-1, PAR-2 y PAR-3. Otros activadores importantes de PAR-1 incluyen la proteína C (APC) y matriz activada metaloproteinasa-1 (MMP-1); mientras que la tripsina y la triptasa de los mastocitos humanos activar PAR-2 y tripsina y la catepsina G activan PAR-4. En cuanto a la obtención de respuestas de señalización corriente abajo, PAR-1, PAR-2 y PAR-4 puede tener señal de forma autónoma, mientras PAR-3 se considera principalmente a ser un co-receptor PAR-1 y PAR-4 [6-9]. Como PAR se expresan en una amplia variedad de tipos de células, recientemente se ha sugerido que juegan papeles importantes en procesos fisiológicos, tales como el crecimiento, el desarrollo, la inflamación, la reparación tisular y dolor. Comentario El epitelio gingival está llegando a ser conocido como regulador de la respuesta inmune innata por vía oral a una variedad de insultos, tales como bacterias y productos químicos. células epiteliales gingivales humanos (GECS), que son factores clave de la inmunidad innata, no sólo juegan un papel importante en el mantenimiento de la barrera física entre el huésped y el medio ambiente sino que también participan activamente en el tejido inmunidad innata [10, 11] mediante la expresión específicamente ciertos receptores que están implicados en la respuesta inmune del huésped. Es ampliamente aceptado que las células utilizan receptores de reconocimiento de patrones para identificar bacterias en su medio ambiente [12, 13]; sin embargo, además, algunos agentes patógenos, tales como Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), secretan proteasas que son reconocidos por células a través de la familia de PARs [14]. Se conocen PAR que se expresa en el epitelio de la encía y han sido implicados en la patogénesis de la periodontitis [15-18].
La periodontitis es una enfermedad infecciosa crónica que comienza como una inflamación de los tejidos periodontales y, finalmente, provoca la resorción del hueso alveolar y la posterior pérdida de los dientes. P. gingivalis
es un agente causal principal de la periodontitis crónica. Esta bacteria produce y libera una gran cantidad de enzimas proteolíticas. proteinasas similares a la tripsina, llamados gingipains, producidas por P. gingivalis
se ha demostrado que actúan como importantes agentes patógenos [19, 20]. Recientemente, se ha demostrado que gingipains son reconocidos por células a través de la familia de PAR, que están implicados en los procesos inflamatorios en varios tejidos. Sin embargo, las funciones precisas de los PAR en los tejidos gingivales y la importancia de los PAR específicos en la patogénesis de la periodontitis aún no se han dilucidado. En el presente estudio, reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se utilizó para investigar los niveles de mRNA de los PAR y citometría de flujo se utilizó para investigar los niveles de proteína de Pars en GECS. Además, se utilizó cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) para investigar los niveles de mRNA de los PAR en respuesta al sobrenadante libre de células de P. gingivalis
con el fin de corroborar los papeles de las proteasas secretadas.
Métodos
gingival cultivo de células epiteliales
GECS humanos primarios fueron aisladas de muestras de tejidos gingivales humanos sanos de pacientes sometidos a la extracción del tercer molar en el Departamento Dental, Sir Run Run Shaw hospital de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, china. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los individuos que participaron en este estudio. El estudio se evaluaron y aprobado por el Comité de Ética del Run Run Mostrar Hospital Afiliado Sir de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang (20131120). tejido de las encías Fresh se colocó en D-Hanks que contiene 300 U /ml de penicilina G y 300 mg /ml de estreptomicina y se incubó a 4 ° C. Dentro de 1 h, el tejido estaba preparado para la obtención de células epiteliales. Brevemente, el tejido se cortó en trozos pequeños (1 mm x 1 mm), se trató con una solución de 25% de dispasa II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y se incubaron durante 18 horas a 4 ° C. Después de la incubación, la capa epidérmica de queratinocitos humanos se levantó de la dermis y se coloca en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml que contiene 2 ml de tripsina-EDTA. El tejido se incubó a 37 ° C durante aproximadamente 10 min. Posteriormente, aislados GECS se sembraron en matraces T-75 (BD Biosciences) a una densidad celular de aproximadamente 3 × 10
6 células por matraz en 10-15 ml de medio libre de suero de queratinocitos (queratinocitos-SFM) a la que los suplementos eran añadido de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). Fluidos en los matraces se intercambian por medio completo fresco y gaseado con un 5% de CO 2 cada 2-3 días. Las células se pasaron cuando se alcanzó el 75-80% de confluencia.
Inversa análisis PCR de transcripción (RT-PCR) para la determinación de PARs expresión
a examinar la expresión de PAR ARNm, ARN total fue aislado de GECS (adulto a 70% de confluencia) usando el reactivo TRIzol® (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.) según el protocolo sugerido por el fabricante. La síntesis de la primera cadena de ADNc y RT-PCR se realizó con un kit PromeScript® RT-PCR (Takara Biotecnología Co., Ltd, Dalian, China). Los cebadores para PAR-1, PAR-2, par 3, par 4 y β-actina fueron sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, China, Tabla 1). Para la amplificación de PAR-1, PAR-2 y los productos de beta-actina, la PCR se realizó durante 30 ciclos. El primer ciclo incluye una etapa de desnaturalización de 5 min a 94 ° C. 2-30 ciclos tuvieron una etapa de desnaturalización de 30 s a 94ºC, 30 s de hibridación a 60 ° C y 45 s de elongación a 72 ° C. El último ciclo incluía una etapa de alargamiento de 10 min a 72 ° C. Para PAR-3 y la amplificación PAR-4, la PCR se realizó durante 30 ciclos. El primer ciclo incluye una etapa de desnaturalización de 5 min a 94 ° C. 2-30 ciclos tuvieron una etapa de desnaturalización de 30 s a 94ºC, 30 s de hibridación a 65 ° C y 45 s de elongación a 72 ° C. El último ciclo incluía una etapa de alargamiento de 10 min a 72 ° C. productos de ADN y marcador de peso molecular DL1,000 ™ marcador de ADN (Takara Biotecnología Co., Ltd, Dalian, China) fueron separados en un gel de agarosa al 1,5%, después de lo cual los geles se tiñeron con GelRed ™ y visualizadas bajo UV light.Table 1 de oligonucleótidos secuencias utilizadas para la RT-PCR Los cebadores
secuencia oligonucleótida
Longitud (pb)
sentido (5 'a 3')
antisentido (5 'a 3') guía empresas
PAR-1
CCCGCAGGCCAGAATCAAA
AAAGGGGAGCACAGACACAAACAG
395
PAR-2
CTACTCAGATGACCCCAGAAACT
CCCAAAGTGCTAGGATTACAGG
399
PAR-3
GGCTGGACAGGAGCCACGAT
AGCGGTTGATGCTGATGCAGG
403
PAR-4
GGATCGCCTACCACCTGCGTG
CCCGTAGCACAGCAGCATGG
401
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
202
cultivo de bacterias y sobrenadantes recogida
P. gingivalis ATCC 33277
se adquirió en la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en condiciones anaerobias (80% N 2, 10% H 2 y 10% de CO 2) en una infusión de cerebro-corazón (BHI; Oxoid) placa de agar que contiene 5% de oveja desfibrinada sangre enriquecida con 5 g de extracto /l de levadura, 5 mg /l hemina y 10 mg /l de menadiona (Sigma -Aldrich, Dorset, Reino Unido) a 37 ° C durante un máximo de 5 semanas. Los cultivos líquidos se prepararon mediante la inoculación de colonias bacterianas (3-4 días de edad) a partir de placas de agar sangre en caldo BHI 10 ml suplementado con 5 g de extracto /l de levadura, 5 mg /l hemina y 10 mg /l de menadiona y se incubaron durante 24 h . El diez por ciento de inóculo se transfirió a 90 ml del mismo medio y se incubó durante 6 días. Después de este periodo de cultivo, las bacterias se recogieron por centrifugación a 10.000 g
durante 15 min a 4 ° C y se recogieron los sobrenadantes, se esterilizaron por filtración sobre un filtro de 0,2 mm y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Antes del tratamiento, se utilizaron partes alícuotas del sobrenadante para la pre-incubación (10 min) con 1 mmol /l de la tosil-L-lisina clorometilcetona serina y cisteína proteasa inhibidor (TLCK; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), que inhibe gingipains [15, 21].
Caracterización de los sobrenadantes de cultivo de bacterias y el tratamiento
se diluyeron P. gingivalis
sobrenadantes en medio de cultivo celular y su concentración expresados como la proteína bacteriana total (mg /ml) presente en los cultivos celulares. La concentración de proteína se determinó con un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Se midió la absorbancia a 562 nm en un lector de placas SpectraMax® Plus. La actividad proteasa se midió con un kit de ensayo de proteasa ™ (G-Biosciences, San Luis, MO, EE.UU.) [22]. La absorbancia del péptido marcado con colorante se midió a 570 nm para la determinación de la actividad de la proteasa. Químicamente tripsina estabilizada (MSG-tripsina ™) fue suministrado con el kit como un estándar proteasa general. GECS se cultivaron a 80% de confluencia y se estimularon con o bien 50 mg /ml de proteína sobrenadante de cultivo de P. gingivalis
sobrenadantes o sobrenadantes preincubadas-TLCK, durante 6 h [22]. medio GEC Unstimulated sirvió como control para los experimentos de estimulación. Cada experimento de estimulación se realizó por triplicado y las células de dos a cinco donantes diferentes fueron probados.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR)
Después de la estimulación, el ARN total fue extraído por medio de un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y transcrito de forma inversa usando un equipo de Superscript® RT-PCR (Takara, Tokio, Japón). Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó usando la máquina de PCR de Applied Biosystems 7500 y el Kit de SYBR Premezcla (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. PCRs se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos en un volumen total de 20 l, incluyendo 1 l de ADNc y 0,8 l cebadores (10 micras; Tabla 2). expresión de ejemplo que se normalizó en contra de la limpieza de genes β-actina, que se incluyó en cada ejecución QPCR. controles de PCR se realizaron con agua en vez de cDNA. Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado. En cada punto de tiempo, las expresiones de los mRNAs seleccionados en las células incubadas con P. gingivalis
sobrenadantes o sobrenadantes preincubadas-TLCK se calcularon en relación a la limpieza de genes β-actina (? C
t) para cada muestra y luego expresado en relación con las células no tratadas en el mismo punto de tiempo usando el 2 -ΔΔC
t método [23] .Tabla 2 secuencias de oligonucleótidos utilizados para QRT-PCR
producto génico
de oligonucleótidos secuencia
sentido (5 'a 3') guía empresas antisentido (5 'a 3’)
PAR-1
GTGATTGGCAGTTTGGGTCT
GCCAGACAAGTGAAGGAAGC
PAR-2
CCTGGCCATGTACCTGATCT
GACACTTCGGCAAAGGAGAG
PAR-3
GGTGTGGGCAACAGTTTTCT
GGACTCGCAAGTGTTGTGAA
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
La citometría de flujo
Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubaron durante 30 min a 4 ° C con PBS que contenía suero humano normal inactivado por calor 20%, se lava de nuevo y luego se incubaron durante 30 min a 4 ° C con 15 nM de anticuerpos monoclonales específicos (mAb) a PAR-1-4 humana (conjugado con PE; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). citometría de flujo análisis se realizaron en un FACScan (BD Biosciences, San Jose , se utilizaron células de control CA, EE.UU.) se incubaron con anticuerpos no específicos conjugados con PE obtenidos a partir de los mismos fabricantes para establecer el umbral para el parámetro de fluorescencia, de manera que la fracción de células con fluorescencia positiva era & lt;. 2,5% de las células totales. el porcentaje de 1-4 PAR-células positivas se determinó a partir de la fracción de células en la muestra incubada con anticuerpos específicos que supere el umbral de la intensidad de señal de fluorescencia obtenida con la muestra control.
estadístico Todos los datos son
analiza muestran como la media ± la desviación estándar (DE). QRT-PCR datos se expresan como t (ciclo umbral) C
,
? C t (C
t ARNm PAR - C
t β- actina mRNA) y la cuantificación relativa (RQ; expresan como factor de cambio). Los cambios veces de la expresión de ARNm PAR se calcularon utilizando el 2 -ΔΔC
t método [23]. t de Student
-test fue utilizado para la comparación entre los dos grupos. SPSS versión 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico y P
≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
: Resultados de la RT-PCR análisis de Pars en GECS
RT análisis -PCR de ARN extraído de GECS reveló la presencia de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 mRNA (Fig. 1). Ningún producto de PCR se encontró para PAR-4 (Fig. 1). El resultado muestra que PAR-1, PAR-2 y PAR-3 se expresan en GECS, pero PAR-4 no lo es. Higo. 1 análisis de RT-PCR de ARNm de PARs en GECS. RT-PCR se realizó usando los cebadores específicos para cada tipo de PAR, tal como se describe en la Tabla 1. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,5%. Líneas 1-6 representan β-actina, PAR-4, PAR-3, PAR-2, PAR-1 y del marcador por separado. RT-PCR análisis reveló la presencia de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 mRNA en GECS. Ningún producto de PCR se encontró para PAR-4
P. gingivalis
sobrenadante altera la expresión de genes PAR
La actividad proteolítica del sobrenadante de P. gingivalis
se demostró después de 4, 8 y 16 h. La preincubación del sobrenadante con el inhibidor de la proteasa TLCK demostraron una reducción de la actividad proteolítica significativamente en comparación con el que en el sobrenadante nativo después de 4 y 8 h (P
& lt; 0.05; Fig. 2). Para evaluar el efecto de los gingivalis P.
sobrenadante sobre la expresión de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 mRNAs, GECS fueron cultivadas a 80% de confluencia y se estimularon con el sobrenadante de 6 h. Análisis de la expresión génica utilizando QRT-PCR mostró la regulación positiva de PAR-2 mRNA en comparación con células de control no tratados (P
& lt; 0.05; Fig. 3b). Por el contrario, las expresiones de ARNm de PAR-1 y PAR-3 se downregulated significativamente (P
& lt; 0,05) en respuesta a P. gingivalis
sobrenadante en comparación con la de las células de control no estimuladas (Fig. 3a, c) . La preincubación de los gingivalis P.
sobrenadante con el inhibidor de la proteasa TLCK abolió el efecto y restauró los niveles de expresión de ARNm de PARs a la de las células no tratadas. Controles establecen los utilizando medio bacteriana en blanco y TLCK no mostró ningún efecto sobre la expresión del ARNm de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 (Fig. 3). Los resultados fueron consistentes con estudios previos [22]. Higo. 2 Las actividades de la proteasa de P. gingivalis
sobrenadante o sobrenadante TLCK-preincubado. La actividad proteasa se midió con un kit de Ensayo de Proteasa ™ y se controló durante 4, 8 y 16 h. La absorbancia del péptido marcado con colorante se midió a 570 nm para la determinación de la actividad de la proteasa. sobrenadante nativa mostraron significativamente mayor actividad proteolítica de sobrenadante preincubado-TLCK después de 4 y 8 h. Se realizaron mediciones por triplicado. Los datos se muestran como la media con la desviación estándar (media ± SD). *, P Hotel & lt; 0,05, en comparación con los valores de sobrenadante nativos
Fig. 3 PAR-1 (a), PAR-2 (b) y PAR-3 (c) la expresión de genes en respuesta a P. gingivalis
sobrenadante. PAR expresión génica se evaluó por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) en respuesta al sobrenadante libre de células de P. gingivalis y
sobrenadante TLCK-preincubado en GECS. Después de P. gingivalis
tratamiento sobrenadante, la expresión de PAR-2 se upregulated comparación con las células control no tratadas. Por el contrario, PAR-1 y PAR-3 de expresión se downregulated significativamente. Los datos se muestran como la media con la desviación estándar (media ± SD). *, P Hotel & lt; 0,05, en comparación con los valores de control. Control: sin estimulación sobrenadante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
sobrenadante
Pars expresión de la proteína evaluada por citometría de flujo
La citometría de flujo mostraron expresión de la proteína de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 por GECS, pero sin PAR-4 expresión (Fig. 4). Después de P. gingivalis
tratamiento sobrenadante de 6 h, la expresión de la proteína de PAR-2 se upregulated comparación con las células de control no tratados (P
& lt; 0.05; Fig. 5). Por el contrario, los niveles de proteína de PAR-1 y PAR-3 fueron regulados a la baja significativamente después del tratamiento (P Hotel & lt; 0,05). Los resultados de la citometría de flujo indican los niveles de proteína PAR consistentes con los niveles de mRNA en el resultado de QRT-PCR. Higo. el nivel 4 de la proteína de Pars en GECS por citometría de flujo. a, b, c y d muestran los resultados representativos de los análisis de la citometría de flujo de PAR-1, PAR-2, PAR-3 y PAR-4, respectivamente. El resultado mostró GECS expresó PAR-1, PAR-2 y PAR-3, pero no PAR-4. línea de negro: control de isotipo. línea verde: anti-PAR
Fig. 5 PAR-1 (a), PAR-2 (b) y PAR-3 (c) expresión de la proteína en respuesta a P. gingivalis
sobrenadante. expresión PARs se evaluó por citometría de flujo en respuesta a sobrenadante libre de células de P. gingivalis y
sobrenadante TLCK-preincubado en GECS. Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un FACScan. Después de P. gingivalis
tratamiento sobrenadante de 6 h, la expresión de PAR-2 se upregulated comparación con las células control no tratadas. Por el contrario, PAR-1 y PAR-3 de expresión se downregulated significativamente después del tratamiento. Los datos se muestran como la media con la desviación estándar (media ± SD). *, P Hotel & lt; 0,05, en comparación con los valores de control. Control: sin estimulación sobrenadante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
sobrenadante
Discusión
La periodontitis es una infección de los tejidos periodontales que son la estructura de apoyo para los dientes. En la estructura compleja de los tejidos periodontales, el epitelio gingival está directamente expuesta a las bacterias periodontales y sus productos, mediante la recepción y transmisión de señales, juega un papel importante en el diálogo global que se produce entre los patógenos y el anfitrión. PARs se expresan y función en GECS como una parte del sistema de vigilancia por inmuno. Estos receptores son claramente importantes para las respuestas GECS para el medio ambiente que pueden incluir productos de patógenos o fisiológicas.
Cuatro miembros de la familia PAR (PAR-1, -2, -3, y -4) se han identificado hasta el momento. En este estudio se demostró que la IAP-1, PAR-2 y PAR-3 se expresan en GECS, pero PAR-4 no se expresa en GECS. Muchos investigadores ya han informado de la expresión de PAR en una amplia variedad de tipos de células, mientras que no hubo controversia acerca de la expresión de PAR [2, 3, 13, 17]. También hay algunos estudios sobre la expresión de PAR en GECS, pero la mayoría de los estudios se refiere a la expresión y el papel de PAR-2. La sobreexpresión de PAR-2 se ha asociado positivamente con los parámetros clínicos inflamatorios y con los niveles de interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor de necrosis tumoral alfa, metaloproteasa de matriz-2 (MMP-2), MMP-8, factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento endotelial vascular [5, 24, 25]. Sólo una investigación encontró PAR-1, PAR-2 y PAR-3 en las células KB por RT-PCR y PAR-1, PAR-2 y PAR-3 en GECS por estudios inmunohistoquímicos [17]. En nuestro estudio, RT-PCR y la citometría de flujo se utilizaron para analizar la expresión de PAR. Los resultados se corroboraron el PAR-1, PAR-2 y PAR-3 en GECS. Hoteles en epitelio gingival, arginina-cisteína proteasas específicas (Arg-gingipain, RGP) de P. gingivalis
, un patógeno importante asociada con periodontitis crónica, activar PARs y inducir la expresión de citoquinas inflamatorias [22, 26, 27]. La familia PAR es estructuralmente no relacionado con la familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), pero, al igual que los RRP, señalan peligro potencial en el medio ambiente mediante la activación de marcadores inmunes innatas y las respuestas inflamatorias [28]. Sin embargo, se sabe poco acerca de su función cuando son activados por sus enzimas agonistas, trombina y enzimas de tipo tripsina o de tipo tripsina, en el epitelio gingival. PARs se expresan por una amplia variedad de tipos de células y se sugieren para desempeñar papeles importantes en procesos fisiológicos, tales como el crecimiento, el desarrollo, la inflamación, la reparación tisular y dolor [29]. Nuestro estudio demostró que la expresión de PAR-2 se upregulated con P. gingivalis
tratamiento sobrenadante en comparación con células control sin tratar. Por el contrario, PAR-1 y PAR-3 de expresión fue significativamente downregulated, después de P. gingivalis
tratamiento sobrenadante. De hecho, la activación de PAR-2 se ha asociado con varias enfermedades inflamatorias crónicas [3, 30-32]. Además, in vitro y en estudios in vivo han sugerido claramente que PAR-2 también desempeña un papel en la inflamación periodontal [15, 16, 33, 34]. la activación de PAR-1, a través de la trombina o hecho por el hombre activación de péptidos, ha sido implicado como un regulador potencial de tanto el dolor y la inflamación [35-37]. Un estudio reciente mostró también que PAR-1 se expresa en los tejidos gingivales [18] y PAR-1 de activación por la trombina puede jugar un papel en la reparación y la homeostasis de los tejidos periodontales [38]. El papel de PAR-3 es de interés ya que la función de este receptor no señalización aparentemente sigue siendo oscuro [9, 39, 40]. La capacidad de PAR-3 para generar una señal intracelular también permanece en duda debido a que carece del dominio de cola citoplásmica se muestra en otros PARs, que se requiere para acoplar con proteínas G [9]. Un estudio reciente ha demostrado que el PAR-3 es un determinante crítico de PAR-1 función y PAR-3 puede mitigar los efectos de PAR-1 en la activación de las respuestas endoteliales, tales como la inflamación vascular [41]. PAR-3 regula la señalización del receptor de PAR1 mediante dimerización. Ha habido controversia sobre el papel de los PAR. En algunos tejidos que desempeñan un papel proinflamatorio [42], mientras que en otros tejidos que parecen tener un efecto anti-inflamatorio o de protección [43]. Esta función de protección puede ser facilitada por la regulación al alza de PAR-2 y la regulación a la baja de PAR-1 y PAR-3 de la expresión génica en respuesta a P. gingivalis
proteasas. Sin embargo, se requieren estudios adicionales para dilucidar plenamente las funciones de PAR-1, PAR-2 y PAR-3 en la patogénesis de la periodontitis.
Conclusiones Francia El estudio descrito aquí confirma el papel de PAR-1, PAR -2 y PAR-3 en las respuestas epiteliales gingivales que pueden estar relacionados con la inflamación periodontal. En consecuencia, los mecanismos detallados que subyacen a los efectos mediados por las principales PAR en la periodontitis, incluyendo su correlación con citoquinas, requieren más investigación. Esta información proporcionará una mejor comprensión de la evolución de las enfermedades periodontales e informar a la estrategia para la identificación de enfoques terapéuticos para estas condiciones.
Declaraciones
Agradecimientos
Agradecemos a los dentistas (Departamento Dental, Sir Run Run Shaw el hospital de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang) por su asistencia. Agradecemos al Dr. Yu Yunsong y su equipo de investigación (Departamento de Enfermedades Infecciosas, Sir Run Run Mostrar el Hospital de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81000447)
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de la competencia. intereses
Los autores declaran que no tienen ningún interés en competencia.
contribuciones de los autores Dr.
Zhang realizó los experimentos y escribió el manuscrito. El Dr. Li estaba a cargo de la recogida de los tejidos gingivales. El Dr. Hu ayudado a realizar los experimentos. El Dr. Sheng fue responsable de análisis de datos. Prof. Chen concebido y diseñado los experimentos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
