no OPSCC
Resumen Antecedentes
Debido a las crecientes tasas de cáncer de orofaringe, la infección oral por VPH es una preocupación significativa. Los métodos para detectar VPH orales no ha sido estandarizada ya que hay diferentes técnicas disponibles. Proponemos que el uso de muestras de enjuague bucal para detectar por VPH es una técnica adecuada dentro de un entorno clínico. Por lo tanto, nuestro objetivo principal es el estudio de detección de VPH en muestras de enjuague bucal.
Métodos
En nuestro estudio, hemos utilizado la recogida de muestras enjuague bucal junto con PCR en tiempo real para detectar tipos de VPH 16 y 18, y preferentemente amplificado muestras FAP PCR para detectar una amplia gama de virus del papiloma humano, en el carcinoma de células escamosas de la orofaringe (OPSCC), no OPSCC, y pacientes sanos.
resultados
Treinta y tres por ciento de los 100 pacientes de cáncer fueron positivos para cualquier tipo de HPV ; de los que 23 fueron positivos para HPV16. Sólo 1 de 110 controles sanos fue positivo (este tema fue positivo para VPH 18).
Conclusión
Nuestros resultados indican que la detección del VPH en muestras de enjuague bucal puede ser útil como una herramienta de detección para detectar cánceres orales asociadas al VPH.
Antecedentes
tejidos infectados por el virus del papiloma humano (VPH) tiene la capacidad de evolucionar en un cáncer asociado al VPH. Esto es probablemente debido a un efecto de campo en el que el VPH puede modificar las funciones celulares normales que resultan en la malignidad. A pesar de que sabemos cómo probar para los cánceres relacionados con el VPH, actualmente no existe un estándar para la detección de la infección por VPH [1], y la detección de VPH podría identificar a los individuos en riesgo de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC). Hablando de lo cual, los casos de HNSCC asociados con el VPH han sido un reto para la detección de casos, carcinoma de células escamosas de la cavidad oral, especialmente (CCCA) y el carcinoma de células escamosas de la orofaringe (OPSCC), que son subconjuntos de los CECC. El área orofaríngea incluye la base de la lengua, el paladar blando, las amígdalas, y la región amigdalar, con la cavidad oral que comprende el resto de los tejidos interiores de la boca. Los métodos más comunes para la detección del VPH en la boca y orofaringe comienzan con la recolección de las células con un hisopo de algodón, citocepillo, o un enjuague bucal [2], seguido por el uso de ensayos o de ADN basados en PCR hibridación in situ [3]. Sin embargo, existen retos actuales de ciertas técnicas. Por ejemplo, el uso de un hisopo /cepillo limita la cantidad de mucosa que se toman muestras, y obtener una muestra de una lesión no visible dentro de la cripta amigdalina puede no ser factible [4]. La base de la lengua no es totalmente accesible, ya sea como hay tanto mucosa plana y tejido amigdalino, aumentando así el riesgo de falsos negativos [5]. Se optó por utilizar una técnica de enjuague bucal para la recogida de muestras, ya que es no invasivo, rápido y sencillo para el paciente. Analizando la expresión de p16
se ha utilizado como un biomarcador para el VPH-asociado CCCA /OPSCC, pero los estudios han reportado que la sobreexpresión de p16 no siempre está presente en los casos de VPH oncogénicos [6-9]. Un estudio reciente concluyó que p16 no debe ser utilizado como un marcador sustituto para la infección por HPV en el cáncer oral debido a la mala concordancia entre los dos [10]. Anterior a esto, Pannone et al. También afirmó que la inmunohistoquímica de p16 (IHC) por sí sola no demuestra ser un método fiable en la detección del VPH para casos CCCA /OPSCC [11]. En nuestro estudio, se obtuvo información para las pruebas de p16 para ver si es o no nuestros datos VPH estaba en concordancia.
Incidencia OPSCC en los países desarrollados ha aumentado considerablemente y se propone la infección por VPH es el factor principal [12]. Los factores de riesgo para la infección por HPV oral incluyen ciertas prácticas sexuales [13-16]; número de parejas en su vida y el número de parejas sexuales recientes, la edad avanzada, el sexo masculino, y el tabaquismo actual [17, 18]. El tipo más frecuente de HPV asociado con la infección oral es de tipo 16 [17, 19], que se ha demostrado que es oncogénica en HNSCCs [20]. Una revisión sistemática en todo el mundo de las biopsias HNSCC demostró HPV16 en el 31% de los casos OPSCC; 16% de los casos CCCA; y 17% de los casos de SCC laríngeos [21]. VPH tipo 18 también parece desempeñar un papel importante en la carcinogénesis, especialmente en la orofaringe [22, 23]. Vaya con el aumento de OPSCCs es imprescindible disponer de una técnica estándar de oro en el lugar para la detección de VPH oral. Recogida de muestras de la cavidad oral y la orofaringe para la detección de VPH oral debe ser rápido, no invasivo, de bajo costo, y suficiente en la recogida de ADN de VPH. En nuestro estudio, hemos investigado muestras de enjuague bucal, junto con en tiempo real ensayos TaqMan PCR para la detección de los tipos de VPH 16 y 18, que es sensible y específica. Población de estudio para detectar una amplia gama de virus del papiloma humano, que amplifica preferentemente las muestras de enjuague bucal de los casos de cáncer, y fluorescente que se utiliza arbitrariamente cebada (FAP) de PCR, un método general de PCR utilizando cebadores degenerados VPH.
Entre 2011 y 2013, se reclutaron 76 pacientes y 24 OPSCC no OPSCC de la Seattle Cancer Care Alliance (Seattle, WA), y 110 sujetos sanos de la Universidad de Clínica Dental Washington (Seattle, WA). casos no OPSCC incluyeron pacientes con cánceres COCE, laringe, senos paranasales, y supraglotis. Se revisaron las listas de cinco oncólogos con el fin de identificar a los pacientes con cáncer de elegibles, y discutimos nuestro estudio a su cita. Un paciente disminuyó debido a lesiones en la boca y la sensibilidad. 21/100 pacientes con cáncer ya habían comenzado el tratamiento y de estos 21 pacientes: 18 pacientes tuvieron tratamiento con menos de 21 días antes del muestreo, dos tenían más de 30 días de tratamiento, y un paciente tenía el tratamiento durante 7 meses. Los sujetos sanos fueron seleccionados al azar dentro de la clínica dental estudiante, un paciente se negó a participar en el estudio. requisitos de inclusión para la población sana incluidos ser: libre de cáncer, no embarazadas, libre de VIH, y mayores de 16. Cada paciente firmó los formularios de consentimiento por escrito para participar en el estudio (IRB # 7490 aprobada en 9 de abril de, 2014), y contestado un sencillo cuestionario de salud. El género, la edad, la raza, el tabaquismo, el alcohol, la marihuana y la historia se registran para todos los sujetos. Gráficos de un subconjunto de nuestros pacientes fueron revisados para inmunohistoquímica p16 (IHC) y la prueba de VPH
Métodos COLECCIÓN & amp del.; Los métodos de purificación de ADN Opiniones de recogida de muestras, todos los pacientes se aclararon y se gárgaras durante 30 s con menta original Scope® enjuague bucal (Procter & amp; Gamble). Cuatro individuos sanos normales invita a utilizar con Crest® enjuague bucal sin alcohol debido a un historial de alcoholismo. muestras de enjuague bucal se centrifugaron durante 15 min. a 4 ° C para formar un sedimento, se descartó el sobrenadante, y el sedimento se puso en -80 ° C hasta su posterior procesamiento. El kit de purificación de ADN Puregene® se utilizó para aislar ADN genómico a partir del sedimento celular bucal dentro de las muestras de enjuague bucal (Qiagen artículo # 158467, se siguió el protocolo del fabricante).
Todos los sujetos humanos protocolos y normas del IRB fueron seguidos bajo el Cáncer Fred Hutchinson . directrices (IRB # 7490 aprobada en 9 de abril de, 2014) Centro de Investigación
VPH & amp; métodos analíticos
Taqman en tiempo real ensayos de PCR se utilizaron para la detección en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 con 40 ciclos en una reacción (desnaturalización a 95 ° C, recocido y extensión a 60 ° C). se utilizó Cuantificación absoluta para determinar HPV16 y 18 de la carga viral, y el ADN genómico humano total en la muestra se determinó en las secuencias Alu. diluciones seriadas de ADN genómico humano y HPV16 de longitud completa y 18 plásmidos, de concentraciones conocidas, se utilizaron como las curvas de calibración
HPV16 E7 cebadores
Reenviar:. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
Invertir: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 sonda: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 cebadores:
Reenviar: CCGACGAGCCGAACCA
Reverse: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 sonda: AACGTCACACAATGTT
con el fin de aumentar la eficacia de la detección del VPH, se utilizó el múltiplemente cebó rodadura circular técnica de amplificación (MP-RCA) para amplificar preferentemente, el ADN del VPH circular desconocido. MP-RCA se ha demostrado para amplificar moldes de ADN circulares de hasta 107 veces [24]. El protocolo de amplificación TempliPhi 100 Kit (Amersham Biosciences) fue seguido. Francia El PCR FAP publicó protocolo se siguió para detectar una amplia gama de tipos de VPH, donde los cebadores se desarrollan a partir de regiones conservadas L1 [25]. Nosotros sólo realizamos esta técnica en las muestras de casos de cáncer (Fig. 1). Higo. 1 FAP resultados de PCR en un gel de electroforesis. Una banda esperada de 480 pb ~ indica una muestra positiva VPH
Categorizamos historia de tabaquismo de la siguiente manera: no fumadora (0 paquetes); fumador leve (& lt; 1pack /semana); fumador moderado (≥1pack /semana ≤1 paquete /día); gran fumador (≥1pack /día). Para aquellos que fumaban cigarros o tabaco masticado, se calculó que el equivalente de paquetes de cigarrillos fumados. la historia de alcohol se clasificó de la siguiente manera: ninguno (nunca bebe); rara vez /de vez en cuando (1 bebida cada 1-2 meses); luz (1-6 bebidas /semana para las mujeres, las bebidas 1-13 /semana para los hombres); moderada (7 bebidas /semana para las mujeres, 14 bebidas /semana para los hombres); pesados (& gt; 7drinks /semana para las mujeres, & gt; 14 tragos /semana para los hombres).. MyBestPlay Todos los datos se realizaron análisis utilizando Stata 13.1 MP (StataCorp LP, Texas, EE.UU.)
Resultados
El cáncer oral sujetos con OPSCC y no OPSCC tenían más probabilidades de ser varones que los sujetos control sin cáncer, como al menos el 83% de los sujetos en cada tipo de cáncer eran de sexo masculino, en comparación con sólo el 46% de los controles (Tabla 1; p Hotel & lt; 0,001). Los casos de cáncer fueron también mayores que los controles, como & gt; 80% de los casos, independientemente del tipo de cáncer, tenían 50 años de edad o más en comparación con sólo el 63% de los controles (p & lt
; 0,001). Los sujetos con OPSCC y no OPSCC fueron similares a los sujetos sin cáncer con respecto a raza (p = 0,30
) y el origen étnico (p = 0,62
) y eran predominantemente caucásicos no hispanos. Los que tenían cáncer (39% OPSCC, el 54% no OPSCC; p Hotel & lt; 0,001) tenían más probabilidades de ser fumadores pesados en comparación con aquellos que no tienen cáncer (32%). la historia excesivo de alcohol era frecuente en el 33% de OPSCC y en el 33% de los pacientes con COCE (p = 0,015
) en comparación con sólo el 12% de los sujetos que no tienen cáncer. El consumo de marihuana se observó principalmente en los casos de cáncer (11% OPSCC, 4% CCCA; p = 0,010
) y rara vez en los controles (0,91%). Los casos de ambos tipos de cáncer (33% OPSCC, el 33% no OPSCC; p Hotel & lt; 0,001) eran más propensos a tener el VPH detectable que los controles sanos (0,9%), y el tipo concreto de 16 (25% OPSCC, 17% no OPSCC; p Hotel & lt; 0,001) detectado en sus muestras de enjuague bucal en comparación con los controles. detección de HPV18 no varió por grupo de estudio y se detectó en una sola muestra de un sujeto de control (p = 0,63
), y ninguna en los casos de cáncer. Nuestro método para la detección del VPH tiene una sensibilidad del 33% y una especificidad del 99% (p Hotel & lt; 0,001) .able 1 Demografía entre todos los sujetos en casos que no son cancerosas y cancerosas
No cáncer
OPSCC
no OPSCC
p-valor
n = 110
n
= 76
n = 24
Sexo Masculino
51 (46.36%)
63 (82.89%)
20 (83,33%)
& lt; 0,001
Mujer
59 (53,64%)
página 13 (17,11%)
4 (16,67%)
edad agrupados
20-39
27 ( 24,55%) guía empresas 1 (1,32%)
1 (4,17%)
40-49
13 (11,82% ) guía empresas 10 (13.16%)
2 (8,33%)
50-59
21 (19,09%)
29 (38.16%) guía empresas 11 (45,83%)
& lt; 0,001
60-69
29 (26,36%)
30 (39.47%) guía empresas 8 (33,33%)
70 +
20 (18,18%) guía empresas 6 (7,89%)
2 (8,3%)
Race
asiática
5 (5,55%)
página 2 (2,63%) guía empresas 1 (4.17)
Negro
6 (5,45%)
1 ( 1,32%)
0
blanca
92 (83,64%)
65 (85,53%)
21 ( 87.50%)
0,30
Otros
7 (6,36%)
4 (5,26%)
1 ( 4,17%)
Desconocido
0
4 (5,26%)
1 (4,17%) guía empresas
Etnicidad (Hispano /Latino)
Sí
4 (3,64%)
2 (2,63%) guía empresas
0
0,62
Sin
106 (96.36%)
74 (97.37%)
24 (100%)
historia de fumadores
no fumador
51 (46.36%)
21 (27,63%)
5 (20.83 %)
fumador leve
1 (0,91%)
14 (18,42%)
2 (8,33%)
& lt; 0,001
Moderado fumador
23 (20,91%)
11 (14,47%)
4 (16.67 %)
fumador empedernido
35 (31,82%)
30 (39.47%)
13 (54,17%)
historia alcohol
Ninguno
24 (21,82%)
7 (9,21%)
3 (12.50%)
Casi /ocasionalmente
16 (14,55%)
14 (18,42%)
4 (16,67%)
Luz
54 (49,09%) guía empresas 27 (35,53%)
9 (37,50%)
0,015
Moderado
3 (2,73%)
3 (3,95%)
0
pesada
página 13 (11,82%) guía empresas 25 (32.89%) guía empresas 8 (33,33%)
Cualquier Consumo de marihuana
Sí
Pagina 1 (0,91%) guía empresas 8 (10,53%)
1 (4,17%)
0,010
No se
109 (99,09%)
68 (89.47%) guía empresas 23 (95,83%)
Cualquier VPH
1 (0,91%) guía empresas 25 (32.89%) guía empresas 8 (33,33%)
& lt; 0,001
VPH 16 positivos
0
19 (25.00%)
4 (16,67%)
& lt; 0,001
VPH 18 positivos
1 (0,91%) guía empresas 0 0
0,63
aDatos para "Ningún cáncer" se asocia con publicado los datos de prevalencia de los tipos de VPH 16 y 18 en el establecimiento de una clínica dental de estudiante gratis (J Dang et al.)
Veintidós muestras positivas de HPV se ensayaron para p16 antes del muestreo, y sólo una prueba negativa para p16 . Sin embargo, 26 muestras que fueron negativas para HPV fueron positivas para p16 (Tabla 2). Cabe señalar que tres de los 26 pacientes (p = 0,085
) fueron sometidos a tratamiento (es decir. La quimioterapia, la radioterapia, la escisión) antes del muestreo, lo que podría afectar a la presencia de la infección antes de HPV. HPV se asocia marginalmente con la detección de p16 (p = 0,076
); de los pacientes que eran VPH positivas, el 96% tenían una prueba positiva de p16; sólo una muestra que fue positiva para el VPH resultaron negativos a p16. Entre los pacientes negativos de VPH, el 79% eran p16 positivo. Sólo dos casos de pacientes habían completado detección del VPH antes del muestreo y ambos fueron negativos para el VPH en nuestras pruebas y la screening.Table 2 p16 y cualquier VPH
Cualquier p16 prueba de VPH
p
-valor
positivo negativo
0,076
n = 48
n = 8
Sí
22 (95,65%)
1 (4,35%)
n
26 (78.79%)
7 (21,21%)
Discusión
recogida de muestras de pacientes puede ser una tarea difícil y consume tiempo, especialmente cuando el investigador está interrumpiendo una cita. Además, muchas personas tienen reflejos gag sensibles, por lo que si una técnica de cepillo o esponja se utiliza para raspar la parte posterior de la garganta, la obtención de una muestra puede ser muy difícil sin la ayuda de un anestésico tópico. Por esta razón, es imprescindible contar con una técnica de muestreo en el lugar que no es invasiva y rápida, sin embargo, suficiente para la detección del VPH. Nuestro estudio ha demostrado que la recogida de muestras de enjuague oral es un método discreto a usar para la detección de VPH orales. Esto está en concordancia con un estudio que compara enjuague oral y toma de muestras cepillo de citología, que concluyó que los enjuagues orales eran la mejor opción para el muestreo de la cavidad oral con el fin de detectar el VPH [26].
Utilizamos Scope® porque era observado que tienen una excelente conservación de la calidad del ADN de alto peso molecular, y es más aceptable que la mayoría de los otros medios de aclarado [27]. Cuatro pacientes del grupo control solicitados para enjuagar con Crest Pro-Health® enjuague bucal sin alcohol. No llegamos a ver las diferencias en la cantidad de ADN (datos no mostrados), sin embargo se requiere más investigación para ver si hay una diferencia con la cantidad, así como la calidad.
La cuantificación de la carga viral puede ser crucial para determinar si OPSCC VPH-positivo /OSCCs son, sin duda, el resultado de la infección por VPH [28]. El estándar de oro para la evaluación de la carga viral del VPH es-PCR en tiempo real [29, 30]. Un estudio demostró OPSCC tener una carga viral de ~ 80.000 veces mayor que la CCCA y otros HNSCCs [29]. Nuestros resultados no mostraron diferencias significativas entre los dos grupos de cáncer (Fig. 2). Además, las diferencias en los resultados pueden ser debidos a los autores utilizando biopsias fresco congelado donde se muestrea sólo una pequeña parte de la cavidad oral o la orofaringe. Las muestras de enjuague bucal pueden permitir una recogida más eficaz de células orales para la detección del VPH. La variación en los hallazgos de nuevas investigaciones de la carga viral en asociación con subconjuntos de CECC. Higo. 2 Comparación de la carga viral HPV16 (copias /ng de ADN) entre los dos grupos de cáncer. Estadísticamente no se observó diferencia significativa (p = 0,40
). Las cajas grises demuestran rango de menor a cuartiles superior. La mediana se representa mediante una línea horizontal. Los valores máximos y mínimos se indican por las líneas verticales. variación de la carga viral entre cada grupo se demostró. La mediana de carga viral en OPSCC fue ligeramente mayor que los casos no OPSCC Francia El paciente con una OPSCC, que habían sido sometidos a tratamiento durante 7 meses antes de la toma de muestras, fue positivo para el VPH, específicamente de tipo 16. Este caso es único, ya someterse a varias meses de tratamiento deben erradicar el virus a menos si la infección es reciente. Debe tenerse en cuenta que el paciente tenía un historial de fumar y beber pesado. se justifica más investigaciones sobre la prevalencia de la infección por el VPH después de la radiación /quimioterapia.
Una limitación importante fue no tener el ADN de tejido tumoral para comparar la detección del VPH. Las muestras de tejido no estaban disponibles para nosotros, sino que han actuado como un estándar de oro dentro de nuestro estudio. Otras limitaciones a nuestro estudio incluyen: nuestros resultados demuestra una baja sensibilidad para la detección de VPH en pacientes con cáncer, pero con una especificidad muy alta; no hemos podido controlar la eficacia de un paciente podría hacer gárgaras y buches con el enjuague bucal, lo que tendrá un efecto sobre la cantidad y calidad del ADN recogido; Scope® tiene un fuerte sabor a menta, que puede no ser adecuado para aquellos con bocas sensibles; tamaño de la muestra; no detectar para el VPH ARN para mostrar infección activa; y FAP PCR es suficientemente sensible para detectar una amplia gama de virus del papiloma humano, pero algunos HPV puede no detectarse debido a la generalidad de los cebadores diseñados [25]. pruebas
p16 se lleva a cabo por lo general sólo en los casos en que no se ajustan los factores de riesgo tradicionales (es decir. el tabaco y el alcohol significativa historia de uso), y la prueba del VPH es poco frecuente. Esto es algo que necesita ser cambiado durante el diagnóstico, debido al aumento de OPSCCs asociados al VPH.
Conclusiones
partir de nuestros resultados hemos demostrado que preferentemente amplifica muestras de enjuague bucal con la detección del virus de tiempo real ensayos de PCR Taqman y FAP PCR, es un método utilizable en general, que podría ser utilizado en un entorno clínico. necesitarán estudios más específicos que hacer para determinar si enjuagues bucales reflejan realmente, en los casos, el tipo de VPH asociados con la lesión cancerosa
abreviaciones
CCCA:.
carcinoma de células escamosas oral
OPSCC:
orofaríngea carcinoma de células escamosas
CECC:
de cabeza y cuello de células escamosas carcinoma de
RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real
FAP PCR:
fluorescente reacción en cadena de polimerasa arbitrariamente cebada
MP-RCA: Multiplicar
cebado con la amplificación de rodadura circular
Declaraciones
Agradecimientos
Fuente de financiación de la Universidad de fondo de investigación de archivo de Washington
Abra. AccessThis artículo se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento 4.0 Licencia Internacional (http:. //creativecommons org /licencias /por /4. 0 /), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre y cuando se dé crédito apropiado al autor (s) original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios. La renuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http:. //Creativecommons org /publicdomain /cero /1 0 /) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario
de la competencia.
intereses los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
autores
JD completaron todos los experimentos, se analizaron todos los datos, y escribió el manuscrito. NBK y QF concebido /diseñó el estudio, y revisados /editado el manuscrito. KDE fue el oncólogo de colaboración para el estudio que ayudaron con la recolección de muestras, y con la revisión /edición del documento. HJ ayudó en la recogida de muestras. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
