del ligamento periodontal
Resumen Antecedentes
Los resultados de estudios en animales y humanos han indicado que una suspensión de hidróxido de calcio oleoso (OCHS) puede mejorar la cicatrización de heridas temprana en el tratamiento de la periodontitis. El hidróxido de calcio como componente principal es bien conocido por su actividad antimicrobiana, sin embargo en la actualidad el efecto de OCHS sobre la influencia de cicatrización de la herida periodontal /regeneración es todavía muy limitada. El propósito de este estudio in vitro fue investigar el efecto de OCHS en bacterias periodontopatogénicas, así como en la fijación y proliferación de osteoblastos y fibroblastos del ligamento periodontal.
Métodos
osteoblastos humanos alveolares (HAO) y ligamento periodontal (PDL ) fibroblastos se cultivaron en 3 concentraciones de Ochs (2,5, 5 y 7,5 mg). La adhesión y la proliferación se contaron hasta 48 h y la mineralización se ensayó después de 1 y 2 semanas. Además potencial actividad inhibidora del crecimiento de microorganismos asociados a la enfermedad periodontal (por ejemplo, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia
, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
), así como la influencia de periodontopatógenos y OCHS en los recuentos de Hao y PDL fibroblastos fueron determinados.
resultados
Más que un aumento de 2 veces en las células HAO adherentes se observó a las 4 h después de la aplicación de OCHS en comparación con el grupo control (p = 0,007 para 2,5 mg). La proliferación de células HAO en 48 h fue estimulado por concentraciones moderadas (2,5 mg; 5 mg) de OCHS (cada p & lt; 0,001), mientras que una alta concentración (7,5 mg) de OCHS era inhibitoria (p = 0,009). La mineralización se observó sólo para las células tratadas con HAO OCHS. OCHS no ejerció ningún efecto positivo sobre el apego o la proliferación de fibroblastos PDL. Aunque OCHS no tuvo un efecto antibacteriano, que tuvo una influencia positiva apego y la proliferación de células de fibroblastos Hao y PDL en presencia de periodontopatógenos.
Conclusiones
Los datos actuales sugieren que OCHS promueve la unión de los osteoblastos, la proliferación y la mineralización en una dependiendo de la concentración y los resultados se mantienen en la presencia de patógenos periodontales
Palabras clave
suspensión oleosa hidróxido de calcio osteoblastos alveolares humanos fibroblastos del ligamento periodontal periodontopatógenos Electrónico material complementario
la versión en línea de este artículo (doi:. 10. 1186 /1472-6831-14-9) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes
la periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica inducida por bacterias, y un desequilibrio del sistema inmune innato defensa contribuye notablemente a la destrucción del periodonto [1]. Un pequeño grupo de anaeróbico predominantemente gram-negativa o bacterias microaerofílicas dentro de la placa está asociada con el inicio y la progresión de la periodontitis. Organismos fuertemente implicados como agentes etiológicos de la periodontitis incluyen Aggregatibacter Actinobacillus
, Porphyromonas gingivalis
, Tannerella forsythia Opiniones y Treponema dentícola
[2]. Por otra parte, otras especies tales como Campylobacter rectus
, Eubacterium nodatum
, Fusobacterium nucleatum
, Prevotella intermedia
, micra Parvimonas, Streptococcus Constellatus
apoyo patogénesis de la enfermedad [2, 3]. Las bacterias interactúan con las células huésped resulta en la expresión de mediadores inflamatorios, la transición de los neutrófilos polimorfonucleares a la grieta gingival [1, 4]. Anfitrión respuesta contribuye a la destrucción del tejido y la resorción ósea con el mecanismo principal de la proporción de RANKL (receptor-ligando activador de factor nuclear-kB) a osteoprotegerina [1].
Ha sido bien documentado que la resolución de la inflamación y detener de progresión de la enfermedad puede ser predecible obtenido con la terapia periodontal no quirúrgico quirúrgico y convencional [5]. sin embargo, el objetivo final de la terapia periodontal es la regeneración de las estructuras de soporte del diente perdido debido a la enfermedad periodontal y debe dar lugar a la formación de nuevo cemento radicular, ligamento periodontal y el hueso [6]. El tratamiento con membranas de barrera solos o en combinación con diferentes materiales de injerto, el uso de sustancias activas biológicas tales como proteínas de la matriz del esmalte o factores de crecimiento han demostrado promover la regeneración periodontal y para mejorar significativamente los resultados clínicos evidenciados por reducción de la profundidad, la ganancia de inserción clínica y relleno de defectos [7]. Algunos de los materiales se han descrito para actuar antimicrobiano, por ejemplo
., Derivados de la matriz del esmalte inhiben el crecimiento de P. gingivalis
[8]. Un estudio que analiza la influencia de cinco biomateriales diferentes utilizado para la cirugía periodontal regenerativo contra dos A. actinomycetemcomitans
mostraron actividad antimicrobiana de dos materiales contra una de las dos cepas ensayadas, la mayor parte inhibidora era una suspensión de hidróxido de calcio aceitosa [9].
Esta aceitosa de hidróxido de calcio que contiene pasta (OCHS) (Osteora®, previamente Osteoinductal®, DFS-Diamon GmbH Riedenburg, Alemania) se ha sugerido que poseen propiedades que pueden afectar positivamente periodontal curación de heridas /regeneración de [10-14]. Se basa en el hidróxido de calcio (Ca (OH)
2) y utiliza una sustancia de soporte que consiste en producido sintéticamente pedum oleum porcino y vaselina blanca. El hidróxido de calcio, un polvo blanco, inodoro y con una baja solubilidad en agua, tiene propiedades antibacterianas por la liberación de iones hidroxilo altamente reactivos en fluidos acuosos que daña las membranas citoplasmáticas, proteínas y ADN [15]. En el tratamiento de endodoncia se utiliza como un agente de recubrimiento pulpar [16], como un desinfectante para el tratamiento de conducto [17] y para apexificación después de pulpa de muerte [18]. En la pulpa, una necrosis superficial inducida por el pH alto se produce con una respuesta inflamatoria suave y la formación de tejido duro en el medio ambiente [19].
Varios estudios en animales que han evaluado los efectos de OCHS en la regeneración ósea en varios tipos de defectos arrojado resultados diferentes [10, 11, 20, 21]. En un modelo de regeneración ósea guiada mediante bóveda craneal minipig, OCHS no pudo ejercer propiedades osteoinductoras y la curación del hueso obstaculizado cuando se utiliza junto con la regeneración ósea guiada [22]. Además, la curación de implantes endoóseos no mejoró cuando aquellos se insertaron junto con OCHS [21]. Por otra parte, la aplicación de OCHS durante la fase de osteotomía de distracción osteogénesis mejorada formación de nuevo hueso [10], mientras que en los defectos periodontales intraóseos experimentalmente creados, la aplicación de OCHS en conjunto con la cirugía de colgajo acceso promovió la regeneración periodontal [11].
relacionados con la cicatrización de heridas y la regeneración en los pocos estudios clínicos. En un estudio, OCHS mejorado temprana de la herida de curación cuando se utiliza junto con la terapia no quirúrgica [12]. En otro ensayo clínico controlado evaluar la cicatrización de los defectos intraóseos tratados con cirugía de colgajo de acceso con y sin Ochs, significativamente más alta de bolsillo profundidades reducciones y aumentos clínicos nivel de inserción fueron encontrados en los defectos tratados llenos de OCHS en comparación con los controles (es decir, cirugía de colgajo de acceso por sí solo ) [13]. Por el contrario, otro estudio clínico controlado reciente utilizando un diseño similar no ha demostrado ninguna resultados superiores tras la aplicación de OCHS en comparación con la cirugía de colgajo de acceso por sí solo [23].
Aunque mucha investigación se ha obtenido en modelos animales y clínicos , el conocimiento de su modo de acción y los efectos sobre las células del ligamento periodontal (PDL), osteoblastos formadores de hueso, así como los microbios orales es todavía limitada. El objetivo del presente estudio fue doble; 1) Para determinar un potencial actividad antimicrobiana de OCHS incluidos sus componentes contra especies bacterianas implicadas en la patogénesis de la periodontitis y 2) para determinar el efecto sobre la unión y la proliferación de las células huésped (fibroblastos del ligamento periodontal y osteoblastos).
Métodos
Las sustancias de ensayo se utilizan
Ochs (Osteora®, DFS-Diamon GmbH, Riedenburg, Alemania). De acuerdo con la información del fabricante que se compone de 20% w /w de Ca (OH) 2, 40% pedum oleum y el 40% vaselina blanca. En el diseño experimental el uso de OCHS sí, así como Ca (OH) pedum 2 y oleum se utilizaron como sustancias de ensayo.
Determinación de la eficacia antimicrobiana de suspensión de hidróxido de calcio aceitosa
Las siguientes especies se han probado en los ensayos antimicrobianos: F. nucleatum
ATCC 25586, P. intermedia
ATCC 25611, P. gingivalis
(ATCC 33277 y tres aislados clínicos), T. forsythia
ATCC 43037, A. actinomycetemcomitans gratis (Y4 y tres aislados clínicos), C. rectus
ATCC 33238, Eikenella corrodens
ATCC 23834, E. nodatum
ATCC 33099, P. micra
ATCC 33270, y Capnocytophaga gingivalis
ATCC 33624. Todas las cepas se precultivadas a 37 ° C en condiciones adecuadas (anaeróbico a excepción de A. actinomycetemcomitans
- 5% de CO 2) 42 h antes de los experimentos. Modificado agar de soja tríptico [24] se utilizó como medio de cultivo.
En primer lugar, se utilizó la técnica de dilución de micro-caldo para determinar las CIM. Después de subcultivo de cepas bacterianas, se añadió un inóculo definido (McFarland 0,5) en una proporción de 1: 9 a caldo que contiene las sustancias de ensayo. Oleum-pedum (solubilizaron con Tween 20 en una relación 1: 1) se probó en una concentración de 0,625% - 20%, Ca (OH) 2 en una concentración de 3,13 mg /ml - 100 mg /ml adaptado para la concentración disponible en OCHS. En las pruebas de experimentos pedum oleum, cada tubo de ensayo contenía 20% de Tween 20. Después de un tiempo de incubación de 42 h (18 h aerobios), el crecimiento de microbios se analizó mediante comprobación visual de la turbidez y subcultivo. Para OCHS agentes como disolvente DMSO, Tween 20 y diferentes aceites han sido probados, pero era imposible para solubilizar OCHS. Por lo tanto, los métodos estándar para la determinación de la actividad antimicrobiana frente a bacterias anaerobias y otros microorganismos de crecimiento lento (microcaldo-dilución, agardilution) no eran aplicables. Finalmente se usó un método de difusión en agar modificado de la siguiente manera: El cien por l de suspensión bacteriana (MacFarland 0,5) se extendieron en placas de agar (agar Wilkins Chalgren suplementado con sangre de 5%). A continuación, cada dos huecos se prepararon usando un perforador de corcho (diámetro 7 mm). Después de eso, la brecha se llena con 100 l de agar, seguido de la sustancia de ensayo (50 mg y 100 mg de OCHS). Después de incubación a 37 ° C en la atmósfera anaerobia durante 42 h, se midieron las zonas de inhibición.
A excluir un efecto promotor del crecimiento de OCHS, las suspensiones de cepas bacterianas seleccionadas (P. gingivalis ATCC 33277
, P. gingivalis
M5-1-2, A. actinomycetemcomitans
Y4 y F. nucleatum
ATCC 255866) se añadieron a 200 l de caldo nutriente añadido con 50 mg de OCHS (20% w /v). Tubos habían incubado durante 24 h en condiciones anaerobias. Inmediatamente antes de la eliminación de 25 l de mezcla, las suspensiones se mezclaron por agitación y centrifugación breve a 400 g
. Los extraído 25 l se diluyeron en serie y cada uno de 100 l se sembraron en placas de agar. El número de bacterias viables se determinaron contando el unidades formadoras de colonias (ufc).
Efecto de la suspensión de hidróxido de calcio aceitosa en osteoblastos y fibroblastos del ligamento periodontal
En la segunda parte del estudio, los osteoblastos alveolares humanos (HAO) como así como se utilizaron fibroblastos PDL humanos. Ambos tipos de células se obtuvieron de tres pacientes periodontalmente sanos durante la cirugía (extracción de los dientes por razones de ortodoncia). astillas óseas humanas fueron cultivadas a partir de un modelo de explante como se describe anteriormente [25, 26]. Después de la digestión con colagenasa, las células se sembraron HAO en matraces T-75 que contenían medio de cultivo celular (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen). células PDL se recogieron de la tercera porción media del diente y se colocaron en matraces T-25 de cultivo de células hasta una confluencia celular [27]. El medio de cultivo era DMEM suplementado con 10% FBS. Para los experimentos, ambos tipos de células se utilizaron de pasajes 4-6. La identidad de las células se confirmó como se describe recientemente [26, 27]. Usando el tejido con fines de investigación fue aprobado por la comisión ética del Cantón de Berna. Todos los pacientes dieron su consentimiento.
En los experimentos, los portaobjetos se colocaron en placas de 24 pocillos y se cubren con las sustancias de ensayo. Las sustancias de ensayo se OCHS en tres concentraciones diferentes (1 U, 2 U, 3 U). 1 U representado 2,5 mg de material total (es decir, 2 U es equivalente a 5 mg y 3 U a 7,5 mg). Además, se usa hidróxido de calcio en solución acuosa (1,5 mg correspondiente a 3 U de OCHS) y la sustancia oleum pedum (3 mg correspondiente a 3 U de OCHS). diapositivas descubierta sirvieron como controles negativos. Inmediatamente después, se añadieron células HAO a una densidad de 10.000 células /pocillo y los pocillos se incubaron a 37 ° C con 5% de CO 2. Las células se fijaron y se tiñeron para adhesión y proliferación experimentos a 2 h, 4 h, 24 y 48 h utilizando tinción DAPI. La diferenciación celular se analizó por determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina y la mineralización mediante el uso de 2% de alizarina S tinción con rojo de 1 y 2 semanas post-siembra. Cada 10 campos de 1 mm 2 se contaron. Los campos fueron seleccionados distribuyen por igual entre toda la diapositiva. Una rejilla de recuento se utilizó y cada subcampo (50 m x 50 m) con tinción positiva para nódulos de calcio se contó en relación con el número total de subcampos; la media fue utilizado como un único valor para el análisis. La mineralización se midió 1 y 2 semanas después de comenzar los experimentos. Para garantizar que sólo la mineralización de las células se contó, OCHS sin células se utilizó como control negativo.
Manera similar a las células Hao, se determinaron los efectos sobre los fibroblastos PDL. Los portaobjetos que han sido colocados en placas de 24 pocillos se cubren con las sustancias de ensayo. se añadieron fibroblastos PDL a una densidad de 10.000 células /pocillo. Las células se fijaron y se tiñeron para la adhesión y para experimentos de proliferación en 2 h, 4 h, 24 h y 48 h utilizando tinción DAPI como se describe para las células Hao.
Determinación del efecto de la suspensión de hidróxido de calcio aceitosa en PDL fibroblastos y osteoblastos interacción con microorganismos
la concentración de 2 U (5 mg) OCHS fue seleccionado y se coloca en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para los experimentos que se centran en la interacción de células huésped con cepas bacterianas.
células Hao y fibroblastos PDL respectivamente se sembró en las diapositivas con y sin cobertura de 2 U de OCHS. A. actinomycetemcomitans
Y4, así como la combinación de P. gingivalis ATCC 33277
, se añadieron T. forsythia
ATCC 43037 y T. dentícola
ATCC 35405. La carga bacteriana fue siempre 10 6 por pocillo. Las células Hao y fibroblastos PDL respectivamente se fijaron y tiñeron a las 4 h.
El análisis estadístico
Con excepción de los ensayos de antimicrobianos (repeticiones independientes) al menos seis experimentos independientes se realizaron por grupo. Más de dos grupos independientes se compararon mediante ANOVA de una vía seguido por un análisis post hoc LSD para la comparación con los controles (actividad de OCHS y sus componentes en las células Hao y fibroblastos PDL). El análisis estadístico se realizó mediante el uso de la prueba t de Student para dos muestras independientes (efecto de OCHS sobre las células HAO interacción '' y PDL fibroblastos de interacción con las bacterias).
: Resultados de la suspensión de hidróxido de calcio aceitosa no actúa antibacteriano
los valores de CIM de pedum oleum e hidróxido de calcio (los componentes principales de OCHS) se presentan en la Tabla 1. Mientras que pedum oleum no ejerció ningún efecto antibacteriano, Ca (OH) 2 fue inhibitoria; los valores de MIC fueron en el intervalo de 6,25 a 25 mg /ml.Table 1 concentraciones mínimas inhibidoras de los componentes de Ochs (pedum oleum porcino e hidróxido de calcio) determinada por la técnica de dilución de caldo de micro-
La porcino oleum-pedum
Ca (OH) 2
F. nucleatum
ATCC 25586
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P.
intermedia ATCC 25611
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P. gingivalis ATCC 33277
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
M5-1-2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
J430-1
& gt; 20%
25 mg /ml
P. gingivalis
Marl
& gt; 20%
25 mg /ml
T. forsythia
ATCC 43037
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. Actinobacillus
Y4
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. Actinobacillus
J1
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. Actinobacillus
J2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. Actinobacillus
J7
& gt; 20%
25 mg /ml
C. recto
ATCC 33238
& gt; 20%
12,5 mg /ml
E. corrodens
ATCC 23834
& gt; 20%
50 mg /ml
E. nodatum
ATCC 33099
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. micra
ATCC 33270
& gt; 20%
25 mg /ml
C. gingivalis ATCC 33624
& gt; 20%
12,5 mg /ml
Como se mencionó en los materiales y métodos, debido a la insolubilidad de Ochs, se utilizó una técnica de difusión en agar modificado para determinar un posible efecto antimicrobiano de OCHS. Estos experimentos, sin embargo, no revelaron ninguna zona de inhibición por OCHS en las dos concentraciones ensayadas. Los experimentos finales cultivo de suspensiones bacterianas en caldo nutritivo subrayaron que OCHS no influye en el crecimiento de periodontopatógenos de ninguna manera. Ni el crecimiento ni suprime el efecto promotor del crecimiento eran visibles; diferencias a controles fueron siempre por debajo de 0,2 log 10 ufc (datos no mostrados). Se ha de señalar que, debido a la insolubilidad de OCHS, los tubos contenían dos capas; uno de OCHS y uno de caldo. Así, sólo en los compuestos de interfaz liberados de OCHS podrían interferir con bacterias.
Suspensión de hidróxido de calcio oleosa puede promover la adhesión de osteoblastos y mineralización pero no afecta a la adhesión y proliferación de fibroblastos PDL
adición de OCHS promovido la unión de las células HAO . Después de 2 h, 11.00 ± 4.90 células /mm 2 adheridas a una superficie cubierta con 2 U de OCHS. El uso de 3 U el valor fue de 11,67 ± 2,89 células /mm 2. Estas diferencias fueron significativas en comparación con el control, donde se encontraron 6.57 ± 3.55 células HAO por mm 2 en la superficie. Después de 4 h, 20.33 ± 14.13 HAO células /mm 2 fueron contados después de la cobertura con 1 U de OCHS y 18.11 ± 6.66 HAO células /mm 2 cuando 3 U de OCHS se utilizaron siendo significativamente diferente de los controles ( 8.67 ± 3.50 células HAO /mm 2). la proliferación estimulada fue encontrado 48 horas después de comenzar los experimentos y la cobertura con 1 U y 2 U de Ochs (1 U: 46.00 ± 13.11 HAO células /mm 2, 2 U: 46,67 ± 18,23 células HAO /mm 2 en comparación con el control: 26.89 ± 7.25 células HAO /mm 2). En contraste con el 1 U y 2 U de OCHS, la alta concentración de 3 U inhibió significativamente la proliferación de células HAO (13,44 ± 5,20 HAO células /mm 2). Una influencia del Ca utilizado (OH) 2 concentración no estaba registrado. La cobertura con pedum oleum fue seguido por una disminución del número de células 24 h después de la adición de las células. Los resultados incluidos los valores significativos se presentan en la Figura 1. Figura 1 Adjunto y la proliferación de A) y B HAO células fibroblastos) PDL (media y DE) cada uno después de la cobertura con diferentes cantidades de suspensión de hidróxido de calcio (aceitosa OCHS), así como 1,5 mg Ca (OH) 2 y 3,0 pedum oleum mg (valores de p en comparación con los controles se determinaron por análisis de LSD post Hoc después de ANOVA).
También se analizó la diferenciación y la mineralización de las células HAO. En todos los experimentos sólo se encontraron células teñidas positivamente HAO para la fosfatasa alcalina. Sin adición de OCHS, no mineralización estaba presente en la superficie. Cuando la superficie se cubrió con OCHS, la mineralización extracelular de HAO era detectable después de una semana (5,57 ± 1,97% de área manchada; Figura 2). La cantidad no cambió significativamente después de dos semanas (4,12 ± 1,59%). Figura 2 mineralización de células teñidas con rojo de alizarina una semana después de la siembra de células HAO. La mineralización es visible por el color rosado (→), A) las células no tratadas HAO, B) Las células se sembraron en HAO OCHS.
La adición de OCHS no tenían ninguna influencia significativa en la unión de los fibroblastos PDL. reducción de la proliferación fue encontrado 48 horas después de comenzar los experimentos y la cobertura con 3 U de Ochs (13.22 ± 4.12 PDL fibroblastos /mm 2) en comparación con los controles (33,89 ± 17,48 PDL fibroblastos /mm 2). Por el contrario, Ca (OH) 2 estimula la proliferación de fibroblastos PDL (53.44 ± 15.22 PDL fibroblastos /mm 2 en comparación con los valores de control a los 48 h de duración punto (Figura 1). Los resultados
sugerido un posible efecto citotóxico. por lo tanto, las células Hao y fibroblastos PDL se sembraron en portaobjetos cubiertos con las sustancias de ensayo como las células se incubaron durante 4 h y 48 h se ha descrito anteriormente.. a partir de entonces el porcentaje de células viables se determinó mediante la prueba de exclusión con azul de tripano.
Una notable mayor porcentaje de células muertas siempre fue encontrado después de un tratamiento previo con 1,5 mg de Ca (OH) 2 en comparación con los controles (cada p & lt; 0,001). La viabilidad de las células determinados por la prueba de exclusión de tripan cambiado ligeramente después del pretratamiento con OCHS, la diferencia con los controles no tratados fue significativa para los fibroblastos PDL 4 h después de comenzar los experimentos (Figura 3). Figura 3 Porcentaje de a viable) células Hao y B) fibroblastos PDL (media y SD) después de la cobertura con diferentes cantidades de suspensión aceitosa de hidróxido de calcio (OCHS), así como 1,5 mg de Ca (OH) 2 y 3,0 mg pedum oleum determinada por prueba de exclusión de tripan (valores de p en comparación con los controles se determinaron por análisis de LSD post Hoc después de ANOVA).
bacterias no interfieran con el efecto de la suspensión de hidróxido de calcio aceitosa en la adhesión y la proliferación de osteoblastos y fibroblastos PDL México La adición de bacterias no cambió significativamente el número de células adheridas HAO cuando los portaobjetos se cubrieron con 2 U de OCHS. Si A. actinomycetemcomitans
Y4 estaba presente, un aumento de las células HAO con 2 U de Ochs (25,08 ± 10,04 HAO células /mm 2) todavía era significativo en comparación con los que no tienen Ochs (controles). Sorprendentemente, la adición de bacterias mejorado el número de células HAO adjuntos (A. actinomycetemcomitans
Y4: 16.00 ± 4.44 células HAO /mm 2, P. gingivalis
, T. forsythia
, T. dentícola Hoteles en mezcla: 14.56 ± 4.07 células HAO /mm 2) siendo significativamente mayor que los controles (10,87 ± 8,43 HAO células /mm 2). El contacto con las bacterias no influyó significativamente en el número de fibroblastos PDL adjuntos (Figura 4). Figura 4 La unión de A) y B células HAO) fibroblastos PDL (media y DE) 4 h después de la cobertura con y sin suspensión aceitosa de hidróxido de calcio (OCHS) y la adición de A. actinomycetemcomitans Y4, así como la combinación de P. gingivalis ATCC 33277 , T. forsythia ATCC 43037, ATCC 35405 T. dentícola (valores de p en comparación con los controles y sin OCHS, respectivamente, cada uno se determinaron mediante la prueba t de Student).
Discusión y conclusiones
OCHS es una suspensión oleosa que contiene Ca (OH) 2 como el constituyente activo. Otros componentes son los Tauri oleum pedum producidos sintéticamente, un material de soporte que contiene triglicéridos incluyendo ácido de aceite, ácido palmitina, ácido hexadecen y vaselina blanca.
Un efecto antibacteriano por OCHS no se observó incluso en concentraciones muy altas mediante la realización de una versión modificada de la difusión en agar prueba. Sólo un estudio informó sobre los efectos de OCHS en periodontopatógenos. En ese estudio, OCHS actuó inhibitorio sobre A. actinomycetemcomitans
cepa ATCC 33384 (serotipo c), sin embargo no se observó ningún efecto antibacteriano después del cultivo de A. actinomycetemcomitans
cepa ATCC 43718 (serotipo b) con OCHS [9]. También se incluyeron en nuestro estudio de un aislado clínico perteneciente al serotipo c. En contraste con los resultados descritos anteriormente [9], no se observó ningún efecto antibacteriano después de la aplicación con OCHS en el presente estudio en cualquiera de las cepas probadas de A. actinomycetemcomitans
.
Debido a la insolubilidad del material, sólo fueron capaces de determinar las concentraciones inhibidoras mínimas de componentes individuales de OCHS por una técnica de dilución de micro-caldo. Se observó que aunque pedum oleum no tenía ningún propiedad antibacteriana, el uso de hidróxido de calcio en altas concentraciones, tales como los presentes en OCHS actuó como inhibidor del crecimiento. El hidróxido de calcio se utiliza ampliamente en el tratamiento de endodoncia y en pruebas in vitro demuestra que suprime el crecimiento de Candida albicans
[28] y algunas otras bacterias que crecen en condiciones anaerobias [29] aunque la eficacia antimicrobiana limitada ha traducido in vivo tras el análisis posterior de los conductos radiculares -Tratamiento [30, 31]. En nuestros ensayos in vitro, en contraste con el hidróxido de calcio, OCHS no tuvo ningún efecto antibacteriano que puede sugerir un efecto antagonista de los otros componentes de OCHS a hidróxido de calcio. Debido a la naturaleza de la terapia periodontal, bacterias asociadas con periodontitis deben ser eliminados o reducidos en cualquier modalidad de tratamiento. La actividad antimicrobiana que falta de OCHS sugiere el uso adicional de un agente antimicrobiano, tal como clorhexidina. Por estas razones, la adición de 0,4% de CHX a una pasta de hidróxido de calcio no afectó a la biología celular osteoblástica in vivo [32].
En el presente estudio, se investigó los efectos de OCHS en HAO en el apego y la proliferación celular. Nuestros resultados demostraron una mayor comportamiento de las células después del cultivo con OCHS concentración y la sensibilidad demostrada. Bajo a moderado concentraciones de OCHS actuaron claramente estimulante, mientras que la aplicación con una concentración de 3U (7,5 mg) presentó en los resultados perjudiciales parte. Para retardar la liberación de Ca (OH) 2, OCHS contiene un alto porcentaje de pedum oleum. Investigamos HAO cuenta cultivaron en presencia de pedum oleum y encontramos una reducción en el comportamiento celular follwing su aplicación. pedum Oleum parece contrarrestar la actividad estimulante de Ca (OH) 2. En un modelo animal usando abiertas cápsulas de teflón, OCHS inhibe la formación de hueso y no se observó una resorción activa de OCHS [20]. Se puede sugerir que las propiedades degradables que faltan son ciertamente desde el pedum oleum y un efecto más pronunciado parece ser observada con concentraciones crecientes. Una segunda explicación lógica podría ser debido a la citotoxicidad de OCHS. Aunque pedum oleum impide la citotoxicidad de Ca (OH) 2, no se observaron efectos tóxicos a un cierto grado cuando se utilizó OCHS a altas concentraciones. Esto obvia la sensibilidad de la concentración utilizada podría explicar en parte los resultados reportados en diferentes estudios animales y clínicos. En consecuencia, después de nuestros primeros conjuntos de resultados de los experimentos, una concentración moderada fue elegido para los experimentos en curso en base a sus resultados positivos. El uso de esta concentración, un aumento de la mineralización de los osteoblastos se encontró 1 - 2 semanas después de la siembra con medios de cultivo que contienen OCHS. Recientemente se demostró que Ca (OH) 2 es capaz de estimular la expresión de ARNm de sialoproteína ósea y Runx2 [33]. Runx2 es un factor de transcripción esencial en la diferenciación de osteoblastos [34] y sialoproteína ósea es un marcador tarde para la diferenciación de osteoblastos encontrado durante el proceso de mineralización de los osteoblastos [35].
A pesar de los efectos estimulantes de OCHS sobre los osteoblastos, OCHS no ejerce ningún efecto positivo sobre el apego o la proliferación de fibroblastos PDL. De manera similar a nuestros experimentos Hao, la concentración utilizada más alto de OCHS también redujo la proliferación de los fibroblastos PDL después de 48 h. Proliferación de fibroblastos PDL fue inducida por Ca (OH) 2 como se ha descrito recientemente; pero en contraste con nuestros resultados, OCHS también tuvo un efecto estimulante sobre la proliferación en este estudio [36]. En un estudio similar [14] estos autores encontraron alta unión de los fibroblastos PDL sobre superficies radiculares OCHS tratados. Las investigaciones futuras para determinar los mecanismos que influyen en la unión de las células a través de la unión a integrina y sus mecanismos moleculares intermedios en células huésped (por ejemplo
. vías celulares) debe investigarse.
después de la comprobación experimental de OCHS con las células del periodonto, un co sistema -cultura fue diseñado para determinar la influencia de OCHS en las células expuestas a los patógenos periodontales simultáneamente para simular un entorno clínico. La exposición de células Hao y fibroblastos PDL a periodontopatógena bacterias no influyen negativamente en el efecto promotor de OCHS en el apego y la proliferación de estas células. Por lo tanto, los resultados de este experimento demuestran el uso potencial de OCHS incluso en la presencia de patógenos periodontales sin afectar el beneficio potencial de OCHS. Sorprendentemente, la adición de bacterias mejorado el número de células HAO adjuntos. Este resultado debe tomarse con precaución y podría estar asociado con las condiciones de cultivo in vitro. El efecto fue especialmente pronunciado cuando A. actinomycetemcomitans
se utilizó. El potencial citotóxico de periodontopatógenos es bien conocida. Gingipains son responsables de la mayoría de la actividad proteolítica de la P. gingivalis
[37] y son capaces de inhibir la proliferación de osteoblastos, causando la detención en G1 temprana en el ciclo celular [38]. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
