médula ósea
Resumen Antecedentes
Los estudios preclínicos apoyan la hipótesis de que los injertos de tejido conectivo preservar el hueso alveolar de reabsorción; los mecanismos celulares subyacentes, sin embargo, siguen siendo desconocidos. Los mecanismos celulares pueden ser atribuidos a la actividad paracrina de los fibroblastos palatinas. Era por lo tanto razonable sugerir que los injertos de tejido conectivo del paladar reducen la formación de osteoclastos.
Métodos
Para probar esta hipótesis, los fibroblastos palatinas humanos fueron examinados por su capacidad para modular la formación de osteoclastos en cultivos de médula ósea murina expuestas a RANKL, M-CSF y TGF-β1. Osteoclastogénesis se determinó por la fosfatasa resistente al tartrato ácido (TRAP) tinción y análisis de la expresión génica. La formación de las células presentadoras de antígeno se basa en la expresión de CD14 y las moléculas de costimmulatory de células presentadoras de antígeno. La interacción paracrina de fibroblastos y la médula ósea fue modelado in vitro con inserciones de las membranas de células oclusiva.
Resultados
En cocultivos sin contacto de célula a célula, palatinas fibroblastos causaron una disminución en la expresión del marcador de osteoclastos genes en células de médula ósea; receptores de calcitonina, la catepsina K, TRAP, y los receptores de los osteoclastos asociada. También se redujo el número de células multinucleadas TRAP positivas en presencia de fibroblastos. En particular, los fibroblastos palatinas aumentaron la expresión de CD14 y las proteínas co-estimuladoras CD40, CD80, y CD86 en células de médula ósea. células de médula ósea no tuvieron un impacto considerable sobre la viabilidad de fibroblastos y la proliferación de genes marcadores. Con respecto a la distribución de células, los osteoclastos eran más prominentes en el centro de las membranas, mientras que los fibroblastos acumulan inmediatamente adyacente a la frontera de la inserción de la formación de una estructura en forma de anillo en la superficie de la placa de cultivo.
Conclusión comentario El los datos sugieren que los fibroblastos palatinas proporcionan un entorno paracrina que reduce la osteoclastogénesis y aumenta los marcadores de células presentadoras de antígenos. Cabe agregar que, el modelo paracrina reveló una actividad conjunta entre los fibroblastos palatinas y las células de la médula ósea visualizados por la distribución celular característica en los dos compartimentos separados.
Palabras clave
fibroblastos palatales osteoclastos Los macrófagos Co-cultivo Inserta murino cultivos de médula ósea Antecedentes
palatales injertos de tejido conectivo que se utilizan en la periodoncia para la cobertura de la raíz y para el tratamiento de los defectos de recesión gingival [1]. También se han propuesto injertos de tejido conectivo del paladar para mejorar los parámetros estéticos cuando el hueso bucal es delgada o reabsorbido en implantología y prótesis [2-6]. Dependiendo de la técnica utilizada, injertos de tejido conectivo del paladar pueden ser colocados en contacto directo con el hueso alveolar. Se plantea la cuestión sobre el posible impacto de los injertos de tejido conectivo del paladar en el hueso alveolar. Hay apoyo al menos débil para un papel potencial de los injertos de tejido conectivo en la preservación del hueso subyacente. injerto de tejido conjuntivo situado en la cara vestibular de la pared ósea, inmediatamente después de la extracción del diente, se obtuvo un razonable preservación de los discos tejidos [7]. Por otra parte, gingivales injertos de tejido conectivo pueden reducir la resorción de la cresta marginal en modelos caninos [8]. Tomados en conjunto, ambos estudios preclínicos apoyan la hipótesis de que los injertos de tejido conectivo pueden preservar el hueso alveolar; el mecanismo celular subyacente sin embargo sigue siendo desconocido. comentario El mecanismo celular puede atribuirse a la actividad paracrina de los fibroblastos palatinas. Esta hipótesis está apoyada por los experimentos in vitro con fibroblastos gingivales aisladas y su capacidad para influir en la osteoclastogénesis, la formación de células de resorción ósea. Por ejemplo, el medio acondicionado obtenido a partir de fibroblastos gingivales y los fibroblastos del ligamento periodontal inhibir la formación de células similares a osteoclastos en cultivos de médula ósea de ratón [9-11]. Por tanto, es probable que los factores paracrinos liberados de fibroblastos palatinas pueden reducir el proceso de la osteoclastogénesis. Más intrigante es para comprender el mecanismo molecular de cómo los factores paracrinos liberados de fibroblastos palatinas cambian la expresión de genes que representan los osteoclastos, sino también la células presentadoras de antígenos, tanto las células precursoras hematopoyéticas FOM de origen.
Osteoclastogénesis en cultivos de médula ósea murina requiere las presencias de receptor activador del factor nuclear kappa-B ligando (RANKL), M-CSF, y los respectivos receptores [12]. Los osteoclastos típicamente son multinucleadas y expresan fosfatasa resistente al tartrato ácido (TRAP), la catepsina K (CatK) y el receptor de calcitonina (CTR). Los osteoclastos también expresan moléculas co-estimuladoras que activan el motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) ruta dependiente [13]. receptor de osteoclastos-asociado (OSCAR) y activación del receptor expresado en células mieloides (TREM2) son receptores que están asociados con las respectivas moléculas adaptadoras Fc cadena del receptor gamma común (FcRγ) y DNAX-activación de la proteína 12 kDa (DAP12), respectivamente [13] . Cuando la diferenciación se desplaza hacia un fenotipo de macrófagos, la expresión de CD14, un co-receptor para la señalización de lipopolisacárido, y las proteínas coestimuladoras CD40, CD80 y CD86, comúnmente se expresa en células presentadoras de antígeno tales como monocitos y macrófagos, aumento [14, 15].
el objetivo de este estudio piloto fue investigar el impacto del medio ambiente paracrina de fibroblastos palatinas en la osteoclastogénesis a partir de precursores de la médula ósea utilizando un modelo in vitro que ambas fuentes de células están separadas por membranas oclusivas celular.
Métodos
fibroblastos del paladar humano
fibroblastos humanos palatinas se prepararon a partir de cultivos de explantes de tres donantes independientes después de la aprobación del comité de ética de la Universidad de Medicina de Viena (. EK Nº 631/2007). Los fibroblastos que surgieron a partir de los explantes y no se habían sometido Se utilizaron más de cinco pasajes. Los fibroblastos se cultivaron en Dubeccos Modificado Medio Eagle (DMEM) con antibióticos (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.)) y se sembraron a 100.000 células /cm
2 en las respectivas placas de 12 pocillos (Greiner Bio-One GmbH) . Después del período de cultivo, la tinción de los fibroblastos se realizó con DiffQuik (Roche Diagnostic Systems, Basilea, Suiza). Cultivos de médula ósea murina
células de médula ósea se prepararon mediante el lavado fémur y la tibia de 4 a 8 semanas de edad ratones Balb /c (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Bern) y se sembraron en insertos de cultivo celular ThinCert ™ (12 formato bien con tamaños de poro nominales de 0,4, m; Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) a un millón de células por cm 2 en Medio esencial mínimo-Alfa modificación de Eagle (aMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), los antibióticos, M-CSF en 25 g /ml, TGF-β1 a los 10 g /ml, y RANKL en 25 g /ml. cultivos de médula ósea se transfirieron entonces a las placas que contenían los fibroblastos. Las proteínas recombinantes se adquirieron de Prospec (Ness Ziona-, Israel). células de médula ósea se cultivaron con y sin el fibroblasto. Ambos tipos de células permanecen separadas por la membrana oclusiva celular de los insertos de cultivo celular ThinCert ™. La tinción para TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) se llevó a cabo en el día cinco. Las células se consideran los osteoclastos cuando positivo para TRAP y que tiene tres o más núcleos como se observa por microscopía de luz.
La expresión de genes marcadores en cultivos de médula ósea murina
RNA fue aislado de los cultivos de médula ósea y de los fibroblastos palatinas utilizando el alto Pure RNA Kit de aislamiento (Roche Applied Science, Rotkreuz, Suiza). La transcripción inversa (RT) se realizó con Transcriptor universal cDNA Maestro, y PCR se realizaron análisis por triplicado utilizando TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) o el FastStart sonda Universal Master Rox en un sistema de PCR 7500 Real-Time ( Roche). Se analizaron las células de la médula ósea de los siguientes genes: SybrGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, c-Fos, MITF, PE1, NFATc-1, DC-STAMP, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD11C; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, TREM2, DAP12, FCRγ. Los fibroblastos se analizaron para los siguientes genes: BCL2, Plk1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX y BCL-XL. Los datos se normalizaron a β-actina utilizando el método ΔΔCt (Tablas 1 y 2) .table 1 SybrGreen Los cebadores para la RT-PCR de genes
Cebador directo
cebador inverso
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m RANK
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PE1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
m DC-sello
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h Plk1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tabla 2 Ensayo TaqMan Los cebadores de identificación para RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m CatK
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m TREM2
Mm 04209424_g1
m Dap12
Mm 00449152_m1
m FcRγ
Mm 02343757_m1
El análisis estadístico
Los cultivos celulares se realizaron utilizando al menos árbol diferente donantes de fibroblastos. Los dos grupos se compararon con el T-emparejado
prueba con α & lt; 5%.
Resultados
fibroblastos palatales inhiben las células similares a osteoclastos vía
Para determinar el impacto de los fibroblastos del paladar en la osteoclastogénesis, se realizó un modelo de co-cultivo paracrina sobre la base de las inserciones. Una conclusión principal fue que la presencia de fibroblastos palatinas en la cámara inferior disminuyó la expresión de los genes marcadores de osteoclastos típicos CTR, CATK, TRAP y Oscar en torno al 30% (p & lt; 0,05
), pero no el otro co moléculas estimulantes de la osteoclastogénesis. RANK y c-FMS también se mantuvieron sin cambios. Por otra parte, la tinción TRAP se redujo visiblemente en presencia de fibroblastos palatal. número de osteoclastos en cocultivo con fibroblastos por región de interés significa, seleccionados al azar en cada pocillo: 11,7 (SD 6,7). número de osteoclastos sin fibroblastos por región de interés media fue de 53,0 (SD 12,8; p & lt; 0,05
). Es importante destacar que, la presencia de fibroblastos palatinas aumentó la expresión de CD14 y las proteínas coestimuladoras CD40, CD80 y CD86 por alrededor de 2 a 4 veces (p & lt; 0,05
) en comparación con los controles respectivos sin la presencia de fibroblastos palatinas (Tabla 3). Por lo tanto, los datos apoyan el concepto de que los fibroblastos palatinas favorecen el desarrollo de las células presentadoras de antígenos en lugar de un fenotipo de los osteoclastos. células de médula ósea no afectaron la viabilidad o la proliferación de los fibroblastos del paladar, como se indica por el análisis de la expresión de genes relacionados con el ciclo de la apoptosis y de células (datos no presentados) .Tabla 3 RT-PCR de células similares a osteoclastos (OCL) en co -Cultura con fibroblastos paladar (PF) utilizando M-CSF, RANKL y TGF-β1 en comparación con los co-cultivos sin PF, con valores medios y desviación estándar
Target genes
CD14
CD40
CD80
CD86
CTR
CatK
TRAP
OSCAR
Mean
3.13
2.48
1.57
4.31
0.63
0.71
0.75
0.62
Standard Deviation
0.66
0.82
0.53
1.42
0.31
0.34
0.31
0.30
Los genes eran grupo de diferenciación 14, 40, 80 y 86 (CD), la calcitonina receptor (CTR), catepsina K (CatK), tartrato resistente a la fosfatasa ácida 5 (TRAP), similar a inmunoglobulina del receptor de osteoclastos-asociado (OSCAR). La tabla representa la desviación media y estándar de n = 6
resultante a partir de dos experimentos independientes con fibroblastos de tres donantes diferentes. Todos los valores medios fueron diferentes en comparación con los controles sin fibroblastos (p & lt; 0,05
)
distribución característica de los osteoclastos y palatal fibroblastos en los cultivos de fibroblastos de inserción
palatina tuvieron un impacto importante en la distribución de los osteoclastos. TRAP osteoclastos positivos fueron prominentes en el centro de la pieza de inserción (Fig. 1). Otro fenómeno ocurrió a la distribución de los fibroblastos palatinas. Los fibroblastos acumulan inmediatamente adyacente a la frontera de la inserción, formando un anillo de alta densidad celular (Fig. 1). Estas observaciones apoyan básicamente que palatal fibroblastos reducen la formación de osteoclastos en un modo paracrino de acción, pero también que las células de médula ósea pueden atraer fibroblastos in vitro. Así, el modelo paracrina basado en membranas oclusivas de células con células de médula ósea en los insertos y fibroblastos en el compartimiento inferior de la placa de cultivo reveló una actividad mutua visualizado por la distribución diferencial de células. Higo. 1 La tinción de los fibroblastos en pozos y células similares a osteoclastos en insertos después de la incubación de células de médula ósea murina durante 5 días con M-CSF, RANKL y TGF-β1 (MRT). culturas combinado con fibroblastos y osteoclastos (a1) mostraron una acumulación de los fibroblastos inmediatamente adyacentes a la frontera de la inserción, formando un anillo de los fibroblastos a una densidad celular elevada (a2, a3). Por otra parte, los fibroblastos palatal tenía un impacto importante en la distribución de los osteoclastos: osteoclastos eran prominentes en el centro de la pieza de inserción (a4, a5). En las culturas hubo fibroblastos estaban presentes (b1, b2, b3), el TRAP-tinción de las células similares a osteoclastos mostró una reducción en número y eran más uniformemente distribuida en comparación con las células de osteoclastos que tenían interacción con fibroblastos (b4, b5) Discusión
comentario el principal hallazgo de este estudio fue que los fibroblastos palatinas creado un ambiente moderadamente paracrina que suprime la osteoclastogénesis mientras se cambia la diferenciación hacia un fenotipo macrófago. genes maestros osteoclastos se downregulated en presencia de fibroblastos, mientras que los genes característicos para las células presentadoras de antígenos se upregulated. RANK y c-fms se mantuvo sin cambios lo que sugiere que el cambio de la diferenciación no puede ser explicado por una disminución en la capacidad de respuesta a los respectivos ligandos, con M-CSF ser crítico también para el desarrollo de monocitos. Por otra parte, se observó una característica de la distribución de células in vitro, con los osteoclastos restantes en los centros de las piezas de inserción, mientras que los fibroblastos se acumulan en una estructura de anillo.
Estos resultados in vitro son interesantes porque básicamente apoyan las observaciones de los estudios preclínicos que injertos de tejido conectivo reducen la resorción de la pared ósea bucal [7, 8]. No es sorprendente que la reducción de la osteoclastogénesis va junto con un cambio hacia las células presentadoras de antígenos. Similares observaciones se hicieron con saliva [15], y también la doxiciclina y la minociclina induce la expresión de marcadores de células dendríticas, CD11c y CD86, en células de médula ósea en presencia de RANKL [14]. En conjunto, los datos proporcionan una visión de un posible mecanismo paracrino sobre cómo fibroblastos palatal puede reducir la osteoclastogénesis al mismo tiempo apoyar la inmunidad innata se indica por la expresión de marcadores de células presentadoras de antígeno, al menos in vitro. Es evidente que esto no es una conclusión, más bien una sugerencia apoyada ser nuestros datos preliminares. Por lo tanto, los datos in vitro y particularily la posible relevancia clínica deben ser interpretados con cuidado. Francia El estudio piloto tiene más limitaciones. Se trata de un estudio observacional que muestra un fenómeno, mientras que los mecanismos moleculares subyacentes siguen sin estar claros. Los factores liberados por los fibroblastos de paladar que son responsables para el cambio observado de la osteoclastogénesis hacia la formación de células presentadoras de antígeno sin embargo, como no se define más queda por determinar. Un candidato probable es osteoprotegerina, un señuelo-receptor para RANKL [12]. La osteoprotegerina es producido por los fibroblastos, sino que se extienden y, en todo caso, este factor ha provocado que la inhibición de la osteoclastogénesis todavía no está claro. Por otra parte, se utilizó un sistema xenogénico, que podrían haber influido en el resultado global; fibroblastos palatinas humanas y células de médula ósea de ratón. Sin embargo, las moléculas que juegan un papel en la diferenciación de los osteoclastos son evolutiva conservada y por lo tanto funcionan entre las especies [16]. Por lo tanto, el uso de células de médula ósea de ratón en combinación con fibroblastos humanos es apropiada como un experimento de prueba de principios que puede ser refinado por el uso futuro de interespecies en modelos in vitro.
Conclusiones
En conjunto, la presente estudio piloto es una base científica para futuras investigaciones con el objetivo de revelar el impacto del entorno paracrina de fibroblastos palatinas en la osteoclastogénesis y el impacto correspondiente en el sistema inmune innato. El presente estudio es también un cebador para estudiar más a fondo la dinámica del movimiento celular creado por el medio ambiente paracrina mutuo.
Disponibilidad de datos y Materiales México La conjuntos de datos que apoyan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo.
declaraciones
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Catherine Solioz por su asistencia. El estudio fue apoyado por una subvención del ITI 852_2012
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de la competencia. intereses
los autores declaran que no tienen intereses en competencia contribuciones de los autores
VV realizó los experimentos y escribió junto con el manuscrito RG.; RG planeó el diseño del estudio, JCS ayudó a establecer los métodos y workted en las figuras. AS ayudó a redactar y revisar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
