Resumen Antecedentes
Los objetivos de este estudio fueron investigar la inmunolocalización de ezrin y su relación con la expresión podoplanin en los tumores odontogénicos keratocystic
. material y métodos inmunohistoquímicos Empresas El expresiones de ezrin y podoplanin por epitelio odontogénico se evaluaron en los tumores odontogénicos keratocystic utilizando anticuerpos monoclonales.
: resultados de la Nuestros resultados mostraron una fuerte ezrin citoplasmática y expresiones podoplanin membranosas en la capa basal del epitelio de todos keratocystic tumores odontogénicos. Las expresiones ezrin citoplásmicos membranosos y también se detectaron en capas epiteliales suprabasal de tumores. Diferencia estadísticamente significativa entre inmunolocalización celular de ezrin y podoplanin epitelio odontogénico se encontraron por el test de Wilcoxon (p & lt; 0,05). No existe correlación entre ambas proteínas en tumores odontogénicos keratocystic fue detectado por la prueba de Spearman.
Conclusiones
Estos resultados sugieren que ezrin y podoplanin pueden contribuir al crecimiento expansivo y la invasión local de tumores odontogénicos keratocystic. Además, ya que ambas proteínas se sobreexpresa por epitelio odontogénico, sus posibles funciones es necesario explorar aún más en los tumores odontogénicos benignos.
Palabras clave
Keratocystic tumor odontogénico material complementario Ezrin Podoplanin Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi :. 10 1186 /1472-6831-14-150) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados
Antecedentes
expresión Podoplanin se ha detectado en las células epiteliales de desarrollo de diente de germen de [1, 2]. y en el epitelio odontogénico de tumores benignos [3-10].
La presencia de podoplanin en los tejidos humanos de los dientes, dientes germinales adultas y lesiones quísticas odontogénicos sugiere que esta proteína probablemente está implicado en los mecanismos de adhesión celular, la transición epitelio-mesenquimal y invasión y crecimiento expansivo de las lesiones quísticas odontogénicos [5].
estudios previos realizados en nuestro laboratorio investigado la asociación de podoplanin con actividad proliferativa celular, determinado por el anticuerpo Ki-67, en ameloblastomas [7] y tumores odontogénicos keratocystic [9 ]. No se encontró una correlación estadísticamente significativa en ameloblastoma, sin embargo se observó esta asociación en los tumores odontogénicos keratocystic. Además, tanto podoplanin y Ki-67 expresiones eran más fuertes y co-localizan en tumores odontogénicos keratocystic en comparación con los quistes odontogénicos ortoqueratinizado, una lesión indolente. Estos fingings sugerido que las células podoplanin positiva se encuentran en el centro de la proliferación celular que indica un papel para esta proteína en el proceso de invasión tumoral [9].
Además, Friedrich et al. [8] mostró que el patrón de expresión podoplanin es similar entre queratoquiste tumor odontogénico diagnosticado en esporádicos y en el síndrome de carcinoma de células basales nevoide y, los autores reforzaron la probable asociación de esta proteína con la invasión y locales recurrencias del tumor.
Recientes hallazgos demuestran que podoplanin es importante para conducir la migración celular direccional en las células epiteliales y tumorales [11]. Entonces, la capacidad de podoplanin para remodelar citoesqueleto y formar extensión membrana filipodia-como [12] ha sido sugerido como factor importante en el movimiento de las células epiteliales odontogénicas [6]. Esta motilidad celular podoplanin inducida a través de la reorganización del citoesqueleto de actina parece ser dependiente de la interacción con el ezrin citoplasmática [13], forma parte del MTC (Ezrin, radixina, moesina) proteína de la familia de proteínas [14, 15]. Francia El Actualmente estudio fue diseñado para analizar la inmunolocalización de ezrin y su relación con la expresión podoplanin en los tumores odontogénicos keratocystic. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer reporte de la inmunotinción ezrin en un tumor odontogénico.
Métodos
Pacientes y muestras tumorales MyBestPlay Todos los especímenes quirúrgicos de tumor odontogénico keratocystic analizados en este estudio se obtuvieron del Laboratorio de Patología, Facultad de Odontología de Bauru, Universidad de Sao Paulo, entre 2002 y 2010. los criterios de inclusión fueron: i) los pacientes con diagnóstico de tumor odontogénico keratocystic basado en la clasificación de la Organización Mundial de la Salud [16], determinada por la suma de la clínica, radiológica, y los datos microscópica; ii) la disponibilidad del bloque de parafina con una cantidad suficiente y representativa del tumor odontogénico para el análisis microscópico. La aplicación de los criterios de inclusión, se seleccionaron 18 tumores odontogénicos keratocystic para la investigación de podoplanin y inmunotinción Ezrin. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Odontología de Bauru, Universidad de Sao Paulo (proceso # 85612/2012). La inmunohistoquímica
fijados con formalina 3 micras secciones de los tumores odontogénicos keratocystic se obtuvieron de la patología archivo para el análisis de inmunohistoquímica de los Ezrin y podoplanin expresiones de epitelio odontogénico. Después de la recuperación de antígenos usando tampón citrato 10 mM, pH 6,0, en una olla a presión doméstica (modelo Eterna 4½ L; Nigro, Araraquara, Brasil) durante 4 min, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en el 3% de H
2O 2 para 20 min. Cada sección se incubó durante la noche a 48 ° C con el anticuerpo primario monoclonal anti-podoplanin (clon D2-40, código # 3619-1; Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, EE.UU.), la dilución 1: 200 o anti- anticuerpo ezrin (Dako North America, Inc., CA, EE.UU.), dilución 1: 1000, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con albúmina de suero bovino (cat. # A2153, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) solución para bloquear una reacción no específica. A continuación, cada sección se incubó con HRP Advance System Link (cat. # 4067, Dako América del Norte, Carpinteria, CA, EE.UU.) durante 30 minutos a 37 ° C. Ambos anticuerpos fueron detectados utilizando tetrahidrocloruro de 3,30-diaminobenzedine (DAB, cat. # D-5637, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Tumor secciones se counterstained con hematoxilina de Mayer antes de ser deshidratado y la cubierta se deslizó. amígdalas palatinas y el intestino se utilizaron como control positivo para podoplanin y ezrin, respectivamente. Para un control negativo, el anticuerpo primario se omitió durante la tinción inmunohistoquímica. Los ezrin y podoplanin expresiones de epitelio odontogénico de los 18 tumores odontogénicos keratocystic se evaluaron en diez campos microscópicos capturados digitalmente utilizando una cámara Axiocam (Axiocam MR3; Zeiss, Jena, Alemania) unido a un microscopio de luz y registrado por el software Axiovision (Axiovision 4.7; Zeiss). Una puntuación por immunostainings ezrin y podoplanin expresadas por epitelio odontogénico se basó en: a) la intensidad de la inmunotinción en las células odontogénicos epiteliales (0 = ausente, 1 = débil, 2 = moderada, 3 = fuerte, y 4 = muy fuerte) y (b) el porcentaje de células positivas (células positivas odontogénicos 0 = 0%, 1 = & lt; 25% de células positivas, 2 = 25 a 50% de células positivas, 3 = 50 a 75% de células positivas, y 4 = & gt; 75% de células positivas). El resultado inmunotinción fue determinada por la suma de (a) + (b). Los resultados finales fueron de 0 a 8 (0 = ausente, 1-4 = débil, y 5-8 = fuerte). La diferencia y la correlación entre la expresión membranosa o citoplasmática de ezrin y podoplanin expresados en los tumores odontogénicos keratocystic se determinaron mediante la prueba de Wilcoxon y el coeficiente de correlación de Spearman, respectivamente. El nivel de significación se fijó en 5% para todas las pruebas.
: Resultados de la Características clínicas
Nuestra muestra consistió en dieciséis pacientes diagnosticados con tumores odontogénicos keratocystic (nueve de ellos eran mujeres y siete hombres). la edad del paciente varió de 9 a 68 años (media 28 años) y eran predominantemente blancos (75%). La mayoría de los tumores estaban localizados en región posterior de la mandíbula (62,5%), seguido de maxilar (25%), y en 3 casos, la localización no se ha especificado por el cirujano. Del total de 16 pacientes con tumores odontogénicos keratocystic, 4 de ellos tenían el síndrome de Gorlin-Goltz y de éstos, 2 presentaban lesiones múltiples, pero en diferentes locales y períodos.
Expresión Podoplanin por tumores odontogénicos keratocystic
La capa basal de la mucosa oral normal presentó positividad para podoplanin membranosa, así como de los vasos linfáticos en el tejido conectivo subyacente, lo que confirma la integridad de la reacción inmunohistoquímica. La expresión membrana citoplasmática y de podoplanin se concentró intensamente en la capa basal del epitelio en todos los tumores odontogénicos keratocystic (Tabla 1). Las capas superiores del epitelio fueron negativos para esta proteína (Figura 1) y las células periféricas de quistes hijos expresa fuertemente esta expresión citoplasmática podoplanin protein.Table 1 membranosa y en 18 tumores odontogénicos keratocystic
podoplanin
membranosa
citoplasmática
p *
N
%
N
%
Ausente
0
0 0
0
1.000
débil
0 0
1
5,56
fuerte
18
100
17
94.44
TOTAL DE
18
100
18
100
la Escuela de Odontología de Bauru - Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, 2002
a 2010. * test de Wilcoxon; ρ = nivel de significación estadística de 0,05.
Figura 1 Expresión de podoplanin en el tumor odontogénico keratocystic. La positividad restringido a la capa basal (IHQ, 400 ×).
Expresión Ezrin por tumores odontogénicos keratocystic
Ezrin se expresa fuertemente en la membrana citoplasmática de la capa espinosa de mucosa oral normal. La mayoría de los tumores odontogénicos queratoquiste células epiteliales (83,33% de los casos) expresa fuertemente ezrin citoplasmática (Tabla 2). El ezrin citoplasmática fue detectado con frecuencia en capa basal del epitelio y de mayor positividad ezrin membranosa puede observarse en las capas supra-basal de epitelio. Se observó la expresión ezrin membranosa débil o ausente por las células epiteliales en aproximadamente el 61% de los tumores. Las células epiteliales odontogénicos de quistes hijos también mostraron citoplasmática y membranosa Ezrin (Figura 2) .Tabla 2 membranosa y la expresión citoplasmática ezrin en 18 tumores odontogénicos keratocystic
EZRIN
membranosa
citoplasmática
p *
N
%
N
%
Ausente
10
55.56
2
11.11
0,007
débil
1
5,56
1
5,56
fuerte
página 7
38.88
15
83,33
TOTAL DE
18
100
18
100
la Escuela de Odontología de Bauru - Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, 2002 a 2010. *
prueba de Wilcoxon; ρ = nivel de significación estadística de 0,05.
Figura 2 Expresión de ezrin en el tumor odontogénico keratocystic. Nota positividad citoplasmática en las capas basales y supra-basal y la expresión membranosa en el nivel más superficial del epitelio odontogénico (IHQ, 400 ×).
Relación entre las expresiones Ezrin y podoplanin en tumores odontogénicos keratocystic
se utilizó la prueba de Wilcoxon para comparar la expresión subcelular de ezrin y podoplanin en tumores odontogénicos benignos. Las diferencias entre ezrin membranosa y membranosa (p = 0,003) o citoplásmica (p = 0,003) expresiones podoplanin fueron estadísticamente significativos (Tabla 3). Por otra parte, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ezrin citoplasmática y membranosa (p = 0,109) o citoplasmáticos expresiones (p = 0,201) podoplanin, como llustrated en la prueba de la Tabla 3. El Spearman no demostraron una correlación estadísticamente significativa entre podoplanin y ezrin membranosa o citoplásmica expresiones en los tumores odontogénicos keratocystic (Tabla 4) .Tabla 3 Comparación entre membranosa y podoplanin citoplasmática y la expresión ezrin en 18 tumores odontogénicos keratocystic
podoplanin
Ezrin
M (%)
C (%)
M (%)
C (%)
M PO
M PO
C PO PO C
X
X X
X
M EZ
C EZ
M EZ
C EZ
Ausente
0 0
55.56
11.11
p = 0,003
p = 0,109
p = 0,003
p = 0,201
débil
0
5,56
5,56
5,56
fuerte
100
94.44 38.88
83,33
TOTAL DE 100
100
100
100
la Escuela de Odontología de Bauru - Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, 2002 a 2010.
prueba de Wilcoxon; ρ = nivel de significación estadística de 0,05. PO: podoplanin; EZ: ezrin; M: membranosa; C:. Citoplasmática sobre Table 4 membranosa y la correlación entre citoplasmática podoplanin y expresión ezrin en 18 tumores odontogénicos keratocystic
membranosa
citoplasmática
podoplanin
Podoplanin
membranosa ezrin
r = 0,000
r = -0,293
p = 1,000
p = 0,293
citoplasmática ezrin
r = 0,000
r = -0.108
p = 1,000
p = 0,670
Bauru Facultad de Odontología - Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, 2002 a 2010.
r = coeficiente de correlación de Spearman; ρ = estadístico nivel de significación de 0,05.
Discusión
En los últimos años, el interés en la expresión podoplanin en tumores odontogénicos benignos ha aumentado considerablemente [3, 4, 6 a 10, 17]. Se ha sugerido que esta proteína participa en el movimiento de las células epiteliales odontogénicas a través de reordenamiento del citoesqueleto de actina [6, 9]. Aunque la motilidad celular inducida por odontogénico podoplanin puede ser dependiente de su interacción con el ezrin activado, la conexión entre las dos proteínas no ha sido previamente estudiado en tumores odontogénicos.
Nuestros resultados con respecto a la inmunolocalización de podoplanin mostraron una fuerte expresión de la membrana citoplasmática y la proteína detectó principalmente en la capa basal del epitelio odontogénico, incluso en quistes hijos. En la mucosa oral normal, la expresión podoplanin era membranosa y se concentra en la capa basal del epitelio. Nuestros resultados corroboraron los de los autores anteriores [4, 8 a 10, 17].
Desde Okamoto et al [4] propuesto, por primera vez, un posible papel de la podoplanin en la invasividad tumoral de los tumores odontogénicos keratocystic, además investigaciones se han llevado a cabo con el fin de comprender la función exacta de esta proteína en la patogénesis y el crecimiento de estos tumores benignos [5, 8-10, 17]. Tsuneki et al. [17] verificó que las células positivas podoplanin están situados en el centro de proliferación celular de los tumores odontogénicos keratocystic lo que sugiere que esta proteína actúa como uno de los reguladores clave en el proceso de proliferación de este tumor. Del mismo modo, la participación de podoplanin en la invasión local de tumores odontogénicos se vio reforzada por nuestros resultados anteriores [9]. Hemos demostrado la correlación entre la expresión podoplanin y el índice de la proliferación celular en tumores odontogénicos keratocystic [9]. Además, un interesante estudio de Zhang et al [10] mostró que en los tumores odontogénicos keratocystic, tratados de forma conservadora por descompresión, hubo una pérdida significativa o reducción de la expresión podoplanin en el epitelio odontogénico. En radiculares y folicular quistes, Zustin et al [5] expresión que se encuentra podoplanin más homogénea y difusa en el citoplasma y membrana, en la basal del epitelio y la capa parabasales. Como podoplanin se correlaciona con otras proteínas implicadas en la proliferación celular y la invasión tumoral [9, 17], su regulación a la baja puede deberse a una actividad limitada del epitelio odontogénico después de que el abordaje quirúrgico [10].
A pesar del hecho de que la función exacta de podoplanin en los tumores odontogénicos es poco conocida y en gran parte desconocidos, los resultados del presente estudio, tomados junto con nuestra anterior investigación [9] y los de otros autores [5, 17, 8, 10] sugieren que esta proteína está implicada en locales invasión y en el crecimiento de los tumores odontogénicos expansiva keratocystic, probablemente orquestar la actividad citoesqueleto epitelial odontogénico.
un posible mecanismo sugerido es que podoplanin une ezrin y, como aguas abajo, de la siguiente manera la fosforilación de la GTPasa RhoA [7]. Esta vía de señalización promovería el reordenamiento del citoesqueleto de actina e inducir la formación de proyecciones de tipo filopodios, la promoción del movimiento celular [13]. Por lo tanto, con el fin de verificar si podoplanin y ezrin son co-localizados en los tumores odontogénicos keratocystic, se diseñó el presente estudio.
Ezrin, un miembro de la familia de proteínas ERM, ejerce funciones primordiales relacionados con la regulación del movimiento y la estructura celular mediante la transducción señales entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina [14]. Ezrin es esencial para muchos procesos celulares fisiológicas incluyendo la regulación del citoesqueleto de actina, mantenimiento de la forma celular, la adhesión, la motilidad y la modulación de las vías de transducción de señales [14]. Hoteles en la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas, ezrin fue identificado como una molécula clave en la progresión tumoral y el comportamiento metastásico de las células neoplásicas y se ha correlacionado con un mal resultado [18 a 21], de manera similar a podoplanin [22]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera evidencia de que confirmó la inmunoexpresiones de ezrin en los tumores odontogénicos benignos keratocystic.
Los resultados presentados aquí mostró ausencia de ezrin membranosa en el 55,56% de los tumores odontogénicos keratocystic y, cuando está presente, esta proteína se observó principalmente en la membrana de las capas no proliferativa supra-basal (Figura 2). Desde que podemos plantear la hipótesis de que ezrin puede ser la promoción de la adhesión celular, como se observa de manera similar en la no-proliferación de células escamosas de la mucosa normal humano por vía oral [18, 20, 21].
Además, la mayoría de los tumores odontogénicos (83,33% ) mostraron una fuerte expresión citoplásmica ezrin especialmente en la capa basal del epitelio odontogénico. Curiosamente, el citoplasmática ezrin refleja su forma activada [18, 20, 21] y, en el cáncer oral, este patrón de ezrin citoplasmática se ha asociado con fenotipo invasivo y un comportamiento más agresivo de las células malignas [18-21]. Estos hallazgos sugieren que activado ezrin es necesaria para la proliferación y /o la invasión de células odontogénicas una vez que su positividad citoplasmática se encuentra principalmente en las capas basales de tumores odontogénicos keratocystic, la región responsable del crecimiento del tumor.
La distribución de ezrin en tumores odontogénicos keratocystic era más heterogénea que la de podoplanin (Tablas 1 y 2) y se observaron diferencias estadísticamente significativas entre la localización de ezrin membranosa y podoplanin citoplasmática o membranosa (Tabla 3). Se informó previamente que ezrin es notablemente fosforilado en presencia de podoplanin sobreexpresión [13]. Esta interacción de podoplanin y ezrin es responsable de muchos de los efectos sobre el citoesqueleto, lo que contribuye a un aumento de la motilidad celular [13]. Además, hay pruebas de que la función de ERM en la organización del citoesqueleto está mediada a través de su capacidad para unirse a actina y para regular GTPasa RhoA fosforilación [13]. Curiosamente, los tumores odontogénicos keratocystic presentan fuerte podoplanin membranosa y la expresión citoplasmática ezrin, que corresponden a las formas activadas de ambas proteínas. El podoplanin forma activada (membranosa) se encuentra principalmente en la capa basal, lo que indica una co-localización de activa-activa y ezrin-podoplanin en las zonas de gran actividad de los tumores odontogénicos keratocystic. Sin embargo, esta correlación no fue estadísticamente significativa, probablemente debido al bajo número de tumores negativos (0 para podoplanin membranosa y 2 para ezrin citoplasmática), que no permite el establecimiento de una relación asociativa (Tabla 4).
Conclusiones
en resumen, informamos primero que ezrin presenta una fuerte expresión en la capa membranosa supra-basal y una fuerte expresión citoplasmática en la capa basal de los tumores odontogénicos keratocystic. Por lo tanto, nuestra investigación sugiere un papel para ezrin y podoplanin en los tumores odontogénicos keratocystic y sus interacciones moleculares necesitan ser explorados más en este tipo de tumores.
Consentimiento
Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética e investigación de Escuela de Odontología de Bauru - Universidad de Sao Paulo. CAAE:. # 03924312.0.0000.5417
abreviaciones
MTC:
Ezrin, radixina y moesina
GTP-asa:
Guanosine- trifosfatasa.
Declaraciones
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (subvenciones # 2012 /13411-6 y # 2013 /16999-7) y Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico para apoyar este estudio.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original de la figura 1 12903_2014_474_MOESM2_ESM.tif autores 12903_2014_474_MOESM1_ESM.tif Autores archivo original para la figura 2 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores
ODT contribuido a la concepción y diseño de este proyecto, la interpretación crítica de los datos y la revisión crítica del manuscrito. DPJE llevó a cabo la adquisición de datos, análisis e interpretación. AA contribuyó con el análisis de datos, la redacción y la presentación del manuscrito. TKC también diseñó el proyecto, contribuyó con la adquisición, análisis de datos y la revisión del manuscrito. NS contribuido al diseño del proyecto y también con perfiles de inmunohistoquímica para este estudio. LJRP contribuyó con el diseño del estudio, el análisis crítico y los datos estadísticos de interpretación. SFA proporciona una infraestructura auxiliar necesaria para llevar a cabo el estudio y contribuyó a la concepción y diseño del proyecto. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
