histológico
células escamosas Resumen Antecedentes
carcinoma es el tumor maligno más importante de un sitio primario en la vía oral cavidad y, dada la gran exposición de la mucosa y los labios de los factores etiológicos de esta neoplasia, su incidencia es alta. La investigación de los determinantes pronósticos es significativo para las expectativas de propuesta de tratamiento y la cura del paciente. La respuesta inmune local representada por infiltrado inflamatorio peritumoral es un posible factor pronóstico.
Métodos
En este estudio, se analizaron muestras de mucosa oral de células de carcinoma escamoso, separados de acuerdo a su clasificación histológica, así como el perfil fenotípico de la células que comprenden el infiltrado inflamatorio peritumoral fue investigado por el método inmunohistoquímico, en la adicción, se determinó el índice de proliferación celular a través de la expresión de proteínas Ki67.
resultados
los linfocitos T formados por la mayor parte de este infiltrado inflamatorio, y entre estas células, hay un predominio de linfocitos T CD8 con relación a los linfocitos T CD4. Los lymhocytes B fueron el segundo tipo de células de leucocitos más visualizado seguido por los macrófagos y neutrófilos. La evaluación inmunohistoquímica de 67 Ki-células positivas reveló una mayor expresión de esta proteína en las muestras de células escamosas carcinoma indiferenciado.
Conclusión
Los resultados sugieren que la respuesta inmune celular es el principal mecanismo de defensa en células de carcinoma epidermoide de orales mucosa, expresada por el gran número de linfocitos T y macrófagos, y que la mayor intensidad de la respuesta local puede estar asociada con un mejor pronóstico
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Antecedentes
tumores malignos de la boca comprenden un grupo heterogéneo de lesiones que difieren entre sí en cuanto a factores, de riesgo clínico aspectos, y el origen histológico. Entre los diferentes tumores de este grupo, el carcinoma de células escamosas es el tipo histológico más frecuente y representa la mayoría de los casos de cáncer oral se diagnostica [1-4]. A pesar de las campañas de prevención de varios programas de salud gubernamentales y la expansión de la red de profesionales especializados que priorizan el diagnóstico de lesiones premalignas de la boca en los diferentes servicios de atención médica actualmente activos, el 7% de la población mundial se ve afectada por el cáncer oral, y se es, por tanto, un problema de salud en todo el mundo [4].
origina células de carcinoma escamoso en el epitelio que recubre la boca. Este hecho es muy importante cuando se considera la exposición constante de la cavidad oral a los estímulos intrínsecos locales asociados con el aumento del riesgo de este tipo de cáncer. Entre los principales factores de riesgo, el tabaquismo, el consumo de bebida alcohólica crónica, y los traumas mecánicos crónicos - tales como las prótesis dentales mal adaptados y dientes fracturados - destacan. Por otra parte, incluyendo cáncer primario de los labios, sobre todo de la parte inferior, debemos tener en cuenta la continua exposición a la radiación solar como un factor extrínseco significativa, especialmente en individuos leucodérmicas. Además de los factores intrínsecos y extrínsecos locales, la predisposición genética del paciente y la respuesta inmune son factores determinantes en el riesgo de cáncer [2, 4-10].
Además de la intensificación de las actividades de prevención, se han desarrollado varios estudios para establecer los factores determinantes del pronóstico de estas lesiones con el objetivo de minimizar la morbilidad y la mortalidad causadas por la lesión maligna existente. Muchos autores han investigado una posible correlación entre la respuesta del paciente inmune, el comportamiento neoplásico, y el pronóstico [5, 11, 12].
Meneses et al., (1998) demostraron, en muestras de carcinoma de células escamosas orales, una posible asociación entre el tamaño del tumor, el área de la invasión, la angiogénesis y la caracterización fenotípica del infiltrado inflamatorio peritumoral predominantemente compuesta por los linfocitos T y los linfocitos B. Coussens et al., (1999) también encontrado en carcinomas de mucosa oral una asociación entre el predominio de los mastocitos en el infiltrado peritumoral y un mayor desarrollo de la angiogénesis del estroma, que proporcionaría suministro de sangre adecuado para la nutrición neoplásicas, y, en consecuencia, una peor pronóstico.
Junto con la evaluación del infiltrado inflamatorio peritumoral y sus productos, el estudio de la cinética celular tumoral, sus mecanismos de regulación y su interrelación con los factores de crecimiento, oncogenes y anti-oncogenes también ha sido objeto de varias estudios [8, 15 a 19].
Entre los eventos celulares que determinan directamente el progreso clínico del tumor, la proliferación celular es significativa, es decir, trastornos en el número de células resultantes de disfunciones en el ciclo mitótico [20, 21].
la actividad proliferativa de los tejidos o la neoplasia puede ser determinada por su tasa de crecimiento usando anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos expresados por la proliferación de células neoplásicas, lo que permite el análisis simultáneo de la proliferación celular y la histología [13, 22, 23]. La molécula de Ki67 ha sido el marcador antigénico de elección, ya que no sufre mucha influencia de factores internos y externos, y su expresión nuclear durante un período definido de ciclo de la célula representa una ventaja en su uso como un marcador biológico de la actividad mitótica [ ,,,0],24-27].
Recientemente se demostró que la Ki-67 gen sufre "sobre la expresión" en las células epiteliales de las lesiones orales pre-malignas y malignas.
en este estudio el índice de proliferación celular se evaluó por medio de la expresión de la proteína Ki67 y el perfil fenotípico de las células que componen el infiltrado inflamatorio peritumoral en muestras de células de carcinoma escamoso de la mucosa oral. Los resultados demostraron una participación fundamental de la población de los linfocitos T en la composición del infiltrado inflamatorio asociado con la zona neoplásica. Estos resultados también sugieren una correlación entre la intensidad de la reacción inflamatoria peritumoral y la proliferación de células tumorales.
Métodos
muestras de mucosa oral células escamosas carcinoma de pacientes sin tratamiento previo presentados a biopsias incisionales de diagnóstico. muestras en parafina bloqueado (n = 30) se obtuvieron de los archivos de la Anatomía Patológica Laboratorio de la Escuela de Medicina de la Fundación Dom André Arcoverde -. Valença /RJ Empresas El bloques se procesaron histológicamente para obtener rodajas de 4 m de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina rutinaria (HE).
diapositivas fueron evaluados por dos examinadores diferentes, y los tumores se clasifican histológicamente según la Clasificación Internacional de Enfermedades para Oncología (CIE-O /2000). Las muestras se dividieron en los siguientes grupos: Grupo 1
: bien diferenciado las células de carcinoma escamoso de la mucosa oral (n = 10)
Grupo 2: moderadamente diferenciado células escamosas carcinoma de la mucosa oral (n = 10)
grupo 3:. células escamosas carcinoma indiferenciado de la mucosa oral (n = 10): perfil del histomorfometría del infiltrado inflamatorio
con el fin de cuantificar el infiltrado inflamatorio peritumoral, el software Scion Image FotoScan y el software se utilizaron para la captura de la imagen y la morfometría el infiltrado inflamatorio. Todas las muestras fueron capturados en toda su extensión y los campos (aumento original 100 ×) con zonas inflamadas alrededor del tumor se midieron semi-automáticamente, con la selección manual de la región inflamada y análisis calculado de la zona seleccionada.
Base en el análisis de cada muestra, aritmética simple significa que se obtuvieron el área inflamada por campo microscópico y los resultados se expresaron en porcentaje del área peritumoral inflamada por grupo Análisis inmunohistoquímico
Rebanadas con 4 m de espesor dispuestas en portaobjetos silanized (3-aminopropiltrietoxisilano.; Sigma Chemical, Co, EE.UU.), se desparafinaron en una cámara de 60 ° C, y de forma secuencial hidrata en pasos a través de xilol, alcohol absoluto, 70% de alcohol, y agua destilada comentario El método clásico complejo avidina-biotina peroxidasa anti-peroxidasa. se utilizó en el estudio de las muestras. Las muestras fueron sometidas a la recuperación de antígenos con la inmersión de los fragmentos en tampón citrato 0,001 M, pH 6,0, y el bloque de la peroxidasa con el peróxido de hidrógeno al 3% y se incubaron adicionalmente durante 1 hora con los anticuerpos primarios indicados en la Tabla 1. A continuación, se incubaron con secundaria biotinilado anticuerpos durante 30 minutos y sometido a una reacción con el complejo avidina-biotina durante otros 30 minutos. La tinción se realizó mediante la adición del cromógeno diaminobencidina sustrato (DAB) durante aproximadamente 1 minute.Table 1 Anticuerpo Los anticuerpos para el análisis de inmunohistoquímica la marca del hierro
anti CD20
linfocitos B
Dako
anti CD3
linfocitos T
Dako
anti CD8
Los linfocitos T reguladores
Dako
anti CD4
linfocitos T helper
Dako
anti CD15
Los neutrófilos
Dako
anti CD68
Los macrófagos
Dako
anti Ki67
la proliferación celular
Dako
Control negativo de la reacción inmunohistoquímica se realizó mediante la omisión de la incubación con el anticuerpo primario durante unas rodajas. Las rebanadas se analizaron y fotomicrografías se hicieron con el sistema Nikon Microphot (Tokio, Japón).
Recuento de células reactivo para cada anticuerpo se hizo mediante la exploración de toda la muestra, con 400 × magnificación, con un recuento de células positivas en todos los campos. Los resultados se obtuvieron a partir de la media aritmética simple y se expresan en porcentaje de células positivas por campo microscópico se realizó un análisis estadístico
El análisis estadístico utilizando Mann-Whitney con una p & lt.; nivel de 0,05 con el fin de evaluar comparativamente medio de los parámetros analizados en los diferentes grupos del experimento.
Resultados comentario El análisis histopatológico de las rebanadas teñidas con hematoxilina y eosina (HE) y se sometieron a análisis morfométrico reveló que la significa porcentaje de área inflamada peritumoral por campo microscópico era 24,7% en el Grupo 1 (muestras de células escamosas bien diferenciado carcinoma de la mucosa oral) (Figura 1a), 33,2% en el grupo 2 (muestras de células escamosas moderadamente diferenciado carcinoma de la vía oral mucosa) (Figura 1b), y 42,6% en el grupo 3 (muestras de células escamosas carcinoma indiferenciado de la mucosa oral) (Figura 1c). Después de la evaluación estadística, la cantidad de área inflamada peritumoral mostró una diferencia estadísticamente significativa cuando los grupos 1 y 3 se compararon (p & lt; 0,05) (Figura 2). Figura 1 morfológica de clasificación de células escamosas de la mucosa bucal. R: Bien diferenciado carcinoma de células escamosas de la mucosa bucal. mancha N = 10. HE. aumento original × 200. B: carcinoma epidermoide moderadamente diferenciado de la mucosa bucal. mancha N = 10. HE. aumento original × 400. C: carcinoma de células escamosas indiferenciado de la mucosa bucal. mancha N = 10. HE. aumento original × 400.
Figura 2 La intensidad de infiltrado inflamatorio peritumoral. Los valores se expresan en la aritmética simple medios ± SD. No se observó diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos 1 y 3. p ≤ 0,05.
En todas las muestras evaluadas en este estudio, el predominio cuantitativo del infiltrado inflamatorio se asocia directamente con las zonas de mayor invasión a los tejidos subyacentes al parénquima tumoral .
la evaluación fenotípica del infiltrado peritumoral se llevó a cabo por la identificación de la positividad de células inflamatorias, caracterizado por la visualización de la luz de coloración intracelular marrón, contra un fondo contra-teñidas con hematoxilina en cada una de las reacciones de los anticuerpos utilizados.
En todos los grupos, el análisis del análisis inmunohistoquímico mostró la presencia de una reacción inflamatoria constituida predominantemente por células inflamatorias mononucleares. Los linfocitos T componen la mayor parte de este infiltrado inflamatorio, y entre estas células, hubo un predominio de linfocitos T CD8 con relación a los linfocitos T CD4 (Figura 3a). Los linfocitos B fueron el segundo tipo de células de leucocitos más visualizado (Figura 3b), seguido por los macrófagos (Figura 3D) y neutrófilos (Figura 3C). Figura 3 La inmunohistoquímica para la caracterización fenotípica de infiltrado inflamatorio peritumoral. R: Los linfocitos T (células CD3 +). aumento original × 400. B. A: los linfocitos B (CD20 + células). aumento original × 400 C. A: Los neutrófilos (CD15 + células). Aumento original 400 × D. A: Los macrófagos (CD68 + células). Aumento original. 400 ×
No hubo diferencias significativas cuando los tipos de leucocitos de los tres grupos fueron comparados (p & gt; 0,05) (Figura 4). La figura 4 el perfil celular de la infiltrado inflamatorio peritumoral. Los valores se expresan como medias ± SD aritmética simple. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en comparación a los grupos. p ≤ 0,05.
En muestras de pacientes del grupo 1, la evaluación inmunohistoquímica de la proteína Ki-67 reveló células tumorales inmunorreactivas escasa (20% ± 3,2) (Figura 5), mientras que en las muestras de los pacientes del Grupo 2, células con positividad fueron más abundantes (47% ± 6,3). En muestras de Grupo 3 pacientes, las células marcadas positivamente representados 60,3% ± 2,8 de las células tumorales malignas. La comparación entre los porcentajes de células tumorales positivas para Ki-67 expresión por campo microscópico en las muestras de mucosa oral de los tres grupos mostró diferencias estadísticamente significativas (P & lt; 0,05) (Figura 6). Los tumores de Grupo 3 mostraron una mayor expresión de la proteína Ki-67 en comparación con los tumores de los grupos 1 y 2. La figura 5 Inmunohistoquímica que demuestra la expresión de la proteína Ki67 en las células tumorales malignas de las muestras de mucosa oral células escamosas carcinoma. R: El carcinoma bien diferenciado. aumento original × 400. B: El carcinoma moderadamente diferenciado. aumento original × 400. C: carcinoma indiferenciado. aumento original × 400.
Figura 6 Expresión de la proteína Ki 67 por grupo. Los valores se expresan en la aritmética simple medios ± SD. No se observó diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos. p ≤ 0,05.
Discusión
carcinoma de células escamosas es el tipo más frecuente de cáncer de la mucosa oral, y representa el 91% de los casos diagnosticados de tumores malignos de la boca [2, 6-8].
además de la etiología multifactorial que implica factores extrínsecos e intrínsecos, el estado inmune del paciente también se considera para influir en el riesgo de cáncer y determinar varios aspectos de su progresión [4, 9, 10]. En la década de 1980, Scully C. (1983) ya había reconocido la participación de la respuesta inmune en el desarrollo de tumores malignos de la boca, y ha hecho hincapié en que el tratamiento de cáncer en el futuro se basaría en la inmunoterapia través de la inmunomodulación. Estar entre los eventos que directamente determinar la progresión clínica del tumor, los de importancia primordial incluyen trastornos en el número de células resultantes de disfunciones del ciclo mitótico y posibles fallos "en la evasión inmune del huésped de los tumores - evaluado por la intensidad del infiltrado inflamatorio peritumoral, la composición de células inflamatorias, la producción de citoquinas por infiltrarse en las células, y la presencia de la angiogénesis [11, 12, 14, 20, 21].
Según Costa L. et al., (2005) en un estudio clínico retrospectivo con 38 muestras de células escamosas carcinoma oral, la TNM (estadificación del tumor determinado por el tamaño del tumor primario y la presencia de metástasis) de clasificación se correlaciona con las principales características histopatológicas de la clasificación tumoral - grado de queratinización, pleomorfismo nuclear, y la intensidad de la infiltración linfocítica peritumoral, y el enlace entre estos datos es importante para determinar el pronóstico y la elección de tratamiento.
los presentes resultados mostraron una correlación inversa entre el grado de diferenciación del tumor y la tasa de proliferación de células obtenido por la expresión de la proteína Ki67. Resultados similares a los encontrados en este estudio también se sugieren por Costa et al., (2005) en el carcinoma oral, Glen et al., (2006) en las lesiones pancreáticas malignas, decanos y col., (2006) en el cáncer gastro-esofágico y Cai et al., (2006) en el carcinoma de células transicionales de la vejiga. Los tumores no diferenciados mostraron una expresión acentuada de la proteína Ki-67. Aguiar (1996) demostró que el índice mitótico aumenta progresivamente desde mucosa oral peritumoral normal, hacia áreas tumorales, así como en áreas de invasión de tejidos mayor [7]. . Pich et al, (2004) en un estudio retrospectivo con lesiones malignas de la cavidad bucal, de las glándulas salivales, la faringe y la laringe, observó que la actividad proliferativa investigado por diferentes métodos - como la determinación AgNORs Índice y MIB-1 y Ki67 expresión por inmunohistoquímica - es clínicamente relevante y válida para proponer el tratamiento y la definición de pronóstico. En este trabajo, las características histológicas exhibidas por el tumor maligno se asociaron con la agresividad clínica por el análisis de la nota maligno relacionado con posibles determinantes de pronóstico lesión -. Perfil inmunológica local y la proliferación de células malignas
acuerdo con los resultados obtenidos a partir de morfometría del infiltrado peritumoral, el porcentaje medio de área inflamada por campo microscópico fue mayor en los tumores indiferenciados (Grupo 3) en comparación con los promedios de las muestras de tumores moderadamente diferenciados (Grupo 2), seguido por las muestras de tumores bien diferenciados ( Grupo 1). En la evaluación de estos datos, hemos observado que existe una correlación entre el más alto grado de malignidad y la mayor intensidad inflamatoria.
La caracterización de la composición infiltrado peritumoral no reveló una diferencia entre los tipos de leucocitos de los tres grupos, determinados a partir de sus calificaciones, pero, curiosamente, las cantidades de cada tipo de célula eran igualmente proporcional en estos grupos. Observamos que en todas las muestras, el número total de linfocitos T y macrófagos predominó sobre la cuantificación de los plasmocitos, caracterizando reacción local del paciente como una respuesta inmune predominantemente de tipo celular.
Además de la evaluación de la intensidad de infiltrado inflamatorio peritumoral y sus componentes celulares, algunos de los principales determinantes de la agresividad del tumor y posibles predictores de pronóstico son alteraciones en la proliferación celular, es decir, alteraciones en el número de células resultantes de disfunciones ciclo mitótico. Esta actividad proliferativa neoplásica puede ser determinada por la tasa de crecimiento por medio de Ki67 expresión [18-21, 28-31].
La comparación entre los porcentajes de células tumorales positivas para la expresión de Ki-67 por campo microscópico en el muestras de la mucosa bucal de los tres grupos mostraron diferencias estadísticamente significativas. Las muestras de Grupo 3 (indiferenciado de células escamosas carcinoma de la mucosa oral) muestran una mayor expresión de células marcadas positivamente, seguido por las muestras de los pacientes del Grupo 2 (moderadamente diferenciado células escamosas carcinoma de la mucosa oral), y en el Grupo 1 ( bien diferenciado células de carcinoma escamoso de la mucosa oral).
en cuanto a la caracterización de leucocitos, Sica et al., (2006) reportó evidencia asociada al predominio de la población de macrófagos en el infiltrado peritumoral y una mayor promoción de la angiogénesis tumoral, atribuyendo a estas células un rol pro-tumoral y, por consiguiente, un mal pronóstico.
en las muestras estudiadas de carcinoma oral, la evaluación de células inflamatorias peritumoral demostró la importancia de la inmunidad celular en la respuesta antineoplásico local debido a la presencia de una población predominantemente compuesto por linfocitos T y macrófagos, aunque con diferencias relevantes en cuanto a la composición infiltrado de acuerdo con la clasificación histológica.
Recientemente, en muestras de cáncer de mama invasivo, se investigó la posible correlación entre la intensidad del infiltrado inflamatorio peritumoral y el grado de diferenciación del tumor [32]. Se señala que cuando analizamos los pacientes con tumores malignos del mismo grado, los que evolucionó satisfactoriamente mostraron una respuesta inflamatoria peritumoral más intenso, mientras que los que experimentó recaídas tumorales y la diseminación metastásica desarrolló una respuesta inflamatoria peritumoral menos intenso.
Conclusión
En este estudio, el paralelo entre la intensidad de la inflamación y el pronóstico del paciente aún no se ha aclarado por completo, y se necesita más investigación. La distribución de las muestras de carcinoma de la mucosa oral en grupos se realizó según el grado histológico. Los resultados sugieren una correlación positiva entre la intensidad de la respuesta inflamatoria y el grado de diferenciación del tumor. Por lo tanto, los tumores no diferenciados presentan un mayor desarrollo del proceso inflamatorio peritumoral en comparación con moderadamente diferenciados y los tumores bien diferenciados. Sin embargo, con el fin de definir esta variable de la intensidad de la respuesta inflamatoria como factor pronóstico en el cáncer oral, otros estudios deben llevarse a cabo de manera que la intensidad de la respuesta local y la proliferación de células malignas en tumores de la misma clasificación histopatológica asociada a los pacientes ' progreso clínico puede ser evaluada.
Finalmente, los resultados presentados en este estudio sugieren que la respuesta inmune celular es el mecanismo de defensa principal en el carcinoma de células escamosas de la mucosa oral, expresada por el gran número de linfocitos T y macrófagos.
Nos subrayar además que Ki-67 expresión está relacionada con el índice mitótico y, consecuentemente, a la proliferación celular maligna y la clasificación de la neoplasia.
Agradecimientos
Rede Mineira de bioterismo. 2824/05 - FAPEMIG; Rede Mineira "TOXIFAR". 2827/05 - FAPEMIG; CNPQ
Declaraciones
los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los archivos de autor original presentado para las imágenes. 'archivo original para la figura 1 12903_2008_100_MOESM2_ESM.pdf autores 12903_2008_100_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original de la figura 2 12903_2008_100_MOESM3_ESM.pdf autores archivo original de la figura 3 12903_2008_100_MOESM4_ESM.pdf autores archivo original de la figura 4 12903_2008_100_MOESM5_ESM.pdf archivo original de los autores de la figura 5 12903_2008_100_MOESM6_ESM.pdf autores archivo original para la figura 6 Conflicto de intereses México la autores declaran que no tienen intereses en competencia.
autores de las contribuciones
FLDV y BJV participaron en el diseño del estudio, el estudio inmunohistoquímico y el estudio histopatológico . FMA y MAMG participado en el diseño y la coordinación.
