Resumen Antecedentes
agrandamiento gingival (GO) es una común efecto secundario de la utilización crónica de la ciclosporina (CsA), un inmunosupresor ampliamente utilizado para prevenir el rechazo en pacientes trasplantados. Estudios recientes han informado de niveles elevados de citocinas específicas en el tejido gingival crecimiento excesivo, particularmente TGF-beta, lo que sugiere que este factor de crecimiento desempeña un papel en la acumulación de materiales de la matriz extracelular. La eficacia de la azitromicina, un antibiótico macrólido, en la regresión de este efecto secundario no deseado también se ha demostrado.
Métodos
En este estudio, hemos creado un modelo experimental para evaluar el efecto terapéutico de roxitromicina en GO y la expresión de factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta2) a través de inmunohistoquímica. Utilizamos cuatro grupos de ratas por un total de 32 individuos. GO fue inducida durante cinco semanas y el tratamiento fármaco se administró en la 6ª semana de la siguiente manera: Grupo 1 recibió solución salina; el grupo 2 recibió CsA y se trató con solución salina en la 6ª semana; el grupo 3 recibió CsA y, en la 6ª semana, ampicilina; y el grupo 4 recibió CsA durante 5 semanas y, en la 6ª semana, se trató con roxitromicina.
Resultados
Los resultados demostraron que el tratamiento con roxitromicina fue eficaz en la reducción de IR inducida por ciclosporina en ratas. Tanto epitelial y del tejido conectivo mostraron una disminución en el espesor y una reducción significativa en la expresión de TGF-beta2, con un menor número de fibroblastos, la reducción en zonas fibróticas y disminución de infiltrado inflamatorio.
Conclusión
Los datos actuales sugieren que la baja regulación de la expresión de TGF-beta 2 puede ser un importante mecanismo de acción por el cual roxitromicina inhibe GO
material complementario Electrónico
La versión en línea de este artículo (doi:.. 10 1186 /1472-6831-9 -33) contiene material complementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Antecedentes
agrandamiento gingival (GO) es un efecto secundario común de ciertos medicamentos, como la fenitoína, bloqueadores de los canales de calcio y ciclosporina [1, 2].
ciclosporina (CsA) ha sido ampliamente usado para prevenir el rechazo de trasplantes de órganos y para tratar diversas immunodiseases [2]. Se suprime selectivamente la función de las células T helper y modula la red de citoquinas inflamatorias. Sin embargo, CsA se asocia con varios efectos adversos, tales como la nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, hirsutismo y el crecimiento excesivo gingival (GO) [1, 3, 4]. La prevalencia media de los pacientes de trasplante de dentado que desarrollan ciclosporina inducida GO es de alrededor de 30%, con una variación entre 10 y 85% [5-9]. Cuando se asocia con otros medicamentos, tales como antihipertensivos bloqueadores de canales de calcio, esta prevalencia aumenta, como lo hace la gravedad de la complicación, y, en consecuencia, el riesgo [10-13].
Fibrosis, uno de los hallazgo más importante en GO , es el resultado de una variedad de señales bioquímicas a partir de muchos tipos de células incluyendo las células inflamatorias y fibroblastos, que estimulan la proliferación de fibroblastos y la producción de matriz extracelular [14]. El factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) es una familia multifuncional de citoquinas presentes en esta vía y hay tres isoformas de mamífero de TGF-beta (TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3), que son estructuralmente similares [15 ]. El aumento de los niveles de TGF-beta1 se han asociado en la fibrosis renal inducida por ciclosporina [16]. La mayoría de los estudios argumentan a favor de TGF-beta1 en el agrandamiento gingival inducida por CsA. Sin embargo, un escaso número de estudios investigaron la expresión de TGF-beta2 en esta condición patológica [15, 17]. TGF-beta2 se considera una citoquina inmunosupresora modulada por ciclosporina que juega un papel central durante la formación de fibrosis y reacción inflamatoria [18-20]. Recientemente, se ha demostrado que roxitromicina tiene un efecto inhibidor sobre la producción de TGF-βbeta por las células mesangiales humanas, y puede ser eficaz en el tratamiento de la glomeruloesclerosis [21]. Por lo tanto, este antibiótico macrólido con características similares de azitromicina, se sabe que tiene efectos antiinflamatorios, inmunomoduladores y del tejido de reparación efectos además de su actividad bacteriostática puede ser una alternativa terapéutica en el tratamiento de la hiperplasia gingival. Recientemente, hemos publicado un estudio con resultados interesantes en trasplantados renales en el que el agrandamiento gingival se redujo después del tratamiento roxitromicina [22]. En el presente estudio se investigó el efecto de roxitromicina en GO en ratas tratadas con ciclosporina. Nuestros hallazgos indican que la roxitromicina reduce ir y regula a la baja la expresión de TGF-beta 2 en los tejidos gingivales.
Métodos
Treinta y dos de 6 semanas de edad ratas Wistar macho (Rattus novergicus albinun
), con un peso de 100 a 150 gramo. fueron seleccionados al azar y se dividieron en partes iguales en cuatro grupos de ocho animales cada uno. Las ratas de control (grupo 1) se inyectaron por vía subcutánea diariamente con solución salina. Las ratas experimentales (grupo 2) fueron tratados con CsA inyectaron por vía subcutánea en una dosis diaria de 10 mg /kg durante seis semanas y, al inicio de la sexta semana, se les inyectó por vía subcutánea con solución salina. Grupo 3 fue similar al grupo 2, pero en la última semana se trató con 50 mg /kg de ampicilina (un antibiótico ampliamente utilizado en las infecciones periodontales) a través de la alimentación gástrica. En el grupo 4, los animales recibieron CsA al día durante 6 semanas y en la última semana se trataron con 40 mg /kg roxitromicina por alimentación gástrica. Las ratas se pesaron semanalmente y la dosis se ajustó en consecuencia. . La dieta y el agua potable se les dio ad libitum
durante el experimento Análisis FODA Macroscopía
Al final del periodo experimental, todos los animales fueron sacrificados mediante una sobredosis de anestesia (Kensol
® - 10 mg /kg y Vetanarcol ® - 90 mg /kg). Para investigar las alteraciones gingivales lo largo del tiempo, los modelos de piedra se hicieron a partir de impresiones de silicona de la región anterior del maxilar. Cuanto mayor sea el ancho buco-lingual y el ancho mesio-distal del segmento anterior del maxilar se midieron utilizando un calibrador digital.
Histopatología e histomorfometría
Todas las muestras gingivales obtenidos se fijaron en formalina al 10% (pH 7) para al menos 24 horas. Después de la fijación, las muestras fueron gradualmente se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (70% a 100%), se aclaró en xileno, empapado y embebidos en parafina, de acuerdo con métodos histológicos de rutina.
Los fragmentos incluidos en parafina se cortaron con un " se obtuvieron 820 "microtomo Spence y 4 micras de grosor. Todas las muestras gingivales se incluyeron en parafina con la misma orientación. Las secciones analizadas siempre mostraron el epitelio, el tejido conectivo y muscular. Las mediciones se realizaron histometría ya que el epitelio hasta que el tejido muscular. Los cortes histológicos se mantuvieron en una incubadora a secar, y luego las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina para el análisis histológico. Histomorfometría se realizó utilizando imágenes capturadas y evaluados por un sistema de captura de imagen por ordenador Axion Visión (Zeiss, Berlín, Alemania). Las imágenes fueron capturadas a partir de cuatro campos microscópicos seleccionados al azar para cada diapositiva histológica, utilizando la cámara digital (400 × y 100 aumentos) de un microscopio Axiostar Plus (Zeiss, Berlín, Alemania) y el número de células TGF-betapositive fueron contados.
Las imágenes se almacenan y se sometieron a un recuento de células inflamatorias y de todas las células similares a fibroblastos. Se hicieron mediciones lineales para obtener el diámetro mayor de tejido epitelial y conjuntivo gingival, utilizando el marcado digital.
Inmunohistoquímica
secciones de parafina (4 micras de espesor) de tejido fijado con formalina se obtuvieron a diferentes profundidades de cada bloque de tejido. La presencia de la proteína TGF-beta2 en las muestras gingivales se investigó en secciones de parafina utilizando el procedimiento del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) con un paso adicional para la recuperación de antígenos con una solución de recuperación (Dakopatts, Copenhagen, Dinamarca). En resumen, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-TGF-beta2 diluido 1/20 y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente (Santa Cruz, Santa Cruz, EE.UU.) seguido de un anticuerpo IgG de cabra anti-conejo biotinilado (Dakopatts, Copenhague, Dinamarca). Los controles para el procedimiento de ABC se realizaron mediante la sustitución de anticuerpo anti-TGF-beta2 con suero normal de conejo, o mediante la omisión del anticuerpo anti-TGF-beta2. Las secciones se analizaron a través de microscopía de luz, y fotomicrografías se tomaron con un microscopio Zeiss Axiostar (Zeiss, Alemania). El número de los TGF-beta2 células inmunorreactivas por campo microscópico (400 aumentos) se contó en el tejido conectivo.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como media y desviación estándar. ANOVA se utilizó para la evaluación estadística y se utilizó la prueba post-hoc de Bonferroni después de ANOVA. La anchura mucosa gingival, el número de células inflamatorias, todas las células similares a fibroblastos y las células inmunorreactivas TGF-beta2 se compararon entre grupos mediante el uso de t-test
de Student. El nivel de significancia adoptado fue de p Hotel & lt; 0.05. Francia El manuscrito se ha realizado con la aprobación del comité de ética en la investigación experimental en animales por la Universidad Federal de Juiz de Fora /Brasil (protocolo n ° 039/2005).
: Resultados de la Todas las ratas tratadas con ciclosporina presentado GO que fue evidente en todas las localizaciones gingivales. Gráfico 1 muestra las mediciones macroscópicas de la anchura bucal-lingual y anchura mesio-distal (p & lt; 0,05). El análisis macroscópico reveló una reducción significativa de la anchura bucal-lingual y anchura mesio-distal en las ratas tratadas roxitromicina (grupo 4) en comparación con el grupo 2 y el grupo 3 (gráfico 1) (p & lt; 0,05). El análisis histopatológico reveló que GO fue el resultado de la ampliación de epitelio y tejido conectivo (figuras 1A, 1B, 1C, 1D). A acantosis moderada se observó en los animales de los grupos 2, 3 y 4. No hay diferencias estadísticas fueron observados cuando se compara el espesor del epitelio detectado en muestras gingivales obtenidos a partir de los grupos positivos de control con los grupos tratados. Se observó una hiperplasia grave de las fibras de colágeno en las muestras gingivales obtenidos a partir de los grupos 2 y 3. Sin embargo, el estudio microscópico reveló una reducción de las fibras de colágeno en las muestras gingivales de las ratas tratadas en comparación con las muestras gingivales de las ratas de control. No se observaron áreas fibróticas en muestras gingivales del grupo 1 (grupo de control negativo). Fibrosis extensa es un hallazgo frecuente en muestras gingivales de los grupos 2 y 3, sin embargo se observó un escaso número de áreas de fibrosis en el tejido gingival del tratado roxitromicina ratas (figura 2). Las mediciones del diámetro de los tejidos epiteliales y conectivas se obtuvieron (figura 3). Las mediciones observadas en las ratas tratadas con roxitromicina (grupo 4) fueron estadísticamente inferiores a los observados en los grupos de control positivo GO (Grupo 2 y el Grupo 3). El análisis histomorfométrico demostró también que los animales tratados con roxitromicina presentan un menor número de fibroblastos por campo microscópico (figura 4). La identificación de los fibroblastos, basado en criterios morfológicos, fue realizado por dos investigadores diferentes. Por último, se observó un menor número de células inflamatorias en las muestras gingivales obtenidos de grupo tratado roxitromicina en comparación con el grupo 2 y el grupo 3 (figura 5). se detectó tinción citoplasmática para TGF-beta2 en la mayoría de tipos de células del tejido conectivo. TGF-beta2 se expresó en el tejido conectivo por células inflamatorias, fibroblastos y células endoteliales (Figura 6). La mayoría de los fibroblastos y las células endoteliales se TGF-beta2 positivo y mostraron un patrón de tinción variables, por lo general débilmente o oscuramente positiva (figura 6). El análisis inmunohistoquímico mostró un menor número de células TGF-beta2 positivos (figura 7) - reconocidos morfológicamente como fibroblastos, células endoteliales y células inflamatorias en las muestras de tejido conectivo de roxitromicina ratas tratadas en comparación con GO ratas positivas controles (grupo 2 y grupo 3 ) (figura 7). No se detectaron diferencias significativas en comparación con el número de células positivas TGF-beta2 en muestras gingivales obtenidos de grupo 1 y el grupo 4 (figura 7). Figura 1 mediciones macroscópicas de las regiones maxilares bucal-lingual y mesio-distal. Los resultados se expresaron como media y el nivel de significación estadística para analizar era p & lt; 0.05. G1 (n = 8 animales) - grupo de control negativo - administración de solución salina. G2 (n = 8 animales) - grupo de control positivo - la administración de CsA + solución salina. G3 (n = 8 animales) - Control positivo grupo- - administración de CsA + AMP. G4 (n = 8 animales) - grupo tratado - administración de CsA + ROX
Figura 2 campos microscópicos representativos.. A: el tejido conectivo normal en el grupo 1 (control negativo); B-C: fibrosis extensa en los grupos 2 y 3 (controles positivos); D: Pocas áreas de fibrosis en el grupo 4 (grupo tratado). magnificance original de 400 ×.
Figura 3 Las mediciones de la mucosa gingival (epitelio y la lámina propia). Resultados expresados como media (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animales) - grupo de control negativo - administración de solución salina. G2 (n = 8 animales) - grupo de control positivo - la administración de CsA + solución salina. G3 (n = 8 animales) - Control positivo grupo- - administración de CsA + AMP. grupo tratado - - G4 (n = 8 animales). la administración de CsA + ROX
Figura 4 El número de fibroblastos por campos microscópicos. Cinco campos microscópicos con 400 × magnificación fueron estudiados por cortes histológicos. Resultados expresados como media (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animales) - grupo de control negativo - administración de solución salina. G2 (n = 8 animales) - grupo de control positivo - la administración de CsA + solución salina. G3 (n = 8 animales) - Control positivo grupo- - administración de CsA + AMP. G4 (n = 8 animales) - grupo tratado - administración de CsA + ROX
Figura 5 Número de células inflamatorias por campos microscópicos.. Cinco campos microscópicos con 400 × magnificación fueron estudiados por cortes histológicos. Resultados se expresaron como media ± desviación estándar (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animales) - grupo de control negativo - administración de solución salina. G2 (n = 8 animales) - grupo de control positivo - la administración de CsA + solución salina. G3 (n = 8 animales) - Control positivo grupo- - administración de CsA + AMP. G4 (n = 8 animales) - grupo tratado - administración de CsA + ROX
Figura 6 muestras representativas indicó elevada expresión de TGF-beta 2 en las células del tejido conectivo (grupos 2 y 3); C: Luz TGF-beta 2 de células teñidas en el grupo 4. Las flechas rojas - tinción de las células negativas. Las flechas azules: las células de tinción positiva. magnificance original de 400 ×.
Figura 7 Número de células de tinción positiva de TGF-beta 2 en el tejido conectivo por campo microscópico. Cinco campos microscópicos con 400 × magnificación fueron estudiados por cortes histológicos. Resultados expresados como media media ± desviación estándar (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animales) - grupo de control negativo - administración de solución salina. G2 (n = 8 animales) - grupo de control positivo - la administración de CsA + solución salina. G3 (n = 8 animales) - Control positivo grupo- - administración de CsA + AMP. grupo tratado - - G4 (n = 8 animales). la administración de CsA + ROX
Discusión
ciclosporina (CsA) es un polipéptido cíclico neutral hidrófobo compuesto de once aminoácidos y hecho de que el hongo Tolypocladium inflatuns gams
. Actúa específicamente en la supresión de la respuesta inmune mediada por células T. Pasa a través de biotransformación en el hígado, lo que resulta en 14 productos metabólicos, de los cuales el 90% se excreta en las heces y el 10% se elimina a través de los riñones [23].
Hiperplasia gingival es uno de los efectos secundarios causados por el uso crónico de ciclosporina (CsA), que se emplea para prevenir el rechazo de órganos trasplantados y para el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes, como la diabetes mellitus, la enfermedad de Behcet, psoriasis, esclerosis múltiple, liquen plano erosivo, lupus eritematoso sistémico, penfigoide ampolloso, artritis reumatoide, miastenia gravis , uveítis, y diversas glomerulopatías niveles elevados [3, 24, 25].
varios estudios han demostrado de citocinas específicas en el tejido gingival crecimiento excesivo, especialmente TGF-beta, un mediador inflamatorio multifuncional, lo que sugiere que este factor de crecimiento desempeña un papel en la acumulación de la matriz extracelular [14, 25, 26], incluyendo las proteínas de colágeno [27, 28]. Las isoformas TGF-beta pueden ser expresados por la mayoría de las células, incluyendo las células inflamatorias gingivales, células endoteliales y fibroblastos [17]. Elevada gingival TGF-beta 1 y TGF-beta2 han sido sugeridas por el estudio inmunohistoquímico de la fenitoína y nifedipina inducida por GO [29]. y nuestros datos indican que los niveles de expresión de TGF-beta2 de IR inducida por ciclosporina elevados.
GO El tratamiento incluye la eliminación de la placa bacteriana, mantener una higiene oral adecuada, y también incluye procedimientos invasivos, tales como gingivectomía. El tratamiento de esta complicación, hasta hace poco, era solamente quirúrgica. Hoy en día, se han realizado varios estudios para determinar el efecto del tratamiento antibiótico en la regresión de la hiperplasia gingival. En 1995, Wahlstrom, Zamora y Teichmann utilizan casualmente azitromicina - un antibiótico semisintético derivado de la eritromicina macrólido - para el tratamiento de infecciones respiratorias en dos pacientes con trasplante renal, que tenían ciclosporina inducida GO. Observaron reducción gingival después de usarlo. El tratamiento diario con 500 mg durante cinco días es simple, barato, conservador, de forma rápida eficaz y evita la cirugía gingival. Actúa principalmente contra bacterias gram-positivas y negativas, tiene absorción oral rápida, no altera los niveles séricos de ciclosporina o niveles de creatinina. La azitromicina es bien tolerado y asocia un programa de higiene oral eficiente induce una reducción sobrecrecimiento gingival [28], pero puede producir efectos secundarios, tales como diarrea, dolor abdominal, náuseas y vómitos [28-33].
Recientemente, hemos utilizado roxitromicina en cuatro pacientes trasplantados renales y los resultados sugieren que roxitromicina puede ser una importante herramienta terapéutica utilizada para reducir inducida por ciclosporina GO [22]. Yamabe et al. (2006) sugirió que el uso de roxitromicina tiene un efecto inhibidor sobre la producción de TGF-beta por las células mesangiales humanas, y puede ser eficaz en el tratamiento de la glomerulosclerosis. Los mecanismos que roxitromicina la producción de TGF-beta inhibe no están claras, pero en este estudio el fármaco no inhibió la activación de la tirosina quinasa y MAP quinasa por la trombina. Roxitromicina suprimió la translocación inducida por trombina de la proteína p65 de NF-kB en el núcleo. Se sugiere que la activación de NF-kB regula la producción de TGF-beta, así ROX inhibió la producción de TGF-beta a través de la inhibición de NF-kB.
Conclusión
En el presente estudio, los resultados demostraron que el tratamiento era roxitromicina eficaz para reducir GO inducida por ciclosporina en ratas. Ambos tejidos epiteliales y conectivos mostraron una disminución en el grosor en las ratas tratadas roxitromicina en comparación con los animales de los grupos control. Además, la reducción significativa en la expresión de TGF-beta2 en las ratas tratadas roxitromicina se asoció con un número más bajo de los fibroblastos, con la reducción de las zonas fibróticas y disminución de infiltrado inflamatorio. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la baja regulación de la expresión de TGF-beta 2 puede ser un importante mecanismo de acción por el cual roxitromicina inhibe GO
abreviaciones
AMP:.
Ampicilina
CsA:
ciclosporina
GO:
agrandamiento gingival
MAPA quinase:
proteína quinase actived por mithogen
NF-kB:
factor nuclear kappa B
ROX:
roxitromicina
TGF-beta1:
factor de crecimiento transformante beta 1
TGF-beta 2:
la transformación del factor de crecimiento beta 2
UFJF:
Universidad Federal de Juiz de Fora
Declaraciones
Agradecimientos
apoyo financiero: FAPEMIG - Rede Mineira de Toxicología; Rede Mineira de Bioterismo
los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12903_2008_142_MOESM2_ESM.jpeg autores 12903_2008_142_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original para la figura 2 12903_2008_142_MOESM3_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 3 12903_2008_142_MOESM4_ESM.jpeg autores archivo original para el archivo original de la figura 4 12903_2008_142_MOESM5_ESM.jpeg los autores de la figura 5 'archivo original para la figura 6 12903_2008_142_MOESM7_ESM.jpeg autores 12903_2008_142_MOESM6_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 7 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores SC han participado en la redacción el manuscrito, adquisición y análisis de datos y llevaron a cabo la inmunohistoquímica. MB participado en el diseño del estudio y la coordinación tal como se realizó el análisis estadístico. análisis BV y la interpretación de datos. IM ayudó en la fase experimental, la inducción de hiperplasia gingival. LV lleva a cabo la inmunohistoquímica. FA participó en el diseño del estudio y la coordinación y han dado la aprobación final de la versión para ser publicada. Todos los autores leído y aprobado la versión final del manuscrito.
